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當期目錄

    2014年 第47卷 第1期 刊出日期:2014-01-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    轉基因水稻基因飄流研究十年回顧
    賈士榮1, 袁潛華2, 王豐3, 姚克敏4, 裴新梧1, 胡凝4, 王志興1, 王旭靜1, 柳武革3, 錢前5
    中國農業科學. 2014, 47(1):  1-10.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.001
    摘要 ( 496 )   HTML ( 32 )   PDF (745KB) ( 1155 )   收藏
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    中國是世界最大的水稻生產國和亞洲栽培稻的起源中心之一。隨著中國轉基因水稻研發的快速發展,需要研究水稻轉基因飄流可能對環境和食品安全帶來的潛在風險。基因飄流及其數據是對轉基因水稻進行科學評估和監管的重要參數。為此,從2002年開始組建了研究團隊,對轉基因水稻的基因飄流進行了為期10年的系統研究。取得的結果主要包括:(1)闡明了水稻基因飄流的基本規律,揭示了影響水稻基因飄流的生物學和氣象學主控因子。沿水稻開花期的主流風向,采用長方形田間試驗設計,分別在三亞、廣州和杭州3個點2-3個生長季,研究了純合轉bar基因花粉供體L201或B2 (姐妹系,抗除草劑Basta)向19個非轉基因受體(包括不育系、常規稻品種、雜交稻F1和普通野生稻)在不同距離上的基因飄流率,明確了轉基因向不育系的飄流率最高,向普通栽培稻品種的基因飄流率最低(相鄰種植時小于1%或0.1%),向普通野生稻的基因飄流率介于不育系和常規稻之間,向不育系的最大基因飄流率比向普通野生稻和栽培稻要大1-3個數量級;基因飄流率隨距離增加呈負指數曲線衰減,且存在急劇降低的“拐點”,“拐點”的距離與試驗點水稻開花期的風速密切相關,廣州和杭州為1-2 m,三亞約為5 m;采用圓形、以花粉供體為中心的田間試驗設計,以異交結實率很高的不育系博A作受體,清晰地解析了風向與基因飄流率的數值關系,主流和次主流風向下游4個扇區的基因飄流事件累計達90%-96%,而逆風向和側逆風向4個扇區僅為4%-10%。綜上所述,水稻轉基因飄流率與常規育成品種間的異交率(一般在1%以下)基本相同,在數量級上轉基因并未增加新的風險。(2)建立了以氣象資料為參數的水稻花粉擴散和基因飄流普適模型,計算和預測了中國南方稻區17省、市的最大基因飄流閾值距離(maximum threshold distances, MTDs)。受東南季風和地形地貌的影響,中國南方稻區MTDs的空間分布特征為:東西之間有自東向西逐漸減小的趨勢,南北之間首先在南方丘陵地區逐漸減小、越過南嶺后再向東南沿海地區逐漸增大。(3)利用人工構建的普通野生稻與基因(Bt或bar)飄流后代栽/野F1雜種混栽群體,經多年多代跟蹤觀察,分析了轉基因飄流至普通野生稻后的命運,發現栽/野F1雜種在3-5年后完全消失,混栽群體中檢測不到外源的Bt和bar,有理由推測普通野生稻具有自我保護的機制。(4)研究了小規模田間試驗中采用花期隔離和布帳隔離措施降低水稻基因飄流率的效果;調查了海南、廣東、廣西普通野生稻原生境居群與相鄰種植的栽培稻花期相遇情況,建立了相應的數據庫;研究了基因拆分技術作為生物學限控措施從根本上限控基因飄流的效果;以本研究的結果及對國際上主要農作物基因飄流的調研數據為基礎,提出了在水稻基因飄流風險評估和監管中采用分類管理和閾值管理的原則。在10年回顧和科學分析的基礎上,對未來研究的重點也進行了展望。
    利用產量功能基因標記分析三系雜交水稻親本的遺傳多樣性
    張濤1, 3, 楊蛟2, 蔣開鋒1, 3, 曹應江1, 楊莉1, 3, 楊乾華1, 萬先齊1, 游書梅1, 羅婧1, 高磊1, 李昭祥1, 鄭家奎1, 2, 3
    中國農業科學. 2014, 47(1):  11-23.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.002
    摘要 ( 311 )   HTML ( 1 )   PDF (874KB) ( 1020 )   收藏
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    【目的】利用功能基因標記分析三系雜交稻親本的遺傳多樣性。【方法】利用44個根據文獻共同報道的QTL位點或者已經被精細定位或已克隆的與水稻產量性狀基因緊密連鎖的功能基因標記,以及29個覆蓋水稻12條染色體的在三系雜交水稻親本間多態性高、帶型清晰、重復性好的SSR標記分析76個三系雜交水稻親本的遺傳多樣性。按POPGEN32分析軟件要求將PCR擴增產物的凝膠電泳結果數字化,將數字化的矩陣數據轉換為基因型數據,在POPGEN32軟件下計算等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、多態性位點百分率(P)、Nei’s遺傳多樣性指數(He),用于評價所有親本材料的基因多樣性;計算遺傳分化系數(Fst)、Nei遺傳距離(D),進行遺傳結構和遺傳關系檢測。利用NTSYS-pc2.10e軟件計算品種間遺傳相似系數(GS),并根據GS按非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析,繪制品種間遺傳聚類樹狀圖。【結果】44個功能基因標記中有37個標記具有多態性,多態性位點百分率(P)84.09%,共檢測到86個等位基因位點,平均每個位點2.32個,變化范圍2—4個;其中有效等位基因(Ne)62.95個,占73.2%,Nei’s遺傳多樣性指數(He)變幅為0.049—0.831,平均值0.585。76份材料間的遺傳相似系數(GS)變幅為0.323—0.973,平均值0.650。聚類分析表明在遺傳相似系數0.618處分為保持系和恢復系兩類。保持系和恢復系間的遺傳分化系數(Fst)為0.151,屬高度遺傳分化,Nei遺傳距離(GD)0.185,類群內遺傳距離相對較小,類群間遺傳距離相對較大。29個SSR標記共檢測到72個等位基因位點,平均每個位點2.48個,變化范圍2—4個;聚類分析表明未能將保持系和恢復系分為兩類,部分保持系聚類在了恢復系群,部分恢復系聚類在了保持系群。【結論】相對于普通分子標記,功能基因標記具有較高的DNA多態性檢測效率,用于類群劃分和種質資源的多樣性分析等方面更具準確性和可靠性;三系雜交稻親本在44個產量功能基因位點的親緣關系較近,遺傳基礎狹窄,同源性較高。但保持系群和恢復群系間在這些功能基因位點的遺傳差異較大,遺傳分化程度較高,雜交水稻骨干親本在產量性狀上仍具有較高的雜種優勢利用空間。
    利用甘藍型油菜高密度SNP遺傳圖譜定位油酸、 亞麻酸及芥酸含量QTL位點
    劉列釗, 李加納
    中國農業科學. 2014, 47(1):  24-32.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.003
    摘要 ( 454 )   HTML ( 4 )   PDF (1058KB) ( 1011 )   收藏
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    【目的】菜籽油包括多種脂肪酸組分,提高油酸(C18:1)含量,降低亞麻酸(C18:2)和芥酸(C22:1)含量是油菜育種改良和遺傳研究的重要目標。本研究利用剛開發的油菜60K芯片構建的高世代重組自交系群體遺傳連鎖圖譜,對3個不同環境中影響甘藍型油菜品質的油酸、亞麻酸及芥酸含量進行QTL定位分析,研究結果可對脂肪酸組分QTL位點在不同的群體之間準確比較分析。【方法】以高芥酸親本GH06為母本和低芥酸親本P174為父本構建高世代重組自交系,分別于2008年在德國吉森、德國霍亨里特及2009年德國吉森3個不同的環境中設置田間試驗,收獲自交種子,采用近紅外分析方法3次重復對種子的脂肪酸組分進行分析。利用油菜60K芯片對重組自交系群體進行基因型分析,DNA樣品預處理及芯片處理嚴格按照Illumina Inc公司Infinium HD Assay Ultra操作說明進行。取最小閾值LOD 5.0利用MSTmap軟件構建遺傳圖譜。QTL定位所用的遺傳圖譜包括2 756個SNP位點,覆蓋甘藍型油菜基因組1 832.4 cM。利用Windows QTL Cartographer復合區間作圖法對油酸、亞麻酸及芥酸含量進行QTL定位。【結果】在3個環境中,油酸和芥酸含量均表現為極顯著負相關,相關系數均達到-0.95,且表現為主基因控制的性狀,芥酸和亞麻酸表現負相關,油酸與亞麻酸表現正相關。3個性狀在3個環境中共檢測到14個QTL,在A08和C03上都檢測到油酸和芥酸含量重疊的主效QTL位點。在3個環境中,油酸主效QTL位點解釋表型變異19%—31%,芥酸主效QTL位點解釋表型變異19%—34%,兩者表現加性效應相反。A08和C03染色體上的芥酸主效QTL位點加性效應在3個環境中為7.6到9.6,加性效應來自低油酸、高芥酸親本GH06。亞麻酸屬于典型的數量性狀,受環境影響較大,在3個環境中檢測到不同的微效QTL位點,解釋表型變異3%—12%。遺傳圖譜與物理圖譜比較分析發現,脂肪酸去飽和酶FAD2基因位于亞麻酸QTL qA05C18:3的置信區間,而脂肪酸延長酶FAE1基因位于芥酸QTL qA08C22:1的置信區間。【結論】利用該套油菜60K芯片準確定位了油酸、亞麻酸及芥酸QTL位點,位于A08和C03染色體上的芥酸主效QTL位點同時也是油酸的主效QTL位點,該研究結果有利于不同群體在使用該套SNP芯片分析及對脂肪酸組分定位后準確比較分析。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    玉米不同基因型雙列雜交后代抽絲后氮素代謝特性
    劉春曉1, 趙海軍1, 董樹亭2, 王慶成1, 李宗新1, 劉開昌1
    中國農業科學. 2014, 47(1):  33-42.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.004
    摘要 ( 282 )   HTML ( 2 )   PDF (439KB) ( 656 )   收藏
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    【目的】闡明保綠型玉米和非保綠型玉米雙列雜交后代抽絲后氮素代謝特征。【方法】選育氮高效品種是實現玉米高產高效生產的根本途徑。為明確不同基因型玉米雙列雜交后代的氮代謝和利用特征,篩選出保綠型玉米氮高效品種,采用大田試驗的方法,選擇保綠型(SG, stay-green)玉米自交系Q319、CZ01、VA91和非保綠型(NSG, non-stay-green)玉米自交系BM、B73、MO17,以此組配6×6完全雙列雜交,以雙列雜交后代為材料,系統研究不同玉米品種主要生育時期葉片、莖鞘、籽粒氮含量和粗蛋白質含量的變化,抽絲前后氮素積累、分配和氮收獲指數,葉片氮代謝關鍵酶硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性等的影響,并對葉片氮代謝酶活性與保綠性的相關性進行了分析。【結果】不同基因型雙列雜交后代抽絲后葉片氮含量呈倒“V”型變化特性,高峰期在灌漿期前后。莖鞘和籽粒氮含量均隨生育期推進呈逐漸降低的變化趨勢。保綠型(SG)玉米葉片、莖鞘、籽粒氮含量均顯著高于非保綠型(NSG)玉米。抽絲前保綠型玉米自交后代氮積累、抽絲后氮積累、氮積累總量分別比NSG高20.00%、82.30%和45.23%;其轉移量、轉移率和氮素收獲指數則分別比NSG低51.28%、66.59%和14.32%,抽絲后保綠型玉米的氮積累量約占50%,而非保綠型玉米僅為40%左右。保綠型玉米自交后代葉片和莖鞘粗蛋白質含量分別比非保綠型高108.23%和33.63%。抽絲至成熟期葉片硝酸還原酶活性的變化呈單峰曲線,高峰期在灌漿期前后,不同基因型玉米間變化趨勢一致。抽絲后葉片GS活性、GOGAT活性和可溶性蛋白含量變化均呈單峰曲線,高峰期在抽絲后15 d左右。保綠型玉米NR活性、GS活性、GOGAT活性和可溶性蛋白含量在各時期均高于非保綠型。相關分析表明,葉片保綠度與葉片氮含量、可溶性蛋白含量、GOGAT活性呈極顯著的正相關,與GS活性呈顯著正相關,與NR呈正相關,但不顯著。葉片氮含量與可溶性蛋白、GOGAT活性、GS活性呈極顯著的正相關。氮素的同化與相關的酶活性關系極為密切。【結論】較高的氮代謝水平是葉片保綠的營養生理基礎之一,保綠型玉米有較高的氮代謝酶活性,在后期有較強的氮素吸收和同化能力,保綠性可作為篩選氮高效玉米品種的一個重要農藝性狀。
    施鉀時期對甘薯濟徐23塊根淀粉積累 與品質的影響及酶學生理機制
    柳洪鵑1, 姚海蘭1, 史春余1, 張立明2
    中國農業科學. 2014, 47(1):  43-52.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.005
    摘要 ( 286 )   HTML ( 6 )   PDF (376KB) ( 582 )   收藏
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    【目的】闡明施鉀時期對甘薯“濟徐23”塊根淀粉積累和粒度分布特征的影響及其酶學生理機制。【方法】在大田栽培條件下,以淀粉型品種“濟徐23”為材料,設置不施鉀肥(T1)、基施鉀肥(T2)、封壟期追施鉀肥(T3)和莖葉生長高峰期追施鉀肥(T4)4個處理,于2008—2009年2個生長季在山東農業大學農學試驗站進行試驗。采用甘薯塊根膨大過程中定期取樣的方法留樣,測定塊根中淀粉、直鏈和支鏈淀粉含量,同時測定塊根淀粉粒體積分布的中位粒徑和大(>19.76 μm)、中(3.359-19.76 μm)、小(<3.359 μm)型淀粉粒所占的體積百分比以及淀粉合成相關酶(SS、ADPGPPase、UDPGPPase、GBSS和SSS)活性,分析不同時期施用鉀肥對甘薯各生育時期塊根內淀粉及組分含量、淀粉粒度分布特征及淀粉合成相關酶活性的影響。【結果】與對照(T1)相比,施用鉀肥提高了塊根干物質積累量和淀粉產量,3個施鉀處理淀粉產量的增幅分別為24.90%、16.57%和9.24%,隨施用時間的推遲淀粉產量增幅降低。封壟期和莖葉生長高峰期追施鉀肥顯著降低直鏈淀粉含量而提高支鏈淀粉含量。基施鉀肥提高了大型淀粉粒的體積百分比,莖葉生長高峰期追施則提高中、小型淀粉粒的體積百分比,增幅均達到顯著水平。不同時期施鉀均可提高塊根中SS、ADPGPPase和UDPGPPase的活性,提高淀粉合成前體物質的供應能力,施用鉀肥對SS和ADPGPPase活性的作用時間最長為130 d,基施鉀肥主要作用時期為塊根膨大的前、中期,追施鉀肥的主要作用時期為塊根膨大的中、后期,施鉀越早對UDPGPPase活性的作用時間越長;追施鉀肥提高了塊根膨大后期SSS活性、而降低了塊根膨大后期GBSS活性。總淀粉含量與SS和ADPGPPase活性呈極顯著正相關,直鏈淀粉含量與GBSS和SS活性呈極顯著正相關,支鏈淀粉含量與ADPGPPase和SSS活性呈顯著正相關關系。【結論】基施或封壟期追施鉀肥顯著提高塊根干物質積累量和淀粉產量,追施鉀肥顯著提高支鏈淀粉含量、降低直鏈淀粉含量,基施鉀肥處理的大型淀粉粒體積百分數高,高峰期施用鉀肥處理的中、小型淀粉粒體積百分數高。施鉀時期顯著影響直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量和淀粉產量,這與塊根中SS、ADPGPPase、UDPGPPase、GBSS和SSS活性的變化密切相關。
    植物保護
    草莓根頸腐爛病的病原鑒定
    韓永超, 向發云, 曾祥國, 張鵬, 顧玉成
    中國農業科學. 2014, 47(1):  53-60.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.006
    摘要 ( 371 )   HTML ( 4 )   PDF (2660KB) ( 826 )   收藏
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    【目的】明確草莓根頸腐爛病的病原,為草莓根頸腐爛病的防治及抗病育種提供依據。【方法】對取自湖北省武漢市的發病草莓植株分別進行發病組織培養、分離純化。采用牙簽根頸接種方法進行致病性測定;觀察病原微生物在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)上的菌落形態;從所分離到的菌株中選擇PDA培養基平板上形態不同的Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5進行后續試驗和分析。測定各菌株在18℃黑暗條件下的菌絲生長速度,然后用方差分析程序(ANOVA)對不同菌株間的差異顯著性進行分析;采用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡對病原菌在草莓葉柄上產生的分生孢子形態進行分析。分別以Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5的基因組DNA為模板對這3個菌株的部分肌動蛋白基因(Actin,ACT)、β-維管蛋白基因(β-Tubulin 2,TUB2)和鈣調蛋白基因(Calmodulin, CAL)進行PCR擴增,并將PCR產物測序。將Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5與膠孢炭疽復合種內全部23個種的代表性菌株一起進行系統進化分析。采用Mega4.1軟件和鄰接法進行基于病原菌ACT、TUB2和CAL序列的多基因位點系統進化分析。【結果】從武漢市郊發病草莓植株上共分離純化到15個菌株,不同菌株在PDA培養基平板上的正面形態沒有顯著差異,但是背面形態卻明顯不同,根據各菌株的PDA平板背面形態將15個菌株分成3組,分別從每組中選擇Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5進行后續形態學鑒定和系統進化分析。3個菌株在采用牙簽接種法接種草莓根頸時均能使草莓植株發病;使用這3個菌株接種草莓葉柄時均能在病斑處產生分生孢子,但分生孢子形態沒有顯著差異;20個分生孢子的平均大小為11 μm×3.8 μm;3個菌株在18℃黑暗條件下的菌絲生長速度分別為0.82、0.68和0.88 cm?d-1;這些生物學特征表明這些菌株屬于膠孢炭疽復合種。通過基于ACT、TUB2和CAL的多基因系統進化分析結果表明菌株Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5與已鑒定為Colletotrichum siamense的菌株ICMP12567、ICMP17795、ICMP18121、CBS113199和CBS112983歸在1個分支,其自展支持率為84%,能夠與膠孢炭疽復合種內的其他物種區分開。【結論】通過對草莓根頸腐爛病菌的生物學特性、柯赫氏法則證病過程及基于ACT、TUB2和CAL的多基因系統進化分析,明確了引起武漢地區草莓根頸腐爛病的病原為膠孢炭疽菌復合種內的C. siamense。
    恒溫和波動溫度下西花薊馬的實驗種群生命表
    王海鴻1, 薛瑤2, 雷仲仁1
    中國農業科學. 2014, 47(1):  61-68.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.007
    摘要 ( 314 )   HTML ( 3 )   PDF (480KB) ( 551 )   收藏
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    【目的】對西花薊馬(Frankliniella occidentalis)實驗種群生命表的研究大多在恒溫條件下進行,研究結果可用于田間自然條件下種群發生的預測。然而,西花薊馬在自然界中接觸的不是恒溫,而是晝夜波動的溫度。論文旨在比較恒溫和晝夜波動溫度下西花薊馬實驗種群的生命表參數,探討用恒溫構建的西花薊馬生命表結果來預測自然條件下薊馬種群發生動態的準確性。【方法】分別在恒溫(26℃)和均溫相同的晝夜波動溫度(20—32℃)條件下,構建西花薊馬實驗種群在菜豆豆莢上的年齡-階段特異生命表,比較2種溫度條件下西花薊馬的生活史和種群參數。因為卵的孵化率隨著成蟲年齡變化,所以根據孵化卵的數量來計算年齡-特異繁殖率,以準確揭示西花薊馬的生物學特性。用bootstrap方法來計算種群生長參數的平均數和標準誤;用U檢驗(Mann-Whitney test)(Sigmaplot 12.0)估計恒溫和波動溫度下西花薊馬種群參數、發育歷期和繁殖力間的差異。【結果】恒溫和波動溫度對西花薊馬的成蟲前期發育歷期、總產卵前期、成蟲前期存活率以及生命表參數等有明顯影響(P<0.05),而對成蟲壽命和繁殖力等影響不顯著。西花薊馬成蟲前期發育歷期在恒溫(11.86 d)下顯著長于在波動溫度(11.36 d)下。總產卵前期在恒溫與波動溫度下分別為12.50和11.37 d,達到顯著差異水平。成蟲前期在恒溫下存活率(0.48)顯著高于波動溫度下存活率(0.44)。西花薊馬成蟲壽命在恒溫(雌蟲13.56 d,雄蟲10.15 d)和波動溫度(雌蟲11.37 d,雄蟲9.71 d)下無顯著差異。西花薊馬繁殖力在恒溫(35.38卵/雌)和波動溫度(34.74卵/雌)下無顯著差異。內稟增長率(r)、周限增長率(λ)和凈增殖率(R0)在恒溫下分別為0.121/d、1.129/d和7.538,在波動溫度下分別為0.127/d、1.135/d和8.831。西花薊馬在波動溫度下的種群增長要比在恒溫下快。【結論】與自然的晝夜波動溫度條件相比,恒溫可能過高或過低的估計了許多生命表參數,從而影響種群動態監測結果及其在害蟲綜合治理中的應用。
    噴霧方式對農藥霧滴在水稻群體內沉積分布的影響
    徐德進, 顧中言, 徐廣春, 許小龍
    中國農業科學. 2014, 47(1):  69-79.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.008
    摘要 ( 248 )   HTML ( 1 )   PDF (1134KB) ( 539 )   收藏
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    【目的】分析噴霧方式對農藥霧滴在水稻群體內沉積分布的影響,研究提出稻田合理的噴霧方式,提高稻田農藥利用率。【方法】在水稻分蘗期、孕穗期和揚花期,用配有空心圓錐霧噴頭的手動噴霧器葉面噴灑和配有氣力式彌霧噴頭的彌霧機下傾45°角噴灑指示劑麗春紅-G溶液,收集并測定沉積在植株上層、中層和下層不同點位載玻片上的霧滴指示劑麗春紅-G沉積量。【結果】以不同噴霧方式施藥,水稻葉片正面、背面及垂直方向不同點位的麗春紅-G沉積量有顯著差異。在水稻分蘗期、孕穗期、揚花期用手動噴霧器葉面噴霧和彌霧機45°角下傾噴霧,麗春紅-G的沉積量在水稻群體空間內的分布趨勢均表現為上層>中層>下層。在水稻分蘗期用手動噴霧器葉面噴霧,13.3%玻片上麗春紅-G的沉積量接近于平均數;52.9%玻片上麗春紅-G沉積量低于平均數;33.75%玻片上麗春紅-G的沉積量高于平均數。在水稻分蘗期用彌霧機45°角下傾噴霧,20.4%玻片上麗春紅-G的沉積量接近于平均數;45.4%玻片上麗春紅-G沉積量低于平均數;34.2%玻片上麗春紅-G沉積量高于平均數。在水稻孕穗期和揚花期用手動噴霧器葉面噴霧,分別有33.3%和28.1%的玻片上沒有麗春紅-G的沉積;而用彌霧機45°角下傾噴霧,沒有麗春紅-G沉積的玻片比例分別為13.9%和5.0%。在水稻孕穗期用手動噴霧器和彌霧機噴霧,分別只有6.4%和11.7%玻片上的沉積量接近于平均值,而在揚花期時該比例分別為7.2%和17.2%。在水稻分蘗期、孕穗期和揚花期用手動噴霧器葉面噴霧,噴霧霧滴主要沉積在表示葉片正面的載玻片上,其沉積量占總沉積量的66.3%、85.1%和84.9%,其中在植株上層表示葉片正面載玻片上的沉積量占總沉積量的38.7%、42.2%和45.6%,在表示葉片背面和垂直面玻片上的沉積量很少。彌霧機下傾45°角噴霧,在表示葉片背面和垂直面玻片上的沉積量多于手動噴霧器葉面噴霧,但在表示葉片正面玻片上的沉積量仍占總沉積量的50.5%、50.6%和53.1%,其中植株上層表示葉片正面玻片上的沉積量占總沉積量的32.9%、27.9%和31.5%。【結論】如果以單位面積載玻片上的平均沉積量作為防治病蟲害的有效劑量,那么在水稻群體內同時存在劑量浪費與劑量不足的現象。手動噴霧器壓頂噴霧,噴霧霧滴主要沉積在植株上層葉片正面,沉積量占到總沉積量的1/3以上,而在葉片背面和莖稈上的沉積量很少,尤其是在植株基部葉片和莖稈上,沉積量趨向于零。采用彌霧機下傾45°角噴霧,噴霧霧滴在植株上層葉片正面的沉積量仍超過總沉積量的1/4,但在施藥量低于手動噴霧器壓頂噴霧條件下,各層葉片背面和莖稈上的沉積量都顯著高于手動噴霧器葉面噴霧,說明彌霧機下傾45°噴灑,農藥霧滴能夠進入植株中下層,在葉片背面及莖稈上沉積。
    肺炎克雷伯氏菌S001草甘膦靶標酶基因的克隆及其抗性驗證
    張純1, 吳丹丹1, 2, 馮莉1, 田興山1, 郭愛玲2
    中國農業科學. 2014, 47(1):  80-89.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.009
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    【目的】由于草甘膦在農業生產中的廣泛使用,抗草甘膦轉基因作物的研究一直是轉基因作物研究的熱點,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心問題。自然界中微生物種類繁多,基因資源豐富,論文擬從廣東地區農田土壤中篩選和鑒定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶標酶基因并進行抗性水平驗證,以期獲得高抗草甘膦新基因資源用于抗草甘膦轉基因作物的研究。【方法】用含有濃度梯度草甘膦的選擇培養基從備選土壤中篩選出具有高抗草甘膦特性的菌株;通過顯微觀察、革蘭氏染色以及16S rDNA序列分析結果對菌株種類進行鑒定;利用RT-PCR技術克隆該菌株的草甘膦靶標酶基因aroAS001,并通過序列比對和系統發育樹分析aroAS001序列的基本特征;利用重疊 PCR法對aroAS001變異位點進行定點突變獲得aroAS001-mut序列后,將aroAS001和aroAS001-mut基因片段轉入aroA基因缺陷型菌株DH5α/△aroA中進行基因功能互補和草甘膦抗性水平驗證。【結果】分離出一株高抗草甘膦菌株,經形態學和分子生物學鑒定該菌株為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),命名為kpS001;克隆該菌株草甘膦靶標酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因aroAS001,序列分析結果顯示由該基因所編碼的氨基酸序列具有典型的Class I EPSPS特征,但與已報道肺炎克雷伯氏菌的aroA相比其第227位堿基發生突變,致使對應的氨基酸發生變異。對該基因差異位點進行核酸定點突變獲得aroAS001-mut基因片段后,將aroAS001和aroAS001-mut基因片段分別轉入缺陷型大腸桿菌菌株DH5α/△aroA進行功能互補驗證,與對照菌株相比,轉入aroAS001和aroAS001-mut的重組菌株均能在含200 mmol?L-1以下濃度草甘膦的培養基中能夠正常生長,表現出良好的抗性,之后隨著草甘膦濃度增加其生長狀態開始受到抑制,當草甘膦濃度達到350 mmol?L-1時,菌株生長基本完全被抑制。【結論】肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株是一株高抗草甘膦菌株,由aroAS001編碼的草甘膦靶標酶EPSPS屬于Class I EPSP合成酶,aroAS001對草甘膦具有優良抗性,能在含350 mmol?L-1以下濃度草甘膦的培養基中生長,該基因可以作為備選基因資源用于抗草甘膦轉基因作物的研究。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    水稻-大麥長期輪作體系鉀肥效率及土壤鉀素平衡
    唐旭, 計小江, 李超英, 吳春艷, 楊生茂, 劉玉學, 呂豪豪, 陳義
    中國農業科學. 2014, 47(1):  90-99.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.010
    摘要 ( 297 )   HTML ( 1 )   PDF (437KB) ( 711 )   收藏
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    【目的】研究水旱輪作系統中土壤自然供鉀力、鉀肥利用率和土壤鉀素表觀平衡,為農田鉀素的可持續性管理提供理論依據。【方法】設置不施肥(CK)、施氮磷肥(NP)和施氮磷鉀肥(NPK)3個處理,利用20年稻麥水旱輪作定位試驗數據,研究大麥和水稻地上部生物量、產量及籽粒和秸稈中含鉀量對不同施肥處理的響應。【結果】在一年兩熟和三熟制稻麥輪作系統中,20年不施肥(CK)的作物平均每年可生產籽粒8.24和9.22 t•hm-2,其相當于相應輪作體系平衡施肥(NPK)的75.6%和71.9%,因此施肥對作物產量提高的貢獻率分別為24.4%和28.1%,施鉀肥對作物籽粒產量提高的貢獻分別為11.8%和14.0%。鉀肥對旱季作物的增產貢獻率高于水季,其中鉀肥對大麥產量提高的貢獻率平均為17.9%,比水稻的高36.1%。在一年兩熟和三熟輪作制中,不施肥的作物平均每年從土壤中吸收的鉀量相當于相應平衡施肥的59.1%和58.3%。作物地上部吸鉀量的絕大部分來源于秸稈。其中大麥地上部吸鉀量的81.7%來源于秸稈,水稻為74.2%—87.6%。旱季土壤鉀素自然供應能力低于水季。大麥生長期平均每年土壤鉀素自然供應能力為69.8%,比早稻、連作晚稻和單季晚稻分別低15.5%、19.7%和19.4%。隨著試驗時間的延長,大麥生長期土壤鉀素自然供應能力以每年1.6%的速率降低,但水稻生長期土壤供鉀能力在時間上沒有顯著變化,20年定位試驗后仍維持在80%以上。盡管施鉀肥降低了作物鉀素內部利用率,但是年度間各施肥處理作物鉀素內部利用率沒有顯著變化。在平衡施肥條件下,每吸收1 kg鉀素,大麥、早稻、連作晚稻和單季晚稻可生產籽粒平均為42.4、44.7、41.3和44.8 kg。每施入1 kg鉀肥可生產籽粒分別為83.5、79.7、71.6和69.7 kg。旱季鉀肥效率高于水季。在一年兩熟輪作制中鉀肥表觀利用率平均為29.5%,而在一年三熟輪作制中,表觀利用率可達41.5%。由于作物對鉀素不斷的吸收,造成在一年兩熟和三熟水旱輪作系統中不施肥(CK)的土壤每年鉀素虧缺148.2和182.7 kg•hm-2,而且施氮磷肥加速了土壤鉀素的耗竭,每年多攜帶走鉀素57.8和65.0 kg•hm-2。盡管施鉀肥緩解了土壤鉀素不足,但在一年兩熟和三熟輪作制中施鉀土壤平均每年仍虧鉀分別為146.5和85.5 kg•hm-2。【結論】在水旱輪作系統中,水稻生長期土壤供鉀能力高于麥季,但旱季鉀肥的利用效率高于水季,在年施鉀量(K2O)187.5 kg•hm 2的條件下,土壤鉀素仍表現虧缺,因此,應該重視土壤鉀素平衡問題。
    基于典范對應分析的甘肅引黃灌區土壤鹽漬化特征研究
    楊思存1, 逄煥成2, 王成寶1, 李玉義2, 霍琳1, 姜萬禮1
    中國農業科學. 2014, 47(1):  100-110.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.011
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    【目的】研究甘肅引黃灌區耕地土壤全鹽量(TS)、pH和鹽分離子組成的空間分布特征及數量關系,并探討它們之間的相互關系、影響程度以及對鹽堿地類型、分布的影響。【方法】以興電和景電兩個典型灌區為研究取樣區,樣點布局既涵蓋了上游新墾鹽堿荒地、中游輕度鹽漬化耕地、下游中重度鹽漬化耕地和棄耕鹽堿荒地,又兼顧了耕地土壤鹽漬化類型(硫酸鹽型、氯化物-硫酸鹽型、硫酸鹽-氯化物型)和程度(輕度、中度、重度)的差異。運用常規統計學方法研究了土壤TS、pH、鹽分離子的剖面分布特征,運用典范對應分析方法(CCA)研究了土壤TS、pH與鹽分離子含量之間的數量關系及各土層TS、pH、鹽分離子與研究對象前2個CCA排序軸的相關系數、特征值和解釋方差。【結果】甘肅引黃灌區耕地土壤為輕度至重度鹽化,0—40 cm土層含鹽量隨土層深度的增加而降低,40—80 cm土層含鹽量隨土層深度的增加而增加。剖面中的陽離子以Na+為主,陰離子以SO42-為主,土壤pH介于7.93—9.98之間。不同土層內,K+與HCO3-、Ca2+與Mg2+始終有較好的關聯性,Na+與Cl-之間的關聯性越往下層越強,SO42-與Na+之間主要是負相關,K+與Na+以及SO42-、Cl-、HCO3-之間的關聯性不強。在0—100 cm全剖面上,pH的空間分布受HCO3-的影響較大,TS受Na+、Cl-、SO42-的影響較大。分層與全剖面的情況有所不同,0—20 cm土層內TS和pH的空間分布主要受控于SO42-含量,20—40cm土層內主要受控于Cl-和Na+含量,40—60 cm土層內受Ca2+、Mg2+、SO42-和HCO3-的共同影響,60—80 cm土層內Mg2+是主要影響因素,80—100 cm土層內主要受控于Mg2+和Cl-。CCA第1排序軸反映了TS的變化情況,第2軸反映了pH的變化情況,第1軸特征值在0.53—0.70,解釋方差在38.7%—57.7%;第2軸特征值在0.36—0.64,解釋方差在30.6%—44.7%。【結論】甘肅引黃灌區的鹽漬化耕地中同時存在鹽分表聚和底聚兩個過程,上游新墾鹽堿荒地和中游輕度鹽漬化耕地以底聚為主,下游中重度鹽漬化耕地和棄耕鹽堿荒地以表聚為主。60—80 cm的泥質膠結砂層含鹽量高達93.7 g•kg-1,對水鹽運移和鹽分離子分布產生了重要影響,是造成灌區發生土壤次生鹽漬化的主要原因之一。鹽漬化耕地的鈉質化現象只在重度次生鹽漬化區發生,TS、Na+和SO42-是決定項目區鹽堿地類型和分布的主要因素。典范對應分析通過箭頭連線的長短、所處的象限、箭頭之間的夾角以及與角符號間距離的遠近等,在CCA二維排序圖上可以直觀地給出各鹽分離子之間以及土壤TS、pH值與鹽分離子之間的關系,并通過各土層TS、pH、鹽分離子與研究對象前2個CCA排序軸的相關系數、特征值和解釋方差等,來確定不同土層的主控因子和影響甘肅引黃灌區鹽堿地類型和分布的主要因素,是一種更加科學的區域鹽堿地特征及改良利用情況評價方法。
    園藝
    中國50個甘藍代表品種EST-SSR指紋圖譜的構建
    王慶彪, 張揚勇, 莊木, 楊麗梅, 劉玉梅, 呂紅豪, 方智遠
    中國農業科學. 2014, 47(1):  111-121.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.012
    摘要 ( 329 )   HTML ( 1 )   PDF (673KB) ( 610 )   收藏
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    【目的】研究甘藍DNA指紋鑒定方法,并構建50份中國甘藍代表品種DNA指紋數據庫,為甘藍品種特異性、真實性、純度鑒定提供參考依據。【方法】首先,利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術和來源不同的甘藍材料對已開發的甘藍EST-SSR引物進行篩選,獲得多態性引物;然后將可用于甘藍DNA指紋鑒定的核心引物正義鏈5′末端分別標記TAMRA、HEX、 ROX、6-FAM四種熒光,利用DNA分析儀檢測不同等位變異的擴增片段大小,并確定每個等位變異的標準品種。利用核心引物擴增結合標準品種的片段大小,構建中國50個甘藍代表品種的SSR指紋數據庫。通過人工構建模擬群體對‘中甘21’品種真實性進行鑒定,進而對該指紋鑒定技術進行驗證。【結果】利用6份來自中國不同生態條件、植物學性狀差異較大的甘藍品種對978對EST-SSR引物進行初步篩選,獲得帶型清晰、具有多態性的引物128對。進一步根據引物擴增帶型清晰、多態性信息指數較高、不同等位變異的帶型易于區分、在染色體上分布均勻原則,篩選出20對核心引物。該套引物可以檢測甘藍染色體20個位點的58個等位變異,平均每條染色體上被檢測位點2.22個,平均每個位點包含2.9個等位變異,其中引物BoE607、BoE723等位變異數最多為5個,PIC值處于0.34—0.76之間。通過DNA分析儀檢測顯示等位變異擴增片段長度范圍143—296 bp。利用20對核心引物構建50份中國甘藍代表品種DNA指紋數據庫,并闡述了甘藍SSR-DNA指紋鑒定的應用和技術流程。本研究還對來自甘藍主產區的31份‘中甘21’品種進行真實性鑒定,結果顯示指紋鑒定與田間鑒結果完全一致。【結論】篩選獲得20對核心引物,用于構建中國50個甘藍代表品種DNA指紋數據庫,通過構建人工模擬群體對‘中甘21’品種的真實性進行鑒定,準確率達100%。
    黃瓜黑色果刺基因染色體定位及候選基因分析
    劉書林1, 顧興芳1, 苗晗1, 王燁1, YiqunWeng2, ToddCWehner3, 張圣平1
    中國農業科學. 2014, 47(1):  122-132.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.013
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    【目的】黃瓜作為重要的果菜類蔬菜,果實品質一直是黃瓜育種研究的重點。果實品質包括內在品質和外觀品質,其中外觀品質對黃瓜的商品性具有重要影響。果刺顏色作為黃瓜重要的品質性狀之一,對其進行遺傳分析和基因定位將有助于了解果刺顏色遺傳的分子機理,為黃瓜果實性狀改良提供理論依據和技術支撐,同時也可為刺色基因的精細定位及克隆奠定基礎。【方法】研究利用黃瓜白色果刺自交系GY14(P1)和黑色果刺自交系NC76(P2)為親本構建遺傳群體,進行黃瓜果刺顏色的遺傳分析。以F2分離群體為試材,應用分離群體分組分析法(BSA)和 2 112 對SSR引物進行 SSR 分析,結合9 930黃瓜全基因組序列信息和100份核心種質重測序結果開發新標記,對初定位區域進行標記加密。采用 JoinMap 4.0 作圖軟件和 MapInspect 軟件構建連鎖群并完成連鎖群與染色體的對應,實現黃瓜黑色果刺性狀的基因定位。運用生物信息學,在定位區域進行候選基因分析。利用包含156個株系的重組自交系(RILs)群體,對黑色果刺基因緊密連鎖的兩側翼分子標記進行驗證,確定標記用于分子標記輔助選擇(MAS)育種的準確性。【結果】研究表明,黃瓜自交系NC76的黑色果刺符合質量性狀遺傳特點,由顯性單基因B控制,黑色對白色為顯性。初步定位篩選獲得了與B基因連鎖的8對SSR引物,將B定位于黃瓜4號染色體(Chr.4)上,最近的連鎖標記為SSR22231,遺傳距離為10.8 cM;根據初定位區域的序列信息,設計合成了新的SSR引物212對和Indel引物25對,利用這些引物對雙親和F2群體DNA進行分析,最終構建了一個包含14個SSR標記和1個InDel標記的分子標記連鎖群,獲得與B連鎖的兩側翼標記SSRB-181和SSRB-130,遺傳距離分別為2.0 cM和1.6 cM,該區段物理距離為422.1 kb,有60個預測候選基因,推測Csa4G003095和Csa4G001690是與黑色果刺形成相關性較大的候選基因。與B緊密連鎖的兩側翼標記用于MAS育種的準確率分別為96.8%和96.2%,其中SSRB-181對黑色果刺植株鑒定的準確率達到100%,將在MAS育種發揮重要作用。【結論】黃瓜自交系NC76的黑色果刺性狀由顯性單基因控制,該基因位于Chr.4上422.1 kb范圍內, 兩側翼標記為SSRB-181和SSRB-130,遺傳距離為3.6 cM。本研究結果為黑色果刺基因的精細定位和克隆及MAS育種奠定了良好基礎。
    茶樹CHS基因結構及編碼區單核苷酸多態性分析
    張麗群1, 韋康1, 王麗鴛1, 成浩1, 劉本英2, 龔武云1
    中國農業科學. 2014, 47(1):  133-144.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.014
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    【目的】通過試驗獲得茶樹CHS基因(CsCHS)gDNA序列,以進一步確定CsCHS基因結構;研究CsCHS編碼區單核苷酸多態性,并結合茶樹多酚含量進行關聯分析,尋找基因中可能存在的與茶多酚含量存在顯著或極顯著相關關系的SNP位點。【方法】根據NCBI數據庫中已有CsCHS序列設計特異性引物,再分別以基因組DNA和cDNA為模板進行PCR擴增,經克隆、測序獲得CsCHS1、CsCHS2、CsCHS3三個基因的gDNA和cDNA全長序列,通過序列比對方法確定CsCHS結構。利用Compute pI/Mw、SOPMA等軟件對所得序列進行生物信息學分析,預測和比較CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白質結構。以茶多酚含量差異較大的57份茶樹品種為材料,分別以57份材料的cDNA為模板,用特異性引物進行PCR擴增,然后利用PCR產物直接測序法篩查CsCHS編碼區序列的單核苷酸多態性。結合CsCHS編碼區序列單核苷酸多態性和57份材料多酚含量,利用軟件TASSEL進行關聯分析,篩選基因中可能與茶多酚含量存在顯著或極顯著相關關系的SNP位點。【結果】試驗獲得CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的cDNA序列長度分別為1 277、1 320和1 242 bp,各自均包含一個長度為1 170 bp的開放閱讀框;CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的gDNA序列長度分別為1 600、1 330和1 607 bp。通過gDNA序列和cDAN序列比對,結合真核生物內含子GT-AG法則,確定CsCHS1、CsCHS3分別包含2個外顯子和1個內含子,內含子大小分別為323和356 bp,CsCHS2可能沒有內含子。根據CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3 cDNA序列推導三者對應氨基酸序列,比較三條氨基酸序列發現三者氨基酸同源性較高,達到92.6%—95.4%,CHS蛋白亞家族中的特征性保守位點在這三條序列中都能找到,生物信息學分析結果顯示CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白質結構高度相似。CsCHS1編碼區序列中共發現71個SNP位點,SNP出現頻率為1SNP/16.48 bp,無Indel,基因核苷酸多樣性(π)值為0.01088;CsCHS2編碼區序列中共發現55個SNP位點,SNP出現頻率分別為1SNP/21.27 bp,CsCHS2核苷酸多樣性(π)值(0.00530)明顯低于CsCHS1;因擴增CsCHS3 cDNA序列的PCR反應成功率低,未對該基因遺傳多樣性進行分析。通過關聯分析分別從CsCHS1和CsCHS2中找到2個和4個與茶葉多酚含量相關的SNP位點。【結論】CsCHS1和CsCHS3屬于保守型CHS基因,且CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3蛋白質結構高度相似,推測三者可能在茶樹的不同部位或不同生長階段發揮類似作用;CsCHS1和CsCHS2活躍,二者編碼區內可能存在突變熱點區。
    貯藏·保鮮·加工
    不同宰前禁食時間對羊肉品質影響的研究
    夏安琪, 李欣, 陳麗, 何凡, 劉金凱, 王振宇, 倪娜, 張德權
    中國農業科學. 2014, 47(1):  145-153.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.015
    摘要 ( 317 )   HTML ( 1 )   PDF (3137KB) ( 784 )   收藏
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    【目的】動物在裝卸和運輸過程中的斷料斷水以及宰前休息期人為控制的禁食禁水行為稱為宰前禁食。不當的宰前禁食處理可能降低畜禽胴體出品率,對肉的食用品質和加工性能產生不良影響。研究不同宰前禁食時間處理對羊肉品質的影響,確定適宜于肉羊的宰前禁食時間,對生產優質羊肉有重要意義。【方法】選取6月齡敖漢細毛羊公羊30只,分別進行宰前禁食0 h(對照)、12 h和24 h處理,研究羊肉食用品質(pH值、肉色、剪切力、持水力)、感官品質(膻味、嫩度、多汁性、總體可接受性)、衛生品質(菌落總數、大腸菌群總數)及宰后成熟過程中糖原含量、肌節長度和肌原纖維蛋白降解程度的變化規律。【結果】宰前禁食24 h處理組羊肉在宰后0 h、45 min、4 h的pH顯著高于禁食12 h組和對照組(P<0.05)。隨著成熟時間延長,pH值差異逐漸消失,3個處理組之間羊宰后24 h和48 h pH差異不顯著(P>0.05)。宰前禁食24 h組羊肉蒸煮損失顯著低于禁食12 h組和對照組(P<0.05)。3個處理之間羊肉L*、a*、b*、ΔE、滴水損失、剪切力值及感官評價膻味、嫩度、多汁性和總體可接受性打分差異均不顯著(P>0.05)。宰后成熟24 h后,不同宰前禁食時間處理組羊肉的菌落總數及大腸菌群總數均在國標規定范圍之內,不同處理組之間羊肉菌落總數差異不顯著(P>0.05)。隨禁食時間的延長大腸菌群總數呈下降趨勢,宰前禁食處理組羊肉大腸菌群菌落總數低于對照組。3個宰前禁食處理組羊宰后0 h、45 min、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h羊肉的糖原含量差異不顯著(P>0.05)。隨宰后成熟時間的延長,糖酵解程度加大,糖原含量呈下降趨勢。隨宰前禁食時間的延長,肌節長度增加。宰前禁食24 h處理組肌節長度大于禁食12 h處理組,禁食12 h處理組肌節長度大于對照組(P<0.05)。宰前禁食處理組羊肉宰后0 h羊肉肌原纖維蛋白降解程度一致,沒有顯著條帶出現或缺失。宰后成熟24 h時,3個處理組在27 kD均出現條帶,且宰前禁食12 h和24 h處理組的27 kD條帶顏色深于對照組,表明禁食12 h和24 h處理組羊肉蛋白降解程度高于對照組。【結論】宰前禁食12 h和24 h使羊宰后肌肉衛生品質提高,并且促進宰后蛋白質降解。宰前禁食24 h使蒸煮損失降低。宰前禁食12 h和24 h對羊肉極限pH、糖原含量及肉質指標無影響。與對照組相比,宰前禁食12 h和24 h有益于羊肉衛生品質,對食用品質及感官品質無影響。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    阻斷PI3K/AKT通路通過激活FoxO1抑制 豬骨骼肌衛星細胞分化
    史新娥, 吳國芳, 宋子儀, 路宏朝, 賈龍, 朱嘉宇, 楊公社
    中國農業科學. 2014, 47(1):  154-160.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.016
    摘要 ( 299 )   HTML ( 1 )   PDF (2983KB) ( 752 )   收藏
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    【目的】在骨骼肌生長或損傷刺激下,骨骼肌衛星細胞被激活、增殖分化形成肌管,促進骨骼肌的生長發育或修復組織創傷。FoxO1負調控骨骼肌的生成,但在骨骼肌衛星細胞分化過程中的作用未見報道。因此,筆者探索FoxO1對豬骨骼肌衛星細胞分化的影響,希望為深入研究FoxO1調控骨骼肌生長發育的作用機理奠定基礎。【方法】以1—3日齡健康大白豬為材料,采用單根肌纖維法分離培養豬骨骼肌衛星細胞,接種第2天、第4天和第6天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。在細胞分化第8天,用免疫熒光染色方法染肌管,DAPI染核,并在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。 待細胞匯合至70%—80%時,將培養基換成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素(wortmannin,WM)的分化培養基,分別于細胞分化第0天、第4天和第8 天收集細胞,提取總RNA和總蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法檢測WM對FoxO1以及骨骼肌衛星細胞分化標志基因表達的影響。【結果】豬骨骼肌衛星細胞在接種第2天開始貼壁,呈梭形。第4天細胞數量增加,部分發生融合。第6天時細胞呈方向性生長。第8天細胞進一步融合形成肌管。WM處理組的FoxO1 mRNA表達水平未發生顯著變化(P>0.05),非磷酸化的FoxO1蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05),而p-FoxO1蛋白表達較對照組顯著下降(P<0.05)。WM處理組的細胞在分化第8天,雖然也出現了蜂窩狀生長,但是與對照組相比細胞未呈方向性生長并形成肌管。Western blotting結果顯示,WM明顯抑制豬骨骼肌衛星細胞分化早期標志基因MyoD、中后期標志基因MyoG和末期標志基因MyHC蛋白的表達。【結論】以WM阻斷PI3K信號通路能使FoxO1去磷酸化,抑制豬骨骼肌衛星細胞的分化,延遲肌管的形成,并降低成肌分化標志基因MyoD、MyoG和MyHC的表達。總之,阻斷PI3K信號通路通過激活FoxO1抑制豬骨骼肌衛星細胞分化。
    甘南牦牛GDF-10基因多態與生產性狀的相關性分析
    李天科1, 2, 梁春年1, 2, 郎俠1, 2, 裴杰1, 2, 吳曉云1, 2, 褚敏1, 2, 秦文1, 2, 閻萍1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(1):  161-169.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.017
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    【目的】GDF-10基因又稱作骨形成蛋白3b,最早通過骨形成蛋白寡聚核苷酸序列的PCR擴增所得,與骨骼的形成和發育有關。很多研究已經表明GDF-10基因在骨骼的形態變化過程中發揮著重要作用。本實驗通過研究甘南牦牛GDF-10基因多態性與生產性狀間的相關性,證明GDF-10基因與骨骼發育的相關性,發現與牦牛生產性狀相關的分子標記,為加快牦牛選育進程,提高牦牛生產性能提供參考。【方法】以298頭甘南牦牛血樣為材料,隨機選取其中的30個DNA樣混合組成DNA池,設計9對引物對GDF-10基因外顯子1,2和3進行擴增,擴增產物經瓊脂糖凝膠回收后測序。運用BLAST 和Chromas軟件通過測序峰圖找出突變位點,然后采用高分辨率熔解曲線分析技術(high resolution melting curve,HRM)進行基因型分型和統計等位基因頻率。采用SHEsis和PHASE軟件對GDF-10基因多態位點進行配對連鎖不平衡和單倍型分析,采用SPSS17.0進行基因多態位點與生產性狀關聯性分析。【結果】檢測到甘南牦牛GDF-10基因外顯子3的 3個多態位點12116(G/A)、12152(C/T)、和13041(T/C)。群體遺傳學分析顯示,3個多態位點均表現為低度多態(PIC<0.25);?2檢驗表明牦牛群體在13041(T/C)位點未達到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05),其它兩個多態位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05);多態位點配對連鎖不平衡分析發現,三個突變位點之間存在弱連鎖平衡;關聯分析表明,甘南牦牛GDF-10基因不同突變位點的基因型與體斜長、體高、胸圍、體重差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.001),與管圍差異不顯著(P>0.05);單倍型分析后在群體中發現了7種單倍型組合,其中ATC和ATT組合與牦牛的體尺性狀和體重顯著相關。【結論】甘南牦牛GDF-10基因3個多態位點和兩個單倍型組合與牦牛的體高、體長、體重和胸圍顯著相關,可以嘗試作為牦牛生產性狀的候選分子標記,為牦牛遺傳資源的保護、開發與新品種的選育提供科學依據。
    苦馬豆素抗牛病毒性腹瀉病毒的研究
    郝寶成1, 2, 武凡琳2, 邢小勇2, 項海濤2, 溫峰琴2, 王學紅1, 權曉弟1, 2, 胡永浩2, 梁劍平1, 2平1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(1):  170-181.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.018
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    【目的】瘋草是中國西部影響草地生態和畜牧業健康發展的毒草之一。主要有豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物等,在冬季牧草嚴重缺乏的時節,牛羊等牲畜被迫采食后可引起中毒和生產性能下降,甚至死亡,每年給我國草地生態和畜牧業造成的直接經濟損失達幾十億元,是危害最嚴重的毒草。目前,我國西部天然草地動物因瘋草中毒死亡所造成的經濟損失仍持續劇增。苦馬豆素被認為是引起動物瘋草中毒的主要毒性成分。由于瘋草分布廣泛,資源豐富,如何改善草地生態,合理開發利用瘋草成為研究的課題和方向。近幾十年來, 隨著對瘋草研究的深入和擴展,人們發現苦馬豆素不僅具有良好的抗腫瘤效果,還可作為免疫調節劑、抗HIV及擴散抑制劑、抗病毒和細胞保護劑等藥物使用。目前,國內在對苦馬豆素抗腫瘤、調節機體免疫方面研究較熱,但是,對苦馬豆素在抗病毒活性、作用機理方面的研究尚無相關報道。為了探討莖直黃芪中生物堿苦馬豆素(swainsonine,SW)抗牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的作用機制,明確其體外抗病毒作用效果,為抗BVDV的藥物篩選提供參考依據。【方法】利用細胞培養技術,采用CPE觀察法和MTT比色法相結合的方法測定不同濃度SW對牛腎原代細胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用,確定藥物的安全濃度和TD50,并分別采用先加藥后感染病毒、先感染病毒后加藥、藥毒作用2 h后加入、感染病毒同時給藥后再加藥四種作用方式,檢測不同濃度SW對BVDV入侵的阻斷作用、復制的抑制作用、直接殺傷作用和綜合作用,并計算不同作用方式下的治療指數。【結果】結果顯示:SW濃度小于0.256 μg•mL-1范圍內對MBDK細胞無毒性作用,在大于0.512 μg•mL-1濃度下MBDK細胞表現出一定程度的病變,TD50為2.512 μg•mL-1,按Reed-Muench 氏法計算BVDV TCID50為10-4.7/0.1mL;在體外隨苦馬豆素質量濃度的增加,其抗BVDV作用具有很好的量效關系,且與作用方式有關,比較四種作用方式下的治療指數1.05、2.47、2.08和3.21,說明SW對BVDV的綜合作用(65.29%,P<0.01)和復制(65.05%,P<0.01)的抑制作用較好,亦有一定的直接殺傷作用,但對其入侵的阻斷作用不佳。【結論】SW在體外有良好抗BVDV活性作用,并推測苦馬豆素(SW)抗病毒的主要效應可能是SW能進入細胞內抑制BVDV的復制增殖以及直接滅活游離BVDV而發揮作用。
    研究簡報
    稻茬小麥公頃產量9000 kg群體糖氮代謝特征
    丁錦峰1, 2, 訾妍1, 成亞梅1, 潘婷1, 封超年1, 2, 朱新開1, 2, 李春燕1, 2, 彭永欣1, 2, 郭文善1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(1):  182-190.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.019
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    【目的】探討稻茬小麥籽粒產量9 000 kg•hm-2群體糖氮代謝特征及關鍵生育期糖氮營養診斷指標。【方法】2010—2012年,在稻麥兩熟條件下,以中筋小麥揚麥20為材料,采用三因素裂區設計,以施氮量(純N)為主區,設210 kg•hm-2、262.5 kg•hm-2兩個水平;以施氮比例為副區,設基肥﹕壯蘗肥﹕拔節肥﹕穗肥分別為3﹕1﹕3﹕3、5﹕1﹕2﹕2兩個水平;以穗肥追氮時期為裂區,設劍葉露尖、孕穗期、抽穗期和開花期4個水平。通過試驗構建稻茬小麥不同產量群體,分析不同產量群體植株可溶性糖、氮含量及糖氮比動態特征及其與產量的關系,提出籽粒產量9 000 kg•hm-2左右稻茬小麥關鍵生育期糖氮代謝診斷指標。【結果】隨小麥生育進程推移,不同產量群體植株可溶性糖含量及糖氮比在越冬始期和孕穗至開花期出現峰值,返青期出現低谷,花后下降直至成熟;植株氮含量逐漸下降,其中越冬始期至拔節期迅速降低,拔節至孕穗期降幅減慢,孕穗期至成熟期緩慢下降。籽粒產量9 000 kg•hm-2以上群體孕穗期植株可溶性糖、氮含量及開花期植株氮含量顯著高于籽粒產量9 000 kg•hm-2以下群體;成熟期植株可溶性糖含量低于籽粒產量9 000 kg•hm-2以下群體,2010—2011年度差異達顯著水平,2010—2011年度差異未達顯著水平;成熟期植株糖氮比顯著低于籽粒產量9 000 kg•hm-2以下群體;其他生育期植株可溶性糖、氮含量及糖氮比群體間差異均未達顯著水平。孕穗期植株可溶性糖、氮含量及開花期植株氮含量與產量呈線性正相關,乳熟期植株可溶性糖及氮含量與產量呈拋物線關系,成熟期植株可溶性糖含量與產量呈線性負相關。籽粒產量9 000 kg•hm-2左右群體孕穗期、開花期、乳熟期及成熟期植株可溶性糖含量分別為14.56%—16.78%、14.52%—16.82%、10.59%—11.23%、1.62%—1.76%,氮含量分別為1.55%—1.64%、1.47%—1.57%、1.28%—1.30%、1.15%—1.20%,糖氮比分別為9.37—10.25、9.80—10.69、8.29—8.77、1.41—1.48。【結論】稻茬小麥實現籽粒產量9 000 kg•hm-2需要在越冬始期至拔節期具有較高的糖、氮營養和協調的糖氮比,關鍵在于孕穗期至開花期具有高可溶性糖及氮含量,開花后具有高碳素積累量及向籽粒的轉化率。
    不同生長時期冬棗受綠盲蝽危害后應激防御酶活性的變化
    李林懋1, 2, 門興元1, 葉保華2, 于毅1, 張安盛1, 李麗莉1, 周仙紅1, 莊乾營1
    中國農業科學. 2014, 47(1):  191-198.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.020
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    【目的】比較綠盲蝽刺吸與人工針刺模擬危害后,冬棗不同組織的應激防御酶活性,以及受綠盲蝽不同程度危害的冬棗葉、蕾、花、幼果應激防御酶的變化。【方法】在冬棗各生長期(芽期、蕾期、花期、幼果期)易受危害部位(嫩葉、蕾、花、幼果)接入不同數量(1—3頭)綠盲蝽和人工針刺模擬危害,危害24 h后,采摘不同危害程度的冬棗組織,采用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用愈創木酚法測定過氧化物酶(POD)活性;采用紫外吸光法測定過氧化氫酶(CAT)活性。【結果】冬棗嫩葉組織遭人工針刺和綠盲蝽刺吸脅迫后所產生的SOD、POD、CAT活性顯著高于正常葉片,其中綠盲蝽刺吸嫩葉所產生的應激SOD和CAT活性顯著高于人工針刺;冬棗蕾受到人工針刺和綠盲蝽刺吸脅迫后,SOD活性沒有變化,POD活性顯著增加,受綠盲蝽刺吸脅迫后CAT活性顯著高于人工針刺脅迫;冬棗花受到人工針刺和綠盲蝽刺吸脅迫后,SOD和CAT活性沒有變化,POD活性顯著增加,綠盲蝽刺吸脅迫下POD活性比人工針刺活性更高;冬棗幼果受到人工針刺和綠盲蝽刺吸脅迫后,SOD和CAT活性沒有變化,POD活性顯著增加。受綠盲蝽不同危害程度的應激酶活性測定結果表明,受害后冬棗各組織內3種防御性酶隨受害程度的加重發生不同程度的變化。葉片和花受綠盲蝽不同程度危害后,SOD活性呈現隨著受害程度的加重先升高后降低的趨勢;POD、CAT活性隨受害程度的加重均呈上升的趨勢;冬棗蕾受綠盲蝽不同程度危害后,SOD活性變化不顯著,POD和CAT活性呈現上升趨勢。冬棗幼果受綠盲蝽不同程度危害后,SOD活性隨著受害程度的加重先降低,后上升;POD活性隨受害程度的加重均呈先下降再上升的趨勢。【結論】綠盲蝽的危害脅迫能誘導寄主植物產生一系列應激生化反應。冬棗不同組織受脅迫后,參與防御的酶可能不同,嫩葉受脅迫后,3種防御酶均會發生變化,而蕾、花、幼果等繁殖器官受脅迫后,POD活性變化更為明顯;綠盲蝽刺吸脅迫(除了物理損傷外,還分泌唾液進行化學危害)比人工針刺(僅有物理損傷)往往能夠誘導更高的防御酶活性;隨著綠盲蝽的危害加重,冬棗不同組織的受損程度不同,不同的酶活性表現不同。
    卵巢摘除對山羊血清GH水平和組織中GHR基因表達的影響
    張磊1, 王燕燕1, 周占琴1, 李廣1, 付明哲1, 張鎖良2, 尹海科2, 張勝剛2, 任寶華2
    中國農業科學. 2014, 47(1):  199-208.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.021
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    【目的】探討卵巢摘除對母山羊產肉性能,血清中生長激素(growth hormone, GH)水平以及背最長肌、股二頭肌、肝臟、脂肪組織中生長激素受體基因(growth hormone receptor, GHR) 表達的影響,揭示摘除母山羊卵巢提高其育肥效果的原因。【方法】將體重相近的5月齡布爾山羊雜種(布爾山羊♂×關中奶山羊♀)母羊40只作為研究對象。試驗開始前一個月,對所有羊只進行驅蟲和防疫工作。試驗開始時將母羊隨機分為處理組和對照組,每組20只,摘除處理組母羊的卵巢,對照組不摘除。在試驗的第0,10,20,30,40 和50 天早晨8:00對所有試驗羊進行空腹采血,立即分離血清,采用羊生長激素酶聯免疫分析試劑盒測定血清中GH水平。50 d后分別從處理組和對照組隨機選取5只試驗羊進行屠宰試驗,測定其屠宰率、胴體產肉率、眼肌面積和骨肉比。同時,立即采取肝臟、背最長肌、股二頭肌及腎周脂肪組織樣,每個組織至少采集3份生物學重復樣,用錫箔紙包好標記后立即投入液氮中,帶回實驗室放入-80℃冰箱保存,然后利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)相對定量技術和2-△△Ct法檢測背最長肌、股二頭肌、肝臟和腎周脂肪中GHR基因mRNA的相對表達量。【結果】對照組母羊血清GH濃度在試驗的第20天為8.63 μg•L-1,處理組母羊達到9.50 μg•L-1,顯著高于對照組(P<0.05),且隨著試驗進行呈上升趨勢。處理組母羊血清GH濃度在第50 天時達到了11.55 μg•L-1,高出對照組(9.34 μg•L-1)2.21 μg•L-1,且兩組間差異極顯著(P<0.01)。另外,發現處理組母羊的屠宰率、胴體產肉率和眼肌面積均高于對照組,且處理組母羊屠宰率達到了45.62% 顯著高于對照組的42.41%(P<0.05),但是骨肉比則顯著低于對照組(P<0.05)。實時熒光定量PCR的結果顯示處理組母羊肝臟中GHR基因mRNA的表達量是對照組的3.21倍(P<0.01);GHR基因在處理組母羊背最長肌中的相對表達水平最高,是對照組的4.87倍,且兩組間差異極顯著(P<0.01);股二頭肌中GHR基因表達量是對照組的3.17倍,差異極顯著(P<0.01);在腎周脂肪中,處理組母羊GHR基因的相對表達量是對照組的1.91倍,顯著高于對照組(P<0.05)。【結論】摘除母山羊卵巢后,其屠宰率、血清GH水平以及肝臟、背最長肌、股二頭肌和腎周脂肪GHR基因表達均顯著上升,骨肉比顯著下降。這提示摘除母畜卵巢可能通過增加其血清GH水平和部分靶組織中GHR基因的表達提高母羊的屠宰率,降低骨肉比,從而有利于母羊的產肉性能的提高。
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