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當期目錄

    2014年 第47卷 第2期 刊出日期:2014-01-15
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    植物轉錄因子NAP亞家族的研究進展
    范凱, 王學德, 袁淑娜, 王銘
    中國農業科學. 2014, 47(2):  209-220.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.001
    摘要 ( 369 )   HTML ( 1 )   PDF (523KB) ( 764 )   收藏
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    植物轉錄因子NAP(NAC-Like,Activated by AP3/PI)是近年來發現的一類與調控植物生長發育、控制葉片衰老以及響應外界環境脅迫等功能有關的轉錄因子,是NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)家族中的一個重要成員,也是一類植物特有的轉錄因子。轉錄因子NAP在結構上具有NAC家族的保守結構,即在N端具有保守的NAC區以及在C末端具有相對多樣性的TAR區,但也有不同于其它NAC亞家族的一些特點,如其TAR區也有一定的保守性等;同時,NAP亞家族的基因表達產物主要集中在細胞核中,表明轉錄因子NAP是一個核蛋白;再者轉錄因子NAP的基因主要包括3個外顯子和2個內含子。自從第一個轉錄因子NAP于1998年由Robert等在擬南芥中對控制花發育的AP3/PI的靶基因進行研究時發現以來,目前已在水稻、小麥、大豆、棉花、竹子、葡萄、番紅花等植物中相繼發現,表明NAP是存在于植物界中的一個特有的轉錄因子。轉錄因子NAP具有多種生物學功能,廣泛參與植物種子、根、花等的生長發育,對植物生長發育過程起著重要的調節作用;與此同時,轉錄因子NAP也在葉片凋亡過程中起著舉足輕重的作用,對葉片在衰老過程中涉及到的大分子物質的降解以及營養物質的再分配等過程起著重要的調控作用;而且,轉錄因子NAP對包括干旱、鹽漬、冷害等外界環境脅迫有一定的響應,是一類參與調控植物體內各種生理反應的關鍵因子;同時,轉錄因子NAP也與植物尤其是農作物的品質有密切的關系,這也為農作物育種提供了一種新的思路和方法。最新研究表明,NAP主要受脫落酸和乙烯調控,已發現一個定位在高爾基體的PP2C家族中的成員SAG113為轉錄因子NAP的一個直接的靶基因,而且發現SAG113在控制氣孔運動方面尤其是在衰老葉片中可能是ABA調控中的一個負調控元件,通過酵母雜交試驗以及電泳遷移率變動分析技術得出轉錄因子NAP受到ABA的調控并直接與其靶基因SAG113啟動子區域的一個特定的區域進行專一性的結合,即在衰老葉片中轉錄因子NAP通過ABA-NAP-SAG113 PP2C調節鏈提高其靶基因SAG113的表達,以及通過促進氣孔開放從而導致水分喪失和通過足夠的氧氣進入到組織中使得乙烯釋放進而使呼吸作用加快等加速葉片衰老的信號這一調控機制。文章主要對NAP轉錄因子的結構特點、生物學功能以及調控機制等方面在植物中的研究現況進行較為詳細的闡述,以期為后續研究提供一定的參考。
    水稻507ys黃綠葉突變體的遺傳鑒定與候選基因分析
    李燕群1, 蒲翔1, 李春梅1, 鐘萍1, 孫昌輝1, 李秀蘭2, 鄧曉建1, 王平榮1
    中國農業科學. 2014, 47(2):  221-229.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.002
    摘要 ( 247 )   HTML ( 3 )   PDF (758KB) ( 611 )   收藏
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    【目的】對水稻507ys黃綠葉突變體進行遺傳鑒定與候選基因分析。【方法】用化學誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理粳稻品種日本晴(Nipponbare),從突變體庫中獲得一份黃綠葉突變體507ys。對該突變體進行表型觀察以及主要農藝性狀調查分析。將507ys與正常綠色品種進行雜交,調查F1代的葉色表型和F2群體的葉色分離情況,分析該突變表型的遺傳行為。利用(507ys/明恢63)的F2作為定位群體,對507ys突變基因進行精細定位且遴選候選基因,對候選基因進行DNA測序驗證及編碼蛋白序列同源性分析。同時,測定507ys突變體和野生型親本的光合色素含量,并利用高效液相色譜(HPLC)精確分析它們的葉綠素組成成分,以進一步揭示507ys黃綠葉突變基因的候選基因。【結果】507ys黃綠葉突變體整個生育期呈黃綠色。與野生型親本日本晴相比,507ys突變體在分蘗期葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量分別下降52.1%和58.1%,成熟期株高、每株有效穗數、每穗著粒數和結實率分別減少8.3%、51.0%、7.4%和11.6%。507ys與正常綠色品種日本晴和明恢63雜交的F1表現正常的綠色,F2群體綠色正常植株與黃綠葉突變植株分離比符合3﹕1,表明507ys的黃綠葉突變性狀由1對隱性核基因控制。該突變基因定位在第10染色體長臂近端部SSR標記RM333和InDel標記L3之間,遺傳距離分別為0.56 cM和0.14 cM,兩標記之間的物理距離約為60.2 kb,此區間內包含13個有注釋的預測基因。基因組序列分析發現,507ys突變體中編碼葉綠素酸酯a加氧酶的OsCAO1(LOC_Os10g41780)在編碼區第2 198位堿基(CDS第1 057位堿基)處,堿基G突變為堿基A,造成編碼蛋白的氨基酸序列第353位的谷氨酸(E)突變成賴氨酸(K)。對葉綠素組成成分分析表明,507ys突變體葉片中只有葉綠素a,沒有葉綠素b。【結論】507ys突變體基因是已報道的葉綠素酸酯a加氧酶基因OsCAO1的等位基因。507ys突變體在OsCAO1外顯子上發生的一個點突變使得其體內葉綠素酸酯a加氧酶失活,造成葉綠素b合成受阻。
    冀豆12遺傳背景下3個回交組合高低蛋白含量 后代品系SSR標記分析
    陳強1, 2, 閆龍1, 楊春燕1, 張嘉楠1, 史曉蕾1, 東方陽2, 鄧瑩瑩1, 2, 侯文煥1, 張孟臣1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(2):  230-239.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.003
    摘要 ( 323 )   HTML ( 1 )   PDF (620KB) ( 393 )   收藏
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    【目的】以高蛋白、高產、高配合力大豆品種冀豆12為遺傳基礎,創造高蛋白含量新種質,分析蛋白含量相關QTL及其連鎖標記,挖掘QTL中包含的優異基因,為高蛋白育種提供新種質、新標記。【方法】以冀豆12為輪回親本,來自東北地區的紅豐11、茶秣食豆、綏農14等蛋白質含量不同的育成品種和地方品種為供體親本,通過有限回交,創造高蛋白新種質。從3個組合的回交后代品系中,選擇農藝性狀一致、產量與冀豆12無顯著差異的4個高蛋白(50%—53%)品系和3個中低蛋白(38%—41%)品系為試驗材料,參照大豆公共遺傳連鎖圖譜,分別在20個連鎖群上,均勻選取并篩選在雙親間表現多態性的SSR標記,分析冀豆12及其后代品系的遺傳相似性與遺傳差異,確定與蛋白質含量相關的QTL及其連鎖標記。通過對QTL候選區間內的基因功能注釋,挖掘與蛋白質含量相關的優異基因。【結果】創制出一批蛋白質含量超過50%的高蛋白新種質。3個組合中分別篩選到209、201和199個雙親間多態性標記;親本與后代間遺傳相似性分析結果表明,同一組合的后代中高蛋白品系的輪回親本遺傳背景回復率高于低蛋白品系遺傳背景回復率。3個組合中4個高蛋白品系與輪回親本冀豆12之間的相似系數平均值為79.58%,顯著高于3個低蛋白品系材料與輪回親本冀豆12之間的相似系數平均值67.81%;輪回親本冀豆12傳遞給高蛋白種質的SSR位點數平均為161個,傳遞給低蛋白材料的SSR位點平均數為135個,二者相差27%。遺傳效應分析結果表明,共發掘出位于14個連鎖群上的22個與蛋白質含量相關的QTL及其連鎖SSR標記,其中,18個QTL的蛋白質含量增效基因來自輪回親本冀豆12。進一步分析顯示,4個共性高蛋白染色體區段對高蛋白含量形成具有關鍵作用,分別位于C1連鎖群(第4染色體)的75.52—80.62 cM、D2連鎖群(第17染色體)的67.71—84.18 cM、G連鎖群(第18染色體)的80.38—96.57 cM和I連鎖群(第20染色體)的46.22—50.11 cM。通過基因功能注釋和代謝途徑分析,預測了4個區段內20個可能參與7-磷酸景天庚酮糖、半胱氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、色氨酸等氨基酸的合成與代謝等蛋白質合成相關代謝途徑的候選基因。【結論】冀豆12含有較多的高蛋白QTL位點,供體親本的高蛋白遺傳位點可以在以冀豆12為輪回親本的后代中表現出來,并通過SSR分析檢測到。以冀豆12為輪回親本,通過有限回交,易于創造出高蛋白種質。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    硅介導稻瘟病抗性的生理機理
    葛少彬, 劉敏, 蔡昆爭, 蔡一霞, 駱世明
    中國農業科學. 2014, 47(2):  240-251.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.004
    摘要 ( 349 )   HTML ( 1 )   PDF (561KB) ( 605 )   收藏
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    【目的】稻瘟病是水稻生產主要的病害之一,每年造成嚴重的產量損失。研究表明,施用硅肥作為一種環境友好型病害防治措施,在增強植物抗病性中起重要作用,但其作用機理還不完全清楚。本文旨在探討硅處理對水稻稻瘟病的抗性效應及生理作用機理,為稻瘟病的有效防治提供理論依據和實踐指導。【方法】選用稻瘟病廣譜感病品系CO39(不含已知抗稻瘟病基因)及其近等基因系C101LAC(Pi-1)(抗病品系)為試驗材料,設置(1)不加硅不接種(Si-M-)、(2)加硅不接種(Si+M-)、(3)不加硅接種(Si-M+)和(4)加硅接種(Si+M+)等4個處理,通過光照培養箱控制生長條件,用Hoagland營養液進行水培試驗,研究施硅對稻瘟病的控制效果,以及對水稻根系和葉片中硅、酚類物質、水楊酸、乙烯及H2O2含量的影響。【結果】施硅顯著降低兩個水稻品系的稻瘟病的發病率和病情指數。抗病品系C101LAC(Pi-1)的稻瘟病的發病率和病情指數明顯低于感病品系CO39。施硅后,兩個水稻品系的根、莖、葉中的硅含量都顯著增加,地上部的硅含量明顯高于根部。稻瘟病菌侵染條件下,加硅顯著降低兩個材料葉片中的總酚含量,對根系中的總酚含量沒有顯著影響。不接種稻瘟病菌情況下,加硅對第3天葉片中總酚含量沒有顯著影響,而顯著降低了第7天葉片中的總酚含量,兩個水稻品系表現一致。對兩個品系水稻品種來說,根系中的總酚含量明顯低于葉片中的總酚含量。稻瘟病菌侵染條件下,加硅顯著降低兩個材料葉片中的木質素含量,對根系中的木質素含量沒有顯著影響。不接種稻瘟病菌情況下,加硅顯著增高了CO39葉片中的水楊酸含量,而對于C101LAC(Pi-1),加硅只在第3天顯著增高了葉片中的水楊酸含量。接種稻瘟病菌后,施硅使CO39在第3天葉片中的水楊酸含量顯著增高,而對C101LAC(Pi-1)沒有顯著影響。在兩個品系的根系中都沒有檢測到水楊酸。接種稻瘟病菌后,施硅顯著降低了兩個水稻材料葉片和根系中的乙烯含量。不接種稻瘟病菌情況下,葉片中乙烯含量極低,加硅顯著降低了CO39第3天根系中乙烯含量,而對于C101LAC(Pi-1),加硅后,第3天和第7天根系中乙烯含量都顯著降低。加硅顯著降低兩個材料葉片中H2O2的含量,而顯著增加了根系中H2O2含量。對兩個品系水稻品種來說,根系中的H2O2含量明顯低于葉片中的。【結論】施硅能顯著增加水稻對稻瘟病的抗性,改變植株體內的生理代謝狀況,調節植物體內酚類物質的含量,并通過誘導信號物質如水楊酸、乙烯、H2O2等的變化來提高水稻植株對稻瘟病的抗性。
    低溫脅迫下擬南芥表皮蠟質的響應機制
    倪郁, 宋超, 王小清
    中國農業科學. 2014, 47(2):  252-261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.005
    摘要 ( 297 )   HTML ( 4 )   PDF (864KB) ( 730 )   收藏
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    【目的】低溫是影響作物產量和品質的主要環境因素之一,而表皮蠟質是植物抵御外界脅迫的第一層保護性屏障。研究低溫脅迫對擬南芥表皮蠟質組分含量、結構及相關蠟質基因表達的影響,有助于進一步理解植物表皮蠟質與低溫互作機制,從而對后續作物的抗性機制研究起指導作用。【方法】以野生型擬南芥與蠟質突變體cer1、cer3、cer4、cer6、cer10、cer20及kcs1為試驗材料,待植株生長至5—6周時進行4℃脅迫處理10 d和18 d。利用掃描電子顯微鏡觀察表皮蠟質晶體結構變化;利用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)分析蠟質組成及含量變化;利用qRT-PCR技術檢測蠟質基因CER1、CER3、CER4、KCS1、WIN1的表達。【結果】低溫脅迫后,擬南芥蠟質晶體結構在分布密度、形狀與大小方面發生了不同程度的變化。野生型擬南芥蠟質晶體熔融成片,大面積覆蓋莖稈表面,這可能一定程度上起到了低溫阻隔作用,并減少水分散失。cer1突變體表現出松針狀晶體顯著減少,并以小型樹枝狀結構為主;cer3與cer10桿狀晶體顯著減少;而cer6與cer20蠟質晶體在低溫脅迫后有所增加;kcs1蠟質晶體在低溫脅迫后垂直桿狀結構顯著減少,水平桿狀結構出現,并伴有蠟質晶體熔融現象。低溫脅迫對一級醇減少突變體cer4結構無顯著影響。GC-MS分析結果表明,擬南芥野生型與各突變體在低溫脅迫下表皮蠟質組分含量也發生了不同程度的變化。野生型中醛類與酮類含量顯著減少、一級醇類含量顯著增加。各突變體則表現出相反的變化,蠟質組分中醛類、酮類含量增加或無顯著變化、一級醇含量減少或無顯著變化;受低溫脅迫較重的cer3﹑cer10表皮蠟質中一級醇含量顯著下降。擬南芥表皮蠟質在低溫脅迫下顯著積累(cer3 無顯著變化、cer10 蠟質總量減少),且主要通過增加烷類與次級醇含量來增加蠟質總量。低溫脅迫誘導了野生型CER1 基因的強勢表達,植株通過上調CER1 的表達促進烷類物質的合成以響應低溫脅迫;CER4 的表達上調促進了一級醇的合成。KCS1、CER3與WIN1在低溫脅迫下表達下調,暗示了植株蠟質總量的增加主要是通過蠟質合成的下游途徑如烷合成途徑增加。【結論】低溫脅迫可以改變表皮蠟質晶體結構及組分含量,蠟質組分中烷類與次級醇類含量的上升是響應低溫脅迫的主要方式,蠟質總量的增加主要來自于烷類的增加。CER1是響應低溫脅迫的主要蠟質基因。
    植物保護
    內生芽孢桿菌BS2的β-1,4-內切葡聚糖酶基因與定殖相關性
    范曉靜1, 楊瑞先1, 2, 邱思鑫3, 胡方平1
    中國農業科學. 2014, 47(2):  262-272.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.006
    摘要 ( 344 )   HTML ( 1 )   PDF (743KB) ( 739 )   收藏
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    【目的】克隆植物內生解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS2的β-1,4-內切葡聚糖酶基因(β-1,4-endoglucanase gene,eglS),探明BS2中該基因與定殖的相關性。【方法】以枯草芽孢桿菌BS168基因組為模板擴增組成型啟動子rpsD。依據芽孢桿菌β-1,4-內切葡聚糖酶基因的同源序列設計1對引物,以BS2基因組為模板擴增eglS。將rpsD啟動子基因和eglS片段用T4連接酶連接,并對連接產物進行PCR擴增,得到eglS表達盒片段。將表達盒片段插入穿梭載體pGFP4412用以構建eglS過表達質粒。設計引物擴增eglS的同源重組片段,與具有單交換功能的整合載體pMUTIN-GFP+連接構建敲除質粒。eglS的過表達質粒和敲除質粒轉化芽孢桿菌感受態細胞分別獲得過表達突變體和敲除突變體。將過表達質粒轉化敲除突變體感受態細胞獲得互補突變體。采用熒光顯微鏡觀察、PCR、平板酶活力檢測及實時熒光定量PCR方法鑒定突變體。3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定突變體和野生菌的β-1,4-內切葡聚糖酶活力,同時采用定量灌根接種法檢測不同菌株30 d內在小白菜各組織中的定殖數量。【結果】獲得在熒光顯微鏡下呈現綠色熒光的過表達突變體和互補突變體。PCR檢測結果表明敲除突變體中能夠擴增出675 bp的目的條帶,而以野生菌株和整合載體DNA為模板擴增時沒有對應條帶,成功得到敲除突變體。野生菌及各突變體β-1,4-內切葡聚糖酶平板活力檢測結果顯示,野生菌BS2只有一個水解圈且透明,過表達突變體與互補突變體有大于野生菌的雙水解圈,內圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突變體沿菌體邊緣也有一個小水解圈。實時熒光定量PCR的分析結果證實野生菌及突變體間β-1,4-內切葡聚糖酶基因的表達量存在差異,過表達突變體和互補突變體中β-1,4-內切葡聚糖酶基因的表達量增高,分別是野生菌的111和82倍;敲除突變體中β-1,4-內切葡聚糖酶基因的表達量相對于野生菌BS2幾乎為0。突變體與野生菌在小白菜體內定殖數量以及酶活力檢測結果表明,在相同的小白菜組織以及相同的分離時間內,敲除突變體的定殖數量最少,其在根莖葉中的定殖數量與其他菌株相比均有顯著性差異(P<0.05)。敲除突變體的酶活力也顯著低于其他菌株(P<0.05)。過表達突變體的酶活力以及在小白菜體內的定殖數量在P<0.05水平上顯著高于敲除突變體和野生菌,互補突變體的酶活力和在小白菜體內的定殖數量與過表達突變體基本一致。【結論】內生芽孢桿菌BS2菌株β-1,4-內切葡聚糖酶的活力高低與其在小白菜體內的定殖數量之間呈正相關關系,其表達的β-1,4-內切葡聚糖酶在定殖過程中發揮一定作用。
    鋸角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA克隆、序列分析及原核表達
    付楠霞, 翟楓, 姜鳴, 呂淑敏, 張雅林
    中國農業科學. 2014, 47(2):  273-283.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.007
    摘要 ( 371 )   HTML ( 2 )   PDF (1846KB) ( 491 )   收藏
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    【目的】法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是單萜和倍半萜生物合成途徑分支點的關鍵酶,獲得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)是探究其與斑蝥素生物合成途徑關系的基礎。論文旨在克隆鋸角豆芫菁(Epicauta gorhami Marseul)FPPS,預測該基因及其編碼蛋白的結構、性質與功能,并實現其編碼蛋白的原核表達。【方法】首先根據已知昆蟲FPPS編碼蛋白的保守區序列,利用CODEHOP軟件設計簡并引物,利用RT-PCR獲得鋸角豆芫菁的cDNA模板,巢式PCR擴增鋸角豆芫菁FPPS保守區;隨后根據所得的保守區片段設計特異性引物,運用RACE技術分別克隆鋸角豆芫菁FPPS 3′和5′端序列;然后根據預測的FPPS開放閱讀框(ORF)設計ORF區特異性引物,巢式PCR擴增編碼區序列;最后用DNAMAN拼接獲得鋸角豆芫菁的全長cDNA序列。運用DNAMAN、MEGA 5.05、ProtParam及TargetP 1.1 Server等多種生物信息學軟件對該基因全長cDNA序列、Fps系統進化關系及其基本理化性質、FPPS蛋白的亞細胞定位等進行分析;將鋸角豆芫菁FPPS與pET28a(+)連接,構建原核表達載體pET28a(+)-EgFPPS并將其轉入大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,IPTG誘導融合蛋白的原核表達。分別收集不同誘導時間段的菌液,SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達情況。將高效表達時段收集的菌液超聲波破碎后,分離上清及沉淀并進行煮沸處理,SDS-PAGE檢測融合蛋白的可溶性;Western Blot印跡雜交驗證目的蛋白的表達。【結果】獲得鋸角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全長cDNA序列,命名為EgFPPS (GenBank登錄號KC840040),序列分析結果表明,該基因全長1 857 bp,其中5′非編碼區146 bp,3′非編碼區436 bp,開放閱讀框1 275 bp,共編碼424個氨基酸,其編碼的蛋白分子質量約為49.2 kD,理論等電點pI為8.89,預測分子式為C2192H3457N605O632S25,不穩定系數為38.62,總平均親水系數為-0.429,為疏水的穩定蛋白。序列分析發現,鋸角豆芫菁與其他6種昆蟲FPPS在氨基酸水平上具有72.56%的同源性,且其近N端具有R**S四肽基序,此外還包含7個異戊烯基轉移酶保守區和兩個典型的DD**D的天冬氨酸富含區。系統發育樹顯示鋸角豆芫菁與鞘翅目擬步甲科昆蟲赤擬谷盜進化關系最近。EgFPPS的亞細胞定位進行預測發現其N端具有一段明顯的線粒體靶向肽。原核表達結果表明,該蛋白在終濃度為1 mmol•L-1的IPTG誘導4 h即能實現融合蛋白的高效表達;融合蛋白的可溶性檢測表明該蛋白主要以包涵體的形式存在;Western Blot印跡檢測也證實大腸桿菌DE3中表達了一個分子量約為49 kD的蛋白質,與預測分子量大小基本一致。【結論】成功從芫菁科昆蟲克隆得到FPPS,并成功實現了其編碼蛋白的原核表達,為后期探索其在芫菁科昆蟲體內斑蝥素生物合成途徑中的功能提供理論基礎。
    巢式PCR快速檢測西瓜細菌性果斑病菌
    王婧, 畢陽, 朱艷, 韓舜愈, 祝霞, 盛文軍, 李敏
    中國農業科學. 2014, 47(2):  284-291.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.008
    摘要 ( 308 )   HTML ( 1 )   PDF (579KB) ( 523 )   收藏
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    【目的】建立nested-PCR方法,快速檢測西瓜種子中的燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac),為西瓜細菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,WFB)的防控提供技術支持。【方法】 根據Aac BOX短重復序列的PCR產物設計兩對引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5為外側引物,BX-L1/BX-S-R2為內側引物的nested-PCR,以5 µL樣品處理液于99℃高溫裂解10 min,再放置冰上冷卻5 min,以所釋放病原DNA為模板進行PCR擴增,采用50 μL反應體系:5 μL 10×PCR buffer(25 mmol?L-1 MgCl2),4 μL dNTP (D4030RA,2.5 mmol?L-1),引物(5 μmol?L-1)各3 μL,0.4 μL Taq DNA酶(DR001B,5 U?μL-1),通過退火溫度優化,反應條件為:引物BX-L1/BX-R5各3 μL進行第一輪擴增,95℃,2 min;95℃,30 s;65℃,45s;72℃,1 min;35個循環;72℃,延伸7 min;取擴增后的產物1 μL為模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL進行第二輪擴增,95℃,2 min;95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30個循環,72℃,7 min。在此條件下對梯度Aac菌懸液、模擬帶菌種子提取液進行特異性、靈敏性及重復性檢驗,對不同帶菌率的西瓜種子提取液進行檢測。【結果】引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在檢測不同來源的Aac菌株時都產生了預期大小的片段,并且對其近源種燕麥嗜酸菌卡特萊蘭亞種(A. avenae subsp. cattleyae)、魔芋假單胞菌(A. avenae subsp. konjaci)及其不相關菌株未擴增出目標片段。以BX-L1/BX-R5為外側引物,BX-L1/BX-S-R2為內側引物的nested-PCR,對Aac純菌液和模擬帶菌種子提取液的最低檢測限4.7×101 cfu/mL,比direct-PCR靈敏度高出1 000倍。當西瓜種子帶菌率在0.1%—0.5%時,nested-PCR陽性檢測率為66.7%;當種子帶菌率為1%—10%時,nested-PCR的陽性檢測率為83%—100%。【結論】以BX-L1/BX-R5為外側引物,BX-L1/BX-S-R2為內側引物的nested-PCR方法,能夠快速、高效檢測攜帶微量Aac的西瓜種子,檢測結果重現性高。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    稻田不同供鉀能力條件下秸稈還田替代鉀肥效果
    李繼福1, 魯劍巍1, 任濤1, 叢日環1, 李小坤1, 周鸝1, 楊文兵2, 戴志剛2
    中國農業科學. 2014, 47(2):  292-302.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.009
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    【目的】研究稻田不同土壤供鉀能力條件下,秸稈還田配施鉀肥對水稻產量、地上部鉀素累積量以及鉀肥利用率的影響,為秸稈還田水稻鉀肥合理施用提供科學依據。【方法】2011—2012年在鄂中、江漢平原和鄂東地區的10個縣(市)選擇不同供鉀水平田塊布置水稻試驗。根據湖北省第二次土壤普查制定的速效鉀分級標準,本文將土壤速效鉀含量>150 mg•kg-1的試驗點如鐘祥和宜城歸為高鉀供應能力土壤(1級水平),簡稱為高鉀土壤,標記為High-K;土壤速效鉀含量100—150 mg•kg-1的試驗點如團風、仙桃、洪湖和枝江歸為中鉀供應能力土壤(2級水平),簡稱為中鉀土壤,標記為Middle-K;土壤速效鉀含量<100 mg•kg-1的試驗點如麻城、廣水、鄂州和蘄春歸為低鉀土壤,標記為Low-K。試驗共設6個處理,分別為:(1)CK(-K);(2)+K;(3)+S;(4)S+1/3K;(5)S+2/3K;(6)S+K,其中K和S分別表示鉀肥和還田秸稈,以此來考查當前推薦鉀肥用量(K2O 75 kg•hm-2)對水稻的增產效果以及輪作模式下麥稈或油菜秸稈還田鉀素對鉀肥的替代作用。【結果】結果顯示CK處理(-K),高鉀、中鉀和低鉀土壤的稻谷產量分別為8 372、8 710和7 767 kg•hm-2,施鉀和秸稈還田均可以不同程度地增加水稻產量和地上部鉀素累積量。與CK相比,高鉀、中鉀和低鉀土壤均以秸稈還田配施鉀肥處理的增產效果最顯著,增產量分別為633、1 098和814 kg•hm-2,增幅分別為7.7%、12.6%和12.5%;地上部鉀素累積吸收增量分別為40.2、56.5和49.3 kg•hm-2,增幅分別為15.9%、21.3%和36.8%。在當前推薦鉀肥用量條件下,秸稈還田會造成高鉀土壤的鉀肥吸收利用率下降,但可明顯提高中鉀和低鉀土壤的鉀肥吸收利用率;同時秸稈還田也會顯著降低高鉀土壤的鉀肥農學利用率,但對中鉀和低鉀土壤的鉀肥農學利用率沒有明顯影響。同鉀肥利用率相比,鉀素利用率均有所降低,但中鉀土壤和低鉀土壤的鉀素利用率要顯著高于高鉀土壤的鉀素利用率。通過對秸稈還田條件下鉀肥用量與增產率、地上部鉀素累積增幅的相關性分析得出高鉀土壤和中鉀土壤的推薦鉀肥用量偏高。根據線性加平臺肥效模型擬合得出,在秸稈還田條件下,高鉀土壤田塊(速效鉀含量>150 mg•kg-1)適宜鉀肥用量平均為38.2 kg•hm-2,比推薦用量減少49.1%;中鉀土壤田塊(速效鉀含量100—150 mg•kg-1)適宜鉀肥用量平均為60.0 kg•hm-2,比推薦用量減少20.0%;而低鉀土壤田塊(速效鉀含量<100 mg•kg-1),增產效果顯著,推薦鉀肥用量不足。【結論】因此,短期秸稈還田條件下,高鉀和中鉀土壤田塊,秸稈還田鉀素可不同程度地替代部分化學鉀肥施用;而低鉀供應田塊推薦用量略顯不足,增施鉀肥仍有較大的增產空間。
    紅壤稻田長期施用豬糞的生態效益及承載力評估
    柳開樓, 李大明, 黃慶海, 余喜初, 葉會財, 徐小林, 胡惠文, 王賽蓮
    中國農業科學. 2014, 47(2):  303-313.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.010
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    【目的】有機糞肥還田是實現廢棄物資源循環利用的重要途徑之一,大量研究證實,豬糞還田施用可以顯著提高土壤肥力和作物產量,但是,由于飼料添加劑含有較高的Cu、Zn、As等重金屬元素,再加上養豬業中飼料添加劑的廣泛應用,豬糞長期還田也可能導致土壤中重金屬元素大量累積,從而威脅土壤質量和糧食安全。因此,利用長期定位探討和綜合評價長期施用豬糞下紅壤稻田的生態效益就顯得十分重要。【方法】以始于1981年的紅壤性水稻土有機肥定位試驗為載體,分析了長期施用豬糞30年間紅壤稻田的水稻產量和土壤有機碳含量影響,以期明確豬糞對水稻產量的增產幅度和對土壤有機碳的貢獻潛力,同時分析不同豬糞施用年限(包括試驗前、試驗5年、16年、22年和30年)的土壤重金屬Cu、Zn、Cr和As等含量變化,基于國家土壤質量二級標準(GB 15618—1995)的土壤重金屬含量的臨界值,利用本研究中土壤重金屬的累積速率對紅壤稻田施用豬糞的超標時間進行估算,并進一步探討豬糞的安全用量。【結果】施用豬糞顯著提高了水稻產量和土壤有機碳含量,與施化肥處理(NPK)相比,產量增加了10.3%—12.0%,土壤有機碳含量增加了18.8%—23.7%,但是豬糞施用對紅壤稻田的酸化阻控作用較小。在試驗30年后,分別在早稻和晚稻施用豬糞的處理(OM1和OM2)的土壤pH值與未施肥對照無顯著差異。此外,施用豬糞的土壤Cu、Zn、Cr和As含量亦顯著增加,與施用化肥處理相比,OM1和OM2的Cu、Zn、Cr和As含量分別增加了72.0%—82.6%、29.1%—55.2%、194.8%—262.6%和90.5%—192.7%,但是未超過國家土壤環境質量二級標準(GB15618-1995)。按照現行豬糞施用量(22.5 t•hm-2•a-1)推算,土壤Cu、Zn、Cr和As含量確保安全水平的施用時間分別還有22、67、44和14年。若確保連續施用豬糞50年土壤Cu、Zn、Cr和As含量不超標,則紅壤稻田每公頃最多豬糞施用量應不超過6.40 t•hm-2•a-1。【結論】在紅壤稻田上,豬糞長期還田雖然能夠顯著提高稻米產量和土壤肥力(尤其是土壤有機碳含量),但也同時導致土壤Cu、Zn、Cr和As含量大幅增加,從而可能引起土壤出現重金屬污染風險,進而威脅稻米質量和人類安全。因此,權衡稻田長期施用豬糞對作物產量、土壤肥力和重金屬累積的生態效益,確定土壤對豬糞的最大環境承載力將為科學合理的利用豬糞以實現區域農業的可持續發展提供依據。
    控釋肥和添加劑對雙季稻溫室氣體排放影響和減排評價
    王斌, 李玉娥, 萬運帆, 秦曉波, 高清竹
    中國農業科學. 2014, 47(2):  314-323.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.011
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    【目的】稻田生態系統的溫室氣體排放一直是氣候變化領域的研究熱點,對發展低碳農業和緩解全球變暖具有重要意義。研究控釋肥和添加劑對雙季稻(Oryza sative L)溫室氣體排放和產量的影響,旨在綜合評價其減排效果,篩選既能保證產量又能有效減排的施肥措施。【方法】以華中江漢平原地區雙季稻為研究對象,設置6種不同控釋肥或添加劑處理,包括①習慣施肥作為對照,②硫包膜控釋尿素,③樹脂包膜控釋尿素,④緩釋碧晶尿素,⑤尿素中加入質量分數1%的硝化抑制劑二甲基吡唑磷酸鹽(DMPP),⑥施肥時潑灑與尿素等量的1:200倍稀釋有效微生物菌劑培養液(EM菌劑),采用自動靜態箱-氣相色譜法對溫室氣體排放通量進行長期連續監測,同步觀測土壤無機氮素和產量,得出不同施肥處理的溫室氣體(CH4和N2O)排放特征,由內插加權法求得排放總量,最終計算出綜合溫室效應和排放強度。【結果】不同施肥處理下CH4和N2O排放通量具有較為明顯的季節變化規律。早稻CH4排放總量以樹脂包膜控釋尿素最低,晚稻以碧晶尿素最低;而早稻和晚稻N2O排放總量均以硝化抑制劑DMPP最低。綜合兩個季節,各施肥處理的綜合溫室效應(以CO2當量100年算)差異顯著(P<0.05),其中常規施肥>硫包膜控釋尿素>硝化抑制劑DMPP>EM菌劑>碧晶尿素>樹脂包膜控釋尿素;控釋肥和添加劑處理對比常規均有不同程度的減排效果,其中樹脂包膜控釋尿素減排效果最高為56.2%,碧晶尿素次之為45.6%,且晚稻減排效果明顯高于早稻。早稻控釋肥和添加劑處理產量與常規施肥差異不顯著,晚稻則存在顯著增產,增產幅度為13.5%—16.2%。各處理的溫室氣體排放強度GHGI以樹脂包膜控釋尿素最低,與常規施肥差異極顯著(P<0.01)。【結論】雙季稻不同施肥處理CH4和N2O的排放總量差異顯著,控釋肥和添加劑處理均能達到不同程度的減排。控釋肥和添加劑處理對早稻增產效果差異不顯著,對晚稻增產效果差異顯著,減排效果也高于早稻。綜合考慮經濟效益和減排效果,可得出在當前的稻田管理條件下施用包膜控釋肥、抑制劑和生物菌劑,能保證產量并有效降低溫室氣體排放,是水稻低碳高產可行的施肥措施。
    產芽孢木質素降解菌MN-8的篩選及其對木質素的降解
    李紅亞, 李術娜, 王樹香, 王全, 朱寶成
    中國農業科學. 2014, 47(2):  324-333.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.012
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    【目的】分離、篩選產芽孢的高效木質素降解細菌,并進一步研究其對木質素的降解作用,為木質素微生物降解規模化應用提供理論依據。【方法】采用苯胺藍(Azure-B)變色圈法,結合木質素降解酶活力測定從牛糞中分離篩選出產芽孢的木質素降解菌。通過形態特征觀察、生理生化試驗、16S rDNA以及gyrB序列分析對其中活性最強的菌株進行種屬鑒定。利用菌株進行玉米秸稈堆積發酵,監測發酵過程中木質素過氧化物酶(LiP)酶活力、錳過氧化酶(MnP)酶活力以及玉米秸稈中木質素含量的變化,考察菌株對玉米秸稈木質素的降解作用。利用氣相色譜-質譜聯用(GC/MS)方法對菌株發酵后玉米秸稈中的木質素降解產物進行分析,推測菌株對木質素的降解機制。【結果】分離篩選到一株活性較高的產芽孢的木質素降解細菌MN-8,經形態特征觀察、生理生化試驗以及16S rDNA序列分析,鑒定菌株MN-8屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。利用16S rDNA序列分析發現MN-8菌株與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)同源性均高于99%。而基于gyrB序列構建的系統發育樹顯示,該菌株與解淀粉芽孢桿菌同源性最高,為99%。因此確定MN-8菌株為解淀粉芽孢桿菌。在玉米秸稈堆積發酵16 d后木質素降解率可達24%;發酵的6—8 d及10—12 d 兩個階段內,分別出現MnP酶活力及LiP的產酶高峰期,相對應兩個階段內秸稈木質素的降解最為顯著;GC/MS分析顯示菌株MN-8可將玉米秸稈中木質素降解成4-羥基-3,5二甲氧基苯乙酮等芳香族類化合物及短鏈脂肪酸類等小分子物質。【結論】高效木質素降解菌解淀粉芽孢桿菌MN-8可以通過斷裂木質素單體之間的連接鍵β-O-4,高效降解秸稈木質素成為小分子芳香族化合物等物質,且其對秸稈木質素的降解依賴于LiP及MnP的產生。
    園藝
    野生‘龍門香橙’的植物學特征觀察及起源研究
    曾繼吾, 姜波, 吳波, 鐘云, 程春振, 母紅娜, 甘廉生, 彭成績, 鐘廣炎, 易干軍
    中國農業科學. 2014, 47(2):  334-343.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.013
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    【目的】廣東省龍門縣境內南昆山主峰天堂頂海拔1 000 m處有當地稱之為‘龍門香橙’的野生柑橘,論文擬從形態學和DNA分子證據上探討其與已知柑橘資源的異同,為合理利用該資源奠定基礎。【方法】實地調查‘龍門香橙’的生長環境,觀察記錄葉、花、果實的形態特征。分析果實的可溶性固形物、糖、酸和抗壞血酸含量。在電子顯微鏡下觀察花粉的顯微特征。對比分析包括‘龍門香橙’在內的24個柑橘資源的AFLP圖譜以及10個資源的8個SNP位點的基因型。克隆、測序分析‘龍門香橙’的β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase,CHX)基因的2個等位基因,并與其他柑橘材料的CHX基因序列進行比對。【結果】生境調查結果表明‘龍門香橙’非人工種植,是真正的野生柑橘。其果實、種子的形狀和單胚等特征與柚類相似,但果實與柚相比明顯偏小、出汁率與可食率很低、味苦等性狀提示其比較原始。葉片形狀、線形翼葉、花絲聯合等特征類似寬皮柑橘類,比較進化;但花絲和新葉染有紫紅色等性狀則比較原始。基于AFLP圖譜的聚類分析顯示其不與其他研究材料聚類,但介乎橘柚之間。8個SNP分子標記分析結果顯示,‘龍門香橙’的3個SNP位點為寬皮柑橘純合基因型,1個位點為橘柚雜合基因型,其余4個位點為柚子純合基因型,這種基因型組合不同于其他任何所分析的材料。‘龍門香橙’的CHX基因的核苷酸序列顯示其2個等位基因間相互差異較小,且含有其他已知柑橘CHX基因上未發現的SNP。CHX基因序列進化分析結果表明其與其他柑橘的遺傳距離較遠、差異似達種間水平。【結論】‘龍門香橙’是一個真正的野生柑橘資源。其形態性狀兼具原始與進化特征。在DNA分子水平上,‘龍門香橙’與已知柑橘不同,甚為獨特。
    核桃NBS類抗病基因類似物的序列特征及其與炭疽病的抗性
    安海山1, 楊克強1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(2):  344-356.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.014
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    【目的】利用同源序列法分離核桃的NBS(Nucleotide binding site)類抗病基因類似物,為核桃抗炭疽病分子輔助育種及抗病基因的克隆提供基礎。【方法】以35個核桃優系為試材,利用接種法鑒定供試材料對炭疽病的抗性;根據已知植物抗病基因的保守結構域P-loop和GLPL設計簡并引物,以核桃優系的基因組DNA為模板,通過PCR擴增NBS類抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS類抗病基因類似物與核桃優系炭疽病抗性的關系;利用BLASTN/X程序對所得NBS序列在GenBank數據庫中進行同源性搜索;利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等軟件對其進行序列相似性分析和系統進化研究。【結果】35個供試核桃優系中,有20個優系為抗炭疽病類型(R),其相對抗性指數在0.63—0.82;有5個優系為中抗類型(M),相對抗性指數在0.27—0.56;有10個為感病類型(S),相對抗性指數在0.00—0.21。PCR結果顯示,從20個抗炭疽病優系的基因組擴增得到20條NBS類抗病基因類似序列;而在其它15個優系(5個中抗優系和10個感病優系)中未擴增到條帶,表明核桃NBS序列與炭疽病抗性相關聯。BLASTN顯示,所得NBS序列在核苷酸水平與GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89%—100%同源性,與其它物種NBS序列的同源性在69%以上;BLASTX顯示,所得NBS序列與已知核桃NBS抗病蛋白同源性為77%—99%,與其它物種的NBS抗病蛋白同源性在49%—66%。氨基酸序列多重比對分析表明,所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域,如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等,在典型功能域的核苷酸多態性(Pi)明顯低于非保守區,有較高保守性。系統發育分析表明,在核苷酸水平上可將所得核桃優系的NBS序列區分為7類,在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR兩大類7個亞類;所得核桃NBS序列非同義替換率(dN)和同義替換率(dS)的比值dN/dS在0.00—0.95,為純化選擇。氨基酸序列相似性表明核桃優系不同NBS亞類間的相似度為28.3%—63.5%,與已知抗病基因相應區域的氨基酸相似性為22.0%—48.5%。【結論】核桃NBS類抗病基因類似物與炭疽病抗性相關聯,NBS序列與其他物種抗病基因有較高同源性,包含抗病基因保守的功能域,在進化上為純化選擇。
    加工番茄品種多性狀綜合評價方法研究
    韓澤群, 姜波
    中國農業科學. 2014, 47(2):  357-365.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.015
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    【目的】確定加工番茄品種多性狀評價指標,建立加工番茄農藝性狀的綜合評價體系,為鑒定、篩選其優良種質資源提供決策支持。【方法】通過2012年新疆某試驗田的22種(系)加工番茄的品比試驗,分析、測定22個加工番茄品種(系)的單果重(FW)、平均產量(AY)、番茄紅素(L)、可溶性固形物(TSS)、總酸(TA)、總糖(TS)、糖酸比(SAR)、病毒病抗性(VDR)、縱徑(VD)、橫徑(TD)、果形指數(FSI)、色差(CR)、單果耐壓力(SFRP)、平均株距寬(ASW)、平均株高(APH)、平均分枝數(ANB)、生育期(GP)17項農藝性狀,并聯合使用主成分分析和聚類分析(PCA-CA) 經Matlab.2012a軟件編程實現對樣本數據的處理,并對加工番茄主要農藝性狀進行綜合分析。【結果】17項農藝性狀的平均變異系數為18.54%,病毒病抗性的變異系數最大,為88.42%;色差的變異系數最小,僅為7.33%,加工番茄評價指標變量之間既相對獨立又密切相關。運用主成分分析法,將17個評價指標變量壓縮成6個綜合指標(前6個主成分累計貢獻率達86.0369%,已反映出17項性狀指標的大部分信息),經分析6個主成分的函數式中對應的17項農藝性狀系數值可將17項農藝性狀歸納為果實性狀因子、果實內在品質因子、果實外觀品質因子、產量因子、抗病因子這5個主要指標,這5個指標可以較準確的評價番茄品種。其中,單果耐壓力、單果重、總酸、番茄紅素、縱徑、橫徑、平均產量、病毒病抗性8個性狀是主要性狀。通過采用類平均法對22個不同番茄品種進行Q型聚類分析,在歐式距離為6.40時將所有番茄品種劃分為3個類群。【結論】采用多元統計分析方法中的主成分分析和聚類分析對22個加工番茄品種(系)的17項農藝性狀建立加工番茄綜合評價體系是可行的,可從不同的視角給予較全面、客觀的評價與分析,為加工番茄優質品種的選育提供參考依據。
    秸稈和生物質炭對蘋果園土壤容重、陽離子 交換量和氮素利用的影響
    葛順峰, 彭玲, 任飴華, 姜遠茂
    中國農業科學. 2014, 47(2):  366-373.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.016
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    【目的】中國蘋果園土壤有機碳含量較低,氮肥施用量偏高。本研究為蘋果生產上合理應用秸稈和生物質炭來提高土壤緩沖性能和氮肥利用效率提供依據。【方法】以兩年生富士/平邑甜茶為試材,采用15N標記示蹤技術,研究添加秸稈和生物質炭對土壤容重、陽離子交換量、植株生長及氮素轉化(樹體吸收、氨揮發、N2O排放和土壤殘留)的影響。試驗共設4個處理:對照(CK)、單施氮肥(N)、施用氮肥并添加生物質炭(N+B)和施用氮肥并添加秸稈(N+S)。【結果】不同處理的土壤容重在0—5 cm和5—10 cm兩個土層中的變化趨勢一致。CK與N處理間差異不顯著,但均顯著高于N+B和N+S處理;兩個添加外源碳的處理間,N+B處理的土壤容重顯著低于N+S處理。與N處理相比,N+S和N+B處理的0—5 cm和5—10 cm兩個土層的容重分別降低了0.06、0.09 g•cm-3和0.07、0.11 g•cm-3。與CK(18.32 cmol•kg-1)和N(19.61 cmol•kg-1)處理相比,N+S(22.27 cmol•kg-1)和N+B處理(25.35 cmol•kg-1)顯著提高了0—10 cm土層土壤陽離子交換量,并且以N+B處理效果較好。3個施氮處理間植株總干重、15N積累量和15N利用率均以N+B處理最高,N+S處理次之,N處理最低。與CK相比,3個施氮處理(N、N+S和N+B處理)的氨揮發量均顯著增加。與N處理相比,添加外源碳的兩個處理(N+S和N+B處理)顯著減少了氨揮發損失量,以N+B處理減少幅度最大。與CK相比,3個施N處理(N、N+S和N+B處理)的N2O排放量均顯著增加,以N+B處理最高,其次為N+S處理,N處理最低,可見添加外源碳的兩個處理的N2O排放量均有所增加,但3個施氮處理間差異不顯著。去掉CK本底值后,N、N+S和N+B處理的氮素總氣態損失量(氨揮發+N2O排放)占施氮量的比例分別為6.54%、4.33%和3.04%。可見,添加秸稈和生物質炭顯著降低了氮素氣態損失,以N+B處理效果較好。耕層土壤(0—50 cm)的15N殘留量以N+B處理最高,N+S處理次之,N處理最低;而深層土壤(50—100 cm)則以N處理最高,N+S處理次之,N+B處理最低。3個施氮處理間,N回收率(樹體吸收+土壤殘留)以N+B處理最高,為42.26%,其次為N+S處理(37.22%),N處理最低(31.54%);N損失率以N處理最高,為68.46%。其次為N+S處理(62.78%),N+B處理最低(57.74%)。【結論】添加秸稈和生物質炭顯著降低了土壤容重,提高了土壤陽離子交換量,促進了蘋果植株生長和對肥料氮的吸收,增加了土壤對氮的固定,減少了氮肥的氣態損失,提高了氮肥利用率,其中以添加生物質炭的效果較好。
    貯藏·保鮮·加工
    富硒米糠蛋白的優化制備及其蛋白營養復配研究
    胡秋輝1, 2, 陳曦1, 方勇1, 2, 陳悅1, 楊文建1, 馬寧1, 趙立艷2
    中國農業科學. 2014, 47(2):  374-382.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.017
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    【目的】優化堿法提取富硒米糠蛋白的條件,根據蛋白質互補作用原理,研究并評價富硒米糠蛋白(RBP)的營養復配。【方法】堿法提取富硒米糠蛋白,按正交試驗L9(34)優化富硒米糠蛋白的提取條件。將富硒米糠蛋白與大豆分離蛋白(SP)按比例60%、70%、80%、90%和100%進行復配,用凱氏定氮法、氫化物原子熒光光譜法和便攜式色差儀分別測定富硒米糠蛋白和復配蛋白中的蛋白質含量、硒含量和色差值。利用高速氨基酸分析儀測定各蛋白產品的氨基酸含量,并根據必需氨基酸參考模式(WHO/ FAO)和氨基酸比值系數法,對各蛋白產品進行營養價值評價,得出營養價值最高的復配蛋白。【結果】通過正交試驗考察富硒米糠蛋白的提取率、硒含量和富硒米糠蛋白的色差值,獲得富硒米糠蛋白最佳提取條件為:料液比1﹕20、NaOH 濃度0.08 mol•L-1、溫度30℃和時間3 h,富硒米糠蛋白純度為(80.2±1.1)%,硒含量為(0.269±0.132)mg•kg-1,蛋白色差值為69.7±1.2,將此最優條件下提取出的富硒米糠與普通米糠蛋白產品的蛋白質和硒含量分別進行比較,結果表明,富硒米糠與普通米糠的蛋白質含量、富硒米糠蛋白與普通米糠蛋白的蛋白質含量都無顯著性差異(P<0.01),而富硒米糠的硒含量為(0.401±0.021)mg•kg-1,顯著高于普通米糠硒含量(0.023±0.010)mg•kg-1(P<0.01),同時富硒米糠蛋白的硒含量為(0.269±0.132)mg•kg-1,也顯著高于普通米糠蛋白硒含量(0.052±0.011)mg•kg-1(P<0.01)。將富硒米糠蛋白與大豆分離蛋白(SP)按照不同比例進行營養復配,比較不同復配蛋白產品的蛋白純度和硒含量,得出富硒米糠蛋白和各復配蛋白的硒含量均顯著高于大豆分離蛋白硒含量(0.013±0.005)mg•kg-1,不同配比的復配蛋白硒含量隨富硒米糠蛋白含量增加從(0.141±0.014)mg•kg-1增加至(0.269±0.032)mg•kg-1。根據必需氨基酸參考模式,采用氨基酸比值系數法評價各蛋白產品營養價值,根據比值系數分(SRC)富硒米糠蛋白和各復配蛋白的營養價值按高低順序排列如下:60% RBP > 70% RBP > 50% RBP > 80% RBP > 90% RBP > RBP,結果表明,各復配蛋白SRC值均高于RPB的SRC值64.1,由此證明各復配蛋白營養價值均高于RBP,其中含60%富硒米糠蛋白的復配蛋白具有最高的營養價值,且其硒含量為(0.167±0.024)mg•kg-1,蛋白純度為(84.1±0.8)%。【結論】將大豆蛋白與富硒米糠蛋白進行復配可提高蛋白的營養價值,獲得一種含豐富微量元素硒的高品質蛋白。
    油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優化及降解產物分析
    丁艷1, 李麗倩1, 曹蓉2, 唐根勝2, 顧振新1, 韓永斌1
    中國農業科學. 2014, 47(2):  383-393.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.018
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    【目的】研究影響油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷在黑芥子酶作用下定向轉化為異硫氰酸酯的因素,確定最佳酶解條件,探索外加黑芥子酶對硫代葡萄糖苷降解產物組分和含量的影響,為油菜籽餅粕的綜合利用提供基礎。【方法】測定4種反應體系中黑芥子酶活性,確定酶解反應緩沖體系。以油菜籽餅粕中異硫氰酸酯總量為指標,單因素結合正交設計研究不同料液比、時間、溫度、pH、抗壞血酸添加量對外加黑芥子酶降解油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷轉化為異硫氰酸酯的影響,優化工藝參數,獲得最佳酶解條件。采用二氯甲烷為提取劑,真空濃縮得到油狀降解產物,利用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用鑒定外加黑芥子酶和內源黑芥子酶酶解產物成分,分析產物相對含量。【結果】4種緩沖體系中,在檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中測得黑芥子酶活性最高,在相同條件下,外加黑芥子酶的活性顯著高于內源黑芥子酶活性;外源黑芥子酶添加量大于油菜籽餅粕量的20%,異硫氰酸酯生成量無顯著增加,選擇外源黑芥子酶添加量為油菜籽餅粕量的20%;正交優化得到最佳酶解條件為:料液比1﹕15,pH為6.0,反應溫度為50℃,抗壞血酸添加量為0.005 mg•g-1,反應時間為1 h,異硫氰酸酯含量達到1.799 mg•g-1,是油菜籽餅粕內源黑芥子酶降解硫代葡萄糖苷生成異硫氰酸酯產物總量的7.6倍。外加黑芥子酶生成異硫氰酸酯含量顯著高于內源黑芥子酶降解硫苷生成異硫氰酸酯含量,但兩者異硫氰酸酯含量隨反應條件變化趨勢一致。GC-MS鑒定外加黑芥子酶有7種酶解產物,相對含量在產物的67%以上,含有1種腈類,2種噁唑烷酮和4種異硫氰酸酯。產物中異硫氰酸酯為烯丙基異硫氰酸酯、丁烯基異硫氰酸酯、環戊基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯;其中丁烯基異硫氰酸酯的含量最高,占酶解產物總量的26.77%。腈類產物為苯丙腈;2種噁唑烷酮為致甲狀腺腫素和2,1-苯丙噁唑烷酮。內源黑芥子酶降解硫代葡萄糖苷的產物中檢測到4種產物且含量相對較少。【結論】外加黑芥子酶能有效增加油菜籽餅粕中異硫氰酸酯生成量,確定了油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷的最佳降解條件。鑒定出降解產物的主要成分,異硫氰酸酯有4種,其中丁烯基異硫氰酸酯含量最高。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎兒成纖維細胞中的表達
    鄧彥飛, 劉慶友, 鄧海瑩, 羅嬋, 楊素芳, 石德順
    中國農業科學. 2014, 47(2):  394-402.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.019
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    【目的】轉錄因子Oct4、Nanog是調節干細胞多能性相關的轉錄因子,在干細胞的分化和胚胎發育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白結構、構建逆轉錄表達載體,并在水牛體細胞中表達,為進一步研究其在水牛早期胚胎發育中的作用,以及為建立水牛胚胎干細胞系和誘導多能干細胞系(iPSC)奠定基礎。【方法】分別從水牛生殖嵴和體細胞中提取RNA和DNA,將RNA反轉錄成第1鏈cDNA,參照牛基因序列(Oct4:NM_174580,Nanog:NM_001025344)設計特異性引物,采用RT-PCR和PCR分別擴增Oct4和Nanog的編碼區序列(the coding sequences,CDS)和DNA全長序列,其中Oct4全長DNA分3段擴增,Nanog全長DNA分2段擴增;利用生物在線分析軟件對水牛Oct4和Nanog進行蛋白質結構預測和同源性比對;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ雙酶切,T4連接酶,將Oct4和Nanog的CDS連接到逆轉錄病毒載體pMX上,構建逆轉錄表達載體pMX-Oct4和pMX-Nanog;采用組織塊法培養水牛胎兒成纖維細胞(buffalo fetal fibroblasts,BFFs),逆轉錄表達系統經過病毒包裝后產生的病毒上清液感染BFFs,感染12—15h后,繼續培養48 h;通過RT-PCR和免疫熒光技術檢測轉基因在BFFs中的表達情況。【結果】Oct4 CDS全長1 083 bp,編碼361個氨基酸,DNA全長4 509 bp,包括5個外顯子和4個內含子;Nanog CDS全長903 bp,編碼301個氨基酸,DNA全長4 473 bp,包括4個外顯子和3個內含子;將Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登錄號分別為JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列與牛、豬、人和鼠相應氨基酸的同源性分別為98%、96%、91%和81%,Nanog氨基酸序列與牛、豬、人和鼠相應氨基酸的同源性分別為90%、81%、69%和47%;Oct4和Nanog蛋白結構與小鼠相應蛋白的結構相似,分別含有本家族特有的POU結構域和HOX同源結構域;成功構建表達Oct4和Nanog的逆轉錄病毒載體pMX-Oct4和pMX-Nanog;逆轉錄病毒系統pMX介導的Oct4和Nanog基因能轉入BFFs中,在mRNA水平和蛋白水平都表達,陰性對照中不表達。【結論】分別克隆了水牛Oct4和Nanog的DNA序列全長和CDS,其基因序列和氨基酸序列在物種間高度保守;逆轉錄病毒轉基因方法將Oct4和Nanog基因成功地轉入BFFs并表達。逆轉錄病毒系統介導目的基因表達的轉基因方法可以應用于水牛轉基因研究和水牛iPSC生產。
    C型尿鈉肽在動物卵巢表達及對生殖機能影響的研究進展
    賈振偉
    中國農業科學. 2014, 47(2):  403-410.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.020
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    C型尿鈉肽(C-type natriuretic peptide, Cnp)為尿鈉肽家族成員之一,廣泛分布于動物大腦、腎臟、心臟及血管等組織,具有維持心血管系統功能穩態、調控細胞增殖及促進骨骼生長等功能。普遍認為哺乳動物有3種鈉尿肽受體(Natriuretic peptide receptor, NPR) :NPR1,NPR2和NPR3。Cnp主要通過結合NPR2受體激活下游信號通路,發揮生物學作用。Cnp信號傳導通路的組成成分主要包括:配體(Cnp)、跨膜受體(NPR2)及cGMP等。當Cnp分子與跨膜受體NPR2結合后,使受體的激酶同型區域(kinase homology domain, KHD)構象發生變化,進而激活鳥苷酸環化酶,將GTP轉化為cGMP后激活下游信號通路。目前,許多研究表明Cnp及受體在雌性動物卵巢上表達模式相似,Cnp主要在卵泡壁層顆粒細胞上表達,NPR2受體主要在卵丘顆粒細胞上表達。另外,動物體內卵泡生長期間,Cnp和受體Npr2表達受激素調控,FSH通過雌激素介導促進卵泡顆粒細胞Cnp和受體Npr2表達;同時卵母細胞通過分泌卵母細胞分泌因子促進了顆粒細胞Npr2表達。LH可能通過表皮生長因子信號通路降低卵泡顆粒細胞Cnp和受體Npr2表達。值得注意的是,研究表明Cnp與FSH功能類似能夠促進動物卵泡發育,有利于卵丘顆粒細胞的形成,并能誘導一些與卵泡成熟和類固醇合成相關的顆粒細胞基因表達,揭示卵泡顆粒細胞分泌的Cnp與FSH具有類似的功能,作用于顆粒細胞上的受體分別經由cGMP和cAMP的信號通路影響顆粒細胞基因表達,刺激卵泡生長,促進卵母細胞成熟。另外,近年研究揭示Cnp是動物體內維持卵母細胞減數分裂阻滯的關鍵物質,卵泡壁層顆粒細胞分泌的Cnp,作用于卵丘顆粒細胞上的受體NPR2,激活鳥甘酸環化酶后將cGTP轉化為cGMP,cGMP進入卵母細胞后抑制磷酸二酯酶phosphodiesterase, PDE)的活性,維持卵母細胞內高水平的cAMP,卵母細胞內高水平的cAMP通過激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)使成熟促進因子(maturation promoting factor, MPF)的催化亞基磷酸化,進而抑制MPF的活性、維持減數分裂阻滯,但對裸卵沒有影響,說明Cnp通過作用卵丘顆粒細胞間接影響卵母細胞減數分裂成熟。此外,研究表明Cnp體外前處理卵丘卵母細胞復合體,有利于卵母細胞胞質成熟,提高了成熟受精后的發育能力。綜上,動物體內卵泡生長期間,卵巢內產生的Cnp可能通過影響顆粒細胞的正常功能,在維持卵母細胞減數分裂阻滯的同時促進胞質成熟,保證成熟受精后具有較高的發育能力。基于此,Cnp在用作生理性的減數分裂阻滯劑增強家畜卵母細胞體外發育方面將具有重要的應用前景。因此,論文綜述了Cnp結構、信號轉導通路、在動物卵巢上表達及對卵巢生殖機能的影響。
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