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當期目錄

    2014年 第47卷 第4期 刊出日期:2014-02-15
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    磷轉運蛋白基因TaPHT2;1在染色體上定位 及對小麥磷素吸收和利用效率的影響
    郭麗1, 郭程瑾1, 路文靜2, 李小娟2, 肖凱1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  613-621.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.001
    摘要 ( 290 )   HTML ( 1 )   PDF (528KB) ( 523 )   收藏
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    【目的】以中國春遺傳背景的整套B染色體雙端體為材料,鑒定磷轉運蛋白基因TaPHT2;1的染色體定位特征。解析不同供磷水平下,上述材料和不同磷利用效率小麥品種該基因的表達特征及其與植株干物質生產能力和磷效率特征的聯系。【方法】采用溶液培養法水培中國春(CS)及該品種遺傳背景的整套B染色體組雙端體和不同磷效率小麥品種材料。以B染色體組供試端體為材料進行TaPHT2;1 PCR擴增,鑒定TaPHT2;1在染色體上的定位。采用半定量RT-PCR及qRT-PCR技術分析B染色體組供試端體和小麥品種TaPHT2;1的表達水平。采用常規分析技術,測定供試材料單株干重和磷吸收參數。【結果】①PCR檢測發現,在CS及所有供試B染色體組雙端體材料中,除缺失1B長臂的1BS外,其它所有材料均能特異擴增出目標基因TaPHT2;1,表明TaPHT2;1定位在1B長臂。②豐、缺磷條件下,TaPHT2;1在CS及除1BS外雙端體根、葉中的表達均表現為葉片優勢表達特征,且在葉片中表達受到低磷脅迫的誘導。TaPHT2;1在根系中的表達不受低磷逆境調控。表明TaPHT2;1在介導豐磷下磷素吸收、轉運及增強低磷下植株體內磷素再度調運中可能發揮重要功能。③豐磷條件下,與CS相比,1BS的單株干重和全磷含量顯著降低;缺磷條件下,1BS的單株干重與CS相比也顯著下降,但全磷含量增加。表明位于1B染色體長臂后的磷轉運蛋白基因TaPHT2;1,對豐、缺磷條件下的植株磷素吸收、轉運具有較大影響,進一步對不同供磷水平下的植株干重產生重要調控效應。④豐磷條件下,與CS相比,1BS的單株磷累積量顯著增加,磷利用效率沒有改變;缺磷條件下,與CS相比,1BS的單株磷累積量沒有變化,磷利用效率顯著降低。不同磷利用效率品種相比,豐磷條件下,隨著品種磷利用效率提高,葉片中TaPHT2;1的表達水平、單株干重、全磷含量和單株磷累積量也隨著增加;缺磷條件下,隨著小麥品種磷利用效率提高,葉片中TaPHT2;1的表達水平、單株干重和磷利用效率也隨之增高,但全磷含量呈下降趨勢,單株磷累積量品種間差異較小。因此,TaPHT2;1的表達水平與小麥品種豐、缺磷條件下的磷素吸收、利用和干物質積累能力具有緊密聯系。【結論】小麥磷轉運蛋白基因TaPHT2;1位于1B染色體長臂。該基因通過其特定對外界供磷水平產生應答,在較大程度上調控植株的磷素吸收和利用能力,對不同供磷水平下的植株干重產生重要影響。TaPHT2;1在調控植株豐磷下磷素吸收和低磷下磷素利用中發揮重要作用,可作為鑒定小麥品種磷效率的評價指標。
    紫花苜蓿鹽誘導HD-Zip類轉錄因子MsHB2的克隆及功能分析
    李明娜1, 2, 龍瑞才1, 楊青川1, 2, 沈益新2, 康俊梅1, 張鐵軍1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  622-632.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.002
    摘要 ( 321 )   HTML ( 2 )   PDF (1081KB) ( 718 )   收藏
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    【目的】在已有的一條紫花苜蓿(Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1)鹽誘導未知基因的EST序列基礎上,克隆其(MsHB2)全長序列并分析其功能,以進一步了解其在紫花苜蓿中的耐鹽調控機理。【方法】以先前獲得的EST序列為基礎設計引物,使用RACE法從紫花苜蓿中克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列,經DNAMAN軟件拼接后得到其全長序列。使用多種生物信息學軟件對MsHB2的開放閱讀框,編碼蛋白等電點、分子量、疏水性、亞細胞定位、進化關系等進行預測分析。構建MsHB2的亞細胞定位瞬時表達載體,使用基因槍轉化法將MsHB2與GFP在洋蔥表皮細胞中融合瞬時表達并觀察其亞細胞定位熒光信號。將生長30 d的中苜一號分別進行300 mmol?L-1 NaCl和0.1 mmol?L-1 ABA脅迫處理,取脅迫處理0、2、4、10、24 h后的根和莖葉組織提取總RNA并進行熒光定量PCR分析。構建了MsHB2的植物超表達載體,轉化農桿菌GV3101菌株,使用農桿菌花序侵染法轉化擬南芥并在鹽脅迫條件下對轉基因株系進行相關表型分析。【結果】將RACE法克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列拼接后得到1 126 bp的全長序列,序列分析表明,其編碼蛋白包含247個氨基酸,具有一個同源異型結構域和一個亮氨酸拉鏈結構域,與擬南芥HD-Zip第I類轉錄因子ATHB12具有較高相似性。進化樹聚類分析表明MsHB2屬于第Ⅰ類同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白。洋蔥亞細胞定位分析表明MsHB2定位于細胞核。轉錄水平表達分析表明MsHB2受300 mmol?L-1 NaCl和0.1 mmol?L-1 ABA脅迫誘導而表達量顯著升高。轉基因研究表明在NaCl和ABA脅迫下,過量表達MsHB2的轉基因擬南芥表現比野生型擬南芥更敏感。【結論】從紫花苜蓿中克隆得到一個定位于細胞核的同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白基因MsHB2,其在紫花苜蓿中受NaCl和ABA脅迫誘導,并在NaCl和ABA脅迫條件下抑制轉基因擬南芥的生長。推測MsHB2可能通過ABA信號途徑參與紫花苜蓿鹽脅迫應激調控,并在鹽脅迫等非生物脅迫下對紫花苜蓿的抗逆性起負調控作用。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    補充灌溉和施氮對玉米籽粒淀粉粒粒度分布的影響
    石德楊1, 2, 張海艷1, 3, 董樹亭2, 3
    中國農業科學. 2014, 47(4):  633-643.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.003
    摘要 ( 310 )   HTML ( 1 )   PDF (636KB) ( 562 )   收藏
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    【目的】淀粉粒粒度分布是評價淀粉品質的一個重要因素,環境因素對淀粉粒粒度分布的影響較大,水分和氮肥是玉米高產優質栽培中的主要農藝措施。因此,明確補充灌溉和施氮對玉米籽粒淀粉粒粒度分布特征的影響及其與淀粉糊化特性、粒重和淀粉組分之間的關系,能為玉米淀粉品質調控提供理論依據,也有利于玉米淀粉的定向加工利用。【方法】以鄭單958為供試材料,設置雨養(W1)與補充灌溉(W2)兩個水分處理,其中補充灌溉處理以土壤含水量是否低于田間持水量的60%來確定是否灌水,以灌水后土壤含水量達到田間持水量的80%來確定灌水量,其計算公式為m=10ρbH(?i-?j),式中m為補灌量(mm),H為該時段補充灌溉深度(cm),ρb為補充灌溉深度土壤容重(g•cm-3),βi為目標含水量(田間持水量×目標相對含水量),βj為自然含水量;按每生產100 kg籽粒耗氮3 kg,在67 500 株/hm2種植密度下產量達10 500 kg•hm-2的標準設計最高氮肥處理,即設0(N1)、160(N2)、320(N3)kg•hm-2 3個氮肥處理。采用激光衍射粒度分析儀測定成熟期玉米籽粒淀粉粒體積、數目和表面積分布特性,借助RVA儀測定淀粉糊化特性,采用雙波長法測定淀粉組分含量,并對淀粉粒體積分布與糊化特性、粒重、產量及淀粉組分做相關性分析。【結果】玉米籽粒淀粉粒粒徑分布范圍為0.38—39.78 μm,其上限介于30.07—39.78 μm。淀粉粒的體積和表面積表現為三峰分布,參照小麥研究中以雙峰曲線凹處為分界線的分類方法,以3.5 μm和7.4 μm為界線,將玉米淀粉粒分為小型(<3.5 μm)、中型(3.5—7.4 μm)和大型(>7.4 μm)三類。淀粉粒的數目表現為單峰分布,其中小型淀粉粒數目占總數的98%以上。增施氮肥及補充灌溉降低小型淀粉粒體積、表面積和數目的百分比,提高大型淀粉粒體積的百分比。施氮和補充灌溉增加玉米淀粉峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最終黏度、回復值及籽粒產量、粒重、總淀粉和支鏈淀粉含量,降低峰值時間、糊化溫度及直鏈淀粉含量和直/支比。直鏈淀粉含量、直/支比、峰值時間和糊化溫度與小型淀粉粒的體積百分比呈極顯著正相關,與大型淀粉粒的體積百分比呈極顯著負相關;產量、粒重、支鏈淀粉和總淀粉含量、峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最終黏度、回復值與小型淀粉粒的體積百分比呈極顯著負相關,與大型淀粉粒的體積百分比呈(極)顯著正相關。【結論】水分和氮肥處理顯著影響淀粉粒的粒度分布和糊化特性,補充灌溉和施氮320 kg•hm-2時小型淀粉粒體積比最低,大型淀粉粒體積比最高,淀粉糊化特性最優。
    不同抗旱性花生品種的葉片形態及生理特性
    厲廣輝;張昆;劉風珍;劉丹丹;萬勇善
    中國農業科學. 2014, 47(4):  644-654.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.004
    摘要 ( 379 )   HTML ( 1 )   PDF (616KB) ( 821 )   收藏
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    【目的】篩選葉片抗旱相關性狀,探索性狀指標大小的評價方法,揭示不同抗旱性花生品種抗旱的葉片形態及生理機制。【方法】以12個花生品種為試驗材料,在人工控水條件下,于苗期及結莢期給予干旱脅迫及正常灌水對照2個土壤水分處理,苗期處理以盆栽種植方式進行,稱重法控水,結莢期處理在池栽條件下進行,測墑補灌法控水,控水期間以電動防雨棚遮雨。測定苗期干旱及正常供水對照的葉片組織結構、厚度、比葉重、葉面積、光合速率、葉綠素含量等葉片性狀指標,對比分析上述葉片性狀與花生品種抗旱性的關系,以性狀指標大小評價不同花生品種抗旱的葉片機制,以生物量抗旱系數評價苗期抗旱性,以收獲期產量抗旱系數評價結莢期抗旱性。【結果】通過2年的試驗發現,干旱脅迫下,不同花生品種生物量抗旱系數及產量抗旱系數有顯著差異,苗期與結莢期抗旱性基本一致。根據產量抗旱系數可將12個花生品種抗旱性分為強、中、弱3級,抗旱性強的品種為A596、山花11號、如皋西洋生,花育20號、農大818、海花1號、山花9號和79266為中度抗旱品種,抗旱性弱的品種有ICG6848、白沙1016、花17和蓬萊一窩猴。干旱脅迫改變了葉片組織結構,降低了單株葉面積、功能葉面積、氣孔導度、光合速率和蒸騰速率,增加了比葉重。不同抗旱性花生品種葉片性狀有顯著差異,抗旱性強的品種在對照及干旱脅迫下均具有較高的葉片厚度、柵/海比、比葉重、單株葉面積、光合速率。干旱脅迫下,較大的葉片柵/海比值、比葉重和光合速率是如皋西洋生和山花11號抗旱的葉片機制;山花9號與花育20號較大的單株光合面積,A596較大的光合速率是它們重要的抗旱機制。相關分析表明,干旱脅迫下的葉片柵/海比、比葉重、單株葉面積和光合速率與品種抗旱系數的相關性達極顯著水平。【結論】山花11號和79266分別可作為花生強、弱抗旱性鑒定的標準品種。花生出苗后10 d進行40%土壤相對含水量的干旱處理,持續脅迫14 d時的葉片柵/海比、單株葉面積、比葉重和光合速率可鑒定花生種質的葉片抗旱能力。正常灌水條件下,始花期的柵/海比、單株葉面積、比葉重也能反映花生葉片的抗旱級別。山花11號可作為花生葉片優異抗旱性狀鑒定的標準品種。
    干旱脅迫對持綠性高粱光合特性和內源激素 ABA、CTK含量的影響
    周宇飛, 王德權, 陸樟鑣, 王娜, 王藝陶, 李豐先, 許文娟, 黃瑞冬
    中國農業科學. 2014, 47(4):  655-663.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.005
    摘要 ( 338 )   HTML ( 9 )   PDF (498KB) ( 686 )   收藏
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    【目的】研究干旱脅迫對不同持綠性高粱光合特性以及葉片和根系中內源激素含量的影響,為高粱持綠性資源的發掘和應用提供理論依據。【方法】采用盆栽試驗的方法,選用持綠性高粱B35和非持綠性高粱三尺三為試驗材料,設置無干旱脅迫(土壤含水量為田間最大持水量的75%—80%)和干旱脅迫兩種水分處理(土壤含水量為田間最大持水量的45%—50%),分別在開花期和灌漿期進行干旱脅迫,研究干旱脅迫下不同持綠性高粱光合作用、葉綠素熒光特性以及葉片和根系中內源激素(脫落酸和細胞分裂素)含量的變化,并分析干旱脅迫下葉片和根系中內源激素含量的動態平衡以及葉片中內源激素含量與光合特性參數間的相關性。【結果】開花期和灌漿期干旱脅迫均抑制了不同持綠性高粱的光合作用,但干旱脅迫下B35的葉綠素含量(Chl)、光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、光系統Ⅱ(PSⅡ)的初始葉綠素熒光(Fo)、最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學淬滅系數(qL)以及電子傳遞速率(ETR)的降低幅度均明顯小于三尺三;且在灌漿期三尺三Chl的衰減程度更為明顯,Pn的下降程度也更大。同時,干旱脅迫使三尺三在灌漿期PSⅡ反應中心結構受到了損害或失活。開花期和灌漿期干旱脅迫提高了不同持綠性高粱根系和葉片中脫落酸(ABA)的含量,B35葉片和根系中ABA含量的增幅顯著高于三尺三,且在灌漿期的增幅更大;干旱脅迫降低了不同持綠性高粱根系和葉片中細胞分裂素(CTK)的含量,三尺三根系和葉片中CTK含量的降低程度明顯高于B35,且在灌漿期減幅更大。B35和三尺三葉片中ABA的含量高于根系,CTK的含量低于根系;干旱脅迫降低了葉片和根系中CTK/ABA的比值,并且在開花期和灌漿期B35的降低程度均大于三尺三。ABA含量與Pn呈顯著負相關,與ETR呈極顯著負相關;除Fo外,CTK含量與Gs呈顯著正相關,與Chl、Pn、Fv/Fm、qL和ETR呈極顯著正相關。【結論】干旱脅迫下,持綠性高粱比非持綠性高粱具有較高的葉綠素含量和光合能力。ABA和CTK共同作用調控氣孔的運動,并影響光合速率及光合電子傳遞等其它光合生理過程。
    基于計算機視覺的水稻葉部病害識別研究
    劉濤1, 仲曉春2, 孫成明1, 郭文善1, 陳瑛瑛1, 孫娟1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  664-674.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.006
    摘要 ( 396 )   HTML ( 3 )   PDF (858KB) ( 1306 )   收藏
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    【目的】文章重點分析了病健交界特征參數、病害識別流程對提高病害識別準確率的影響。實現水稻葉部15種主要病害的準確識別,尤其是相似病害的判斷。【方法】(1)病斑圖像獲取:水稻葉部病害圖像來源包括水稻大田、病害圖冊和病害數據庫,文中選用改進的mean shift圖像分割算法提取病葉圖像中的病斑并根據相關方程獲取病斑特征信息。(2)特征參數的選擇與設計:首先選取一至三階顏色矩和顏色直方圖作為病害的顏色特征參數,選取球狀性、偏心率和不變矩作為病斑的形狀特征參數,選取角二階矩、對比度和相關作為病斑的紋理特征參數;然后針對相似病斑誤報率高的問題提出一種病健交界特征參數,通過病斑內部、邊緣和外圍顏色上的差異描述該特征,并根據3個區域相互間歸一化顏色直方圖的歐氏距離計算該項特征參數,該參數可以用于描述病斑與健康部分交界處的特征。(3)病害識別流程的設計:根據病害在顏色、形狀、紋理、病健交界4個特征上差異的顯著程度設計完成病害識別流程,流程中首先通過顏色特征識別病害,對于通過顏色特征無法識別的病害再通過形態特征識別,倘若形態特征依然無法識別則通過紋理和病健交界特征進行最終識別。(4)病害識別模型的建立:將病害數據分成兩部分,一部分用于建立模型,另一部分用于模型的驗證;利用LibSVM程序包完成建模,其中svmtrain函數用于建立支持向量機模型,Grid程序用于優化參數,svmpredict函數用于對模型進行驗證。【結果】15種水稻葉部病斑可以從復雜的背景中分割出來,并可快速準確的被識別,平均識別準確率為92.67%,平均漏報率為7.00%,最大漏報率和誤報率分別為15.00%和25.00%;病健交界特征參數引入后,識別準確率提高了14.00%,平均漏報率降低了7.50%,漏報率最大降幅為20.00%,誤報率最大降幅為65.00%;與用所有特征參數直接進行病害識別相比,采用本文提出的識別流程進行病害識別的準確率提高了12.67%,漏報率降低了9.33%,一些病害的漏報率和誤報率降幅達30.00%以上;在識別流程各步驟中,顏色特征識別環節的平均準確率為96.71%,漏報率和誤報率均未超過10.00%;形態特征識別環節的平均準確率為94.17%,漏報率和誤報率均未超過15.00%;紋理和病健交界特征識別環節的平均準確率為91.50%,漏報率和誤報率均未超過25.00%。【結論】利用mean shift圖像分割算法可以準確分割水稻葉部病斑;基于支持向量機模型的分類方法可以對15種水稻病斑準確分類;論文中提出的病健交界特征參數以及病斑識別流程均提高了病斑的識別準確率;病健交界特征參數對提高一些相似病害的識別精度效果顯著;將這些方法相結合可以有效對水稻常見葉部病害進行識別,為水稻病害的田間智能診斷提供技術支撐。
    植物保護
    水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析
    陳雪鳳, 魏楚丹, 張慶, 劉瓊光
    中國農業科學. 2014, 47(4):  675-684.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.007
    摘要 ( 323 )   HTML ( 3 )   PDF (727KB) ( 568 )   收藏
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    【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要細菌病害之一,迄今對該病原細菌的致病性調控研究尚不完善。論文旨在分析水稻基腐病菌(Dickeya zeae)雙組分調控系統HrpX/HrpY的序列特征,研究該系統在水稻基腐細菌中的功能作用以及與下游基因的調控關系。【方法】對HrpX/HrpY序列進行生物信息學分析,構建帶有反向篩選標記基因scaB的自殺重組質粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通過三親轉化方法分別將重組質粒導入野生型菌株EC1中,通過2次等位基因同源重組篩選獲得基因缺失突變體ΔhrpX和ΔhrpY;比較突變體與野生菌的生長速率、胞外酶活性、毒素活性、運動性、菌膜形成能力,以及對水稻的致病性和對煙草的過敏性反應(HR);進一步提取細菌總RNA,采用實時熒光定量PCR研究HrpX/HrpY雙組分系統對下游基因表達量的影響。【結果】水稻基腐病菌EC1基因組中,hrpX和hrpY均為單拷貝,hrpX編碼區長1 473 bp,編碼490個氨基酸,hrpY長642 bp,編碼213個氨基酸,hrpX和hrpY兩者之間相隔32 bp,具有相同的轉錄方向,在功能上具有相關性。其中,HrpX是一個結合在膜上的組氨酸蛋白激酶,HrpY是存在細胞質中的效應調節蛋白,HrpX/HrpY兩者構成雙組分系統,并對下游hrp基因的表達具有調控作用。進一步通過遺傳操作手段,成功構建了基因缺失突變體ΔhrpX和ΔhrpY,表型測定結果表明,突變體ΔhrpX和ΔhrpY的運動性減弱、菌膜形成能力降低、對水稻種子萌發的抑制作用減弱,且降低了對水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生長速率、胞外酶和毒素的活性變化不明顯,也不影響其在煙草上的HR。實時熒光定量PCR結果顯示,突變體菌株ΔhrpX和ΔhrpY相對野生菌EC1表達量明顯下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而對毒素合成基因zmsA表達量的差異不明顯,HrpX/HrpY雙組分系統對hrp基因簇中大部分下游基因都有正調控作用,且HrpY的調控作用更加明顯。【結論】HrpX/HrpY是水稻基腐病細菌中的一個雙組分系統,調節病原細菌的運動性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向調控一些下游hrp基因的表達。
    噬菌體展示納米抗體模擬黃曲霉毒素抗原的活性表征
    王妍入1, 2, 4, 李培武1, 2, 3, 4, 5, 張奇1, 3, 4, 丁小霞1, 4, 5, 張文1, 2, 5
    中國農業科學. 2014, 47(4):  685-692.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.008
    摘要 ( 367 )   HTML ( 3 )   PDF (644KB) ( 750 )   收藏
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    :【目的】筆者實驗室前期免疫并構建噬菌體展示納米抗體庫,應用此抗體庫篩選、制備可以用作黃曲霉毒素無毒替代抗原的納米抗體。本研究旨在探明已篩選出的噬菌體展示納米抗體Phage 2-5用作黃曲霉毒素替代抗原的活性,為后續納米抗體的合成以及黃曲霉毒素綠色免疫分析方法的建立奠定基礎。【方法】前期,筆者實驗室對羊駝免疫黃曲霉毒素抗原(AFB1-BSA),經過5次免疫后,取血,提取RNA,反轉錄為cDNA,并采用PCR技術對抗體可變區VHH區域進行擴增,與載體pComb3X偶聯,構建噬菌體展示納米抗體庫;經過吸附-洗脫的淘選過程篩選出能夠與黃曲霉毒素競爭結合抗黃曲霉毒素單克隆抗體1C11的噬菌體展示納米抗體Phage 2-5。本研究通過將抗黃曲霉毒素單克隆抗體1C11固定在酶標板上,以噬菌體展示納米抗體Phage2-5作為競爭抗原,與反應體系中的游離黃曲霉毒素競爭結合抗體,構建酶聯免疫分析(ELISA)體系,檢測游離黃曲霉毒素含量,并分別對該方法的靈敏度、交叉反應率、緩沖液和樣品基質對反應體系的影響進行測定。【結果】采用棋盤法確定了抗體最佳包被濃度為1.25 mg·mL-1,噬菌體最佳使用濃度為5´1011 pfu/mL。在最優條件下建立基于噬菌體展示納米抗體Phage2-5的ELISA法,對黃曲霉毒素B1的IC50值為0.054 ng·mL-1,對黃曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反應率分別為38.6%、70.1%、14.5%、14.6%;反應最高耐受甲醇濃度為20%;當pH值為7.0時,反應靈敏度最高,升高或降低pH對反應靈敏度均有影響;鹽離子濃度對反應靈敏度影響不大,反應體系在5´PBS的環境下仍能保持較高活性,但純水溶液不利于反應的進行;因此,該反應的最佳反應緩沖液是pH值為7.0的0.01 mol·L-1 磷酸鹽緩沖液(PBS),花生、大米、玉米基質對反應體系無顯著影響。【結論】噬菌體展示納米抗體Phage2-5具備良好的模擬黃曲霉毒素抗原的生物活性,用作替代抗原建立的免疫分析方法靈敏度高、甲醇耐受能力強,并且樣品基質效應不明顯,具有進一步研制黃曲霉毒素模擬抗原的前景。
    高溫脅迫對柑橘全爪螨存活及生殖的影響
    楊麗紅1, 2, 黃海2, 王進軍2
    中國農業科學. 2014, 47(4):  693-701.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.009
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (525KB) ( 480 )   收藏
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    【目的】研究高溫脅迫對柑橘全爪螨(Panonychus citri)存活及生殖的影響,揭示該螨在高溫條件下的種群動態規律。【方法】柑橘全爪螨采自中國農業科學院柑橘研究所,在人工氣候室飼養10代后用于試驗,飼養條件為溫度(25±1)℃,相對濕度75%—80%,光周期14 h﹕10 h(L﹕D),寄主植物為盆栽柑橘苗。挑取雌成螨于離體柑橘葉片上,讓其產卵12 h,然后移除雌成螨,收集的卵繼續飼養至后若螨時,采用葉蝶法單頭飼養到成螨。將雌成螨單頭分別置于32、35、38及41℃恒溫培養箱中熱激一定時間,然后再放回上述人工氣候室條件下,每個葉碟上再放1頭雄成螨,每個處理至少設30個重復,以25℃為對照。每24 h觀察、計數產卵情況,直至雌成螨死亡,測定高溫及作用時間對柑橘全爪螨雌成螨壽命及生殖的影響。利用SPSS 10.0對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA),平均數的多重比較采用Duncan multiple range test(DMRT,P<0.05)。【結果】高溫35及41℃分別脅迫柑橘全爪螨雌成螨1 h,其壽命顯著縮短至10.1及8.2 d(P<0.001)。且隨脅迫時間延長,影響加劇。38℃脅迫雌成螨3 h,其壽命顯著縮短至9.6 d(P<0.01);41℃脅迫雌成螨3 h,其壽命顯著縮短至5.0 d(P<0.001)。高溫脅迫對雌成螨的生殖力也有明顯影響,32、35、38及41℃分別脅迫雌成螨1 h,每雌產卵量顯著下降為38.4、37.5、43.5和40.2粒(P<0.05);隨著脅迫時間的延長,產卵量繼續下降,38℃脅迫雌成螨3 h,產卵量為23.1粒(P<0.001),41℃脅迫雌成螨3 h,產卵量顯著下降至7.8粒(P<0.001)。雌成螨分別在32、35、38及41℃下脅迫1 h,特定年齡存活率(lx)曲線均出現“平臺期”,但38及41℃分別脅迫雌成螨3 h,lx曲線“平臺期”消失;且隨著溫度升高及脅迫時間的延長,lx曲線坡度變陡。特定年齡生殖力(mx)曲線顯示,高溫脅迫促使產卵高峰期提前,mx下降;高溫38及41℃分別脅迫雌成螨3 h,mx下降尤為明顯。【結論】高溫脅迫下,柑橘全爪螨雌成螨壽命縮短、lx下降、產卵數量減少及mx下降,且隨著脅迫溫度的升高和脅迫時間的延長,影響程度加劇,短時高溫對雌成螨的存活和生殖有不利影響。夏季高溫條件對柑橘全爪螨種群具有明顯的抑制作用。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    粗糙集理論在土壤肥力評價指標權重確定中的應用
    葉回春1, 張世文2, 黃元仿1, 周志明1, 沈重陽1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  701-717.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.011
    摘要 ( 285 )   HTML ( 1 )   PDF (540KB) ( 525 )   收藏
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    【目的】土壤肥力是土壤諸多基本特性的綜合反映,科學、合理、實用地評價土地肥力將為指導農業生產、土地利用規劃和管理提供理論依據。其評價過程是一個無決策屬性的多屬性決策過程,而解決多屬性決策問題的重要前提是各屬性權重分配問題。【方法】確定指標權重的方法主要有主觀賦權法和客觀賦權法,然而,主觀賦權法往往需要大量的先驗知識,評價結果有一定的主觀隨意性,而且較少考慮評價指標之間的依賴關系;客觀賦權法沒有充分考慮到各參評因素對評價的重要度不同,統計數據有相關性也并不意味著兩個事件具有因果聯系。綜合考慮主、客觀賦權法各自的優缺點,利用粗糙集理論中知識約簡和相對正域理論在消除冗余信息和處理不確定性信息等方面的優勢,探究土壤肥力評價過程中一種主觀和客觀相結合的權重確定方法,并利用作物產量對評價結果進行驗證。【結果】粗糙集理論在土壤肥力評價中的具體賦權思路包括:數據的離散化、土壤肥力綜合等級的初步確定、屬性值約簡、等價類劃分、屬性重要度的計算和指標權重計算等步驟。以北京大興區農田土壤樣點的肥力評價對上述賦權思路進行實例分析,對比傳統特爾斐法和粗糙集理論賦權結果發現,特爾斐法確定的土壤有機質、全氮、有效磷和速效鉀等指標的權重分別為0.300、0.250、0.250和0.200,利用其評價得到的土壤綜合肥力指數(IFI)與產量顯著線性相關,R2為0.77,均方根誤差(RMSE)為1.25;而粗糙集理論確定的土壤有機質、全氮、有效磷和速效鉀等指標的權重依次為0.455、0.111、0.111和0.333,利用其評價得到的IFI與產量也顯著線性相關,R2達0.83,RMSE為1.09,精度均較特爾斐法有了提高,其中RMSE相對精度提高值達12.80%。【結論】粗糙集理論在土壤肥力評價中的具體賦權思路基本是可行的,且相對于特爾斐法其確定出各指標權重更為合理、準確,可為土壤肥力評價及相關領域的評價提供一個有益的思路。
    寒地稻田土壤氮素礦化特征的研究
    彭顯龍1, 劉洋1, 于彩蓮2, 王迪1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  702-709.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.010
    摘要 ( 317 )   HTML ( 22 )   PDF (532KB) ( 514 )   收藏
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    【目的】土壤供氮能力是影響稻田氮效率的主要指標之一,寒地稻田與南方稻田相比具有氮肥用量低和氮素利用效率高的特點,通過比較南北方稻田土壤供氮能力的差異,以期揭示土壤氮素礦化與寒地稻田氮素高效利用的關系。【方法】選擇江蘇省高肥力的烏柵土和中等肥力勤沙土,以及黑龍江三江平原高中肥力白漿土型水稻土,采用淹水密閉培養法,在25℃、30℃和40℃條件下恒溫培養28 d,測定培養前后土壤銨態氮的含量,并分析土壤有機質、全氮和有機氮各組分的含量;通過一級動力學模型和有效積溫模型擬合土壤氮素礦化與培養時間的關系。【結果】南方高中肥力土壤酸解氮、氨基酸態氮占土壤全氮比例均高于北方高中肥力土壤,北方稻田土壤碳氮比較高。在25℃培養28 d,南方和北方高肥力土壤間,以及中等肥力土壤間累積礦化氮量無明顯差異。當溫度為40℃時,南方高肥力和中等肥力土壤28 d累積礦化氮顯著高于對應肥力的北方土壤。這與南方土壤有機氮含量或者有機氮所占比例較高有關。One-pool模型擬合顯示,在25℃時北方土壤礦化勢(N0)比對應肥力南方土壤增加了35.9%—36.3%;當溫度為30℃和40℃時,北方土壤與南方對應肥力土壤相比N0降低了6.1%—32.7%和20.9%—36.7%。北方土壤微生物不耐高溫,是其40℃礦化勢較低的原因。有效積溫模型擬合顯示,隨溫度增加同一土壤氮礦化特征常數n值逐漸減小;南方土壤的氮礦化特征常數K值較高,而北方土壤n值高,表示南方中高肥力土壤的初期礦化速率高,而北方中高肥力土壤后期礦化速率高。【結論】土壤礦化氮含量和礦化勢受土壤微生物活性、土壤碳氮比、土壤有機氮含量及其占全氮的比例影響,25℃下北方稻田土壤可礦化氮量較高,而且相對南方稻田土壤而言,寒地稻田土壤氮素礦化前期較慢,后期較快的特點與水稻吸氮更協調,這是寒地稻田氮素高效利用的原因之一。
    園藝
    生姜種質遺傳多樣性和親緣關系的SRAP分析
    李秀, 徐坤, 鞏彪
    中國農業科學. 2014, 47(4):  718-726.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.012
    摘要 ( 304 )   HTML ( 7 )   PDF (531KB) ( 633 )   收藏
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    【目的】生姜為無性繁殖作物,千百年來,在經歷氣候變遷、自然選擇和人工選擇過程中,其生物學性狀呈現出多方面變異,造就了許多地方品種。因此,研究生姜種質資源的遺傳多樣性及親緣關系,對生姜資源進行科學分類,為生姜種質的收集、保護和創新利用提供理論依據。【方法】采用CTAB法提取生姜幼葉基因組DNA,利用SRAP(相關序列擴增多態性,sequence-related amplified polymorphism)分子標記技術,對來源于世界不同地區的51份生姜種質的基因組DNA進行多態性擴增,PCR產物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,采用銀染法顯色。根據電泳結果得到“0,1”矩陣,利用POPGENE version1.32軟件計算每對引物的多態性位點數、多態性位點百分率,以及有效等位基因數Ne、Nei’s遺傳相似系數(GS)、遺傳距離(GD)、Nei’s遺傳多樣性指數、Shannon信息指數等指標,并采用NTSYS version2.10e軟件進行種質間的UPGMA(非加權組平均法,unweighted pair-group method)聚類分析和基于Nei’s遺傳距離的組群間的聚類分析,對生姜資源進行分類;同時,根據不同生態區之間生姜種質資源的遺傳多樣性和親緣關系,結合植物起源中心相關特性及歷史記載,探討生姜的起源與傳播。【結果】篩選出的15對引物共擴增出305條帶,其中188條為多態性條帶,多態性比率為61.68%,平均每對引物擴增出20.33個位點和12.53個多態性位點,說明生姜的遺傳變異較為廣泛。51份生姜種質的Nei’s遺傳多樣性指數、Shannon信息指數平均值分別為0.3689、0.5510,據此可將生姜種質分為3個大類、9個亞類,分析比較發現,每一類的生姜多來源于相同或相近區域。進一步研究表明,7個不同地理來源群體的Shannon信息指數范圍是0.2901—0.4807,在遺傳相似系數為0.9時,可將7個群體分為4類,華北群體、非洲群體各為一類,東南亞群體與日韓群體為一類,東南沿海群體、西南高原群體、華中群體為一類。【結論】品種間基于Nei’s遺傳多樣性指數和Shannon信息指數的分析表明,生姜雖為無性繁殖作物,但其遺傳多樣性較為豐富;根據遺傳相似系數的UPGMA聚類分析結果,生姜種質資源的遺傳多樣性受地理來源影響較大;群體間遺傳多樣性分析表明,中國國內群體的遺傳多樣性高于國外群體,尤其華北群體與其他群體的遺傳距離較遠,且其栽培歷史悠久,可以判定中國華北地區是生姜的次生起源地;而鑒于非洲群體的遺傳多樣性指數較高,與其他群體的遺傳距離較遠,且空間分布距中心位置較近,又有野生種存在,據此推斷非洲可能是除東南亞之外的另一生姜原生起源地。
    ‘喬納金’蘋果及其脆肉芽變果實質地發育機理
    陳學森, 宋君, 高利平, 冀曉昊, 張宗營, 毛志泉, 張艷敏, 劉大亮, 張芮, 李敏
    中國農業科學. 2014, 47(4):  727-735.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.013
    摘要 ( 323 )   HTML ( 1 )   PDF (613KB) ( 558 )   收藏
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    【目的】研究‘喬納金’蘋果及其脆肉芽變果實發育后期硬度與脆度的變化、果實香氣成分含量以及果實軟化相關基因的表達差異,旨在為全面認識該脆肉芽變的發育機理提供科學依據,并為進一步豐富蘋果果實質地品質發育的理論體系提供基本資料。【方法】以‘喬納金’蘋果及其脆肉芽變蘋果發育后期的果實為試材,檢測果實硬度、脆度、香氣成分含量以及乙烯生物合成基因ACO、ACS和果實軟化有關基因PG、PME、β-Gal、α-L-Af、XET、AM、LOX及β-xyl的表達量。【結果】‘喬納金’蘋果及其脆肉芽變果實發育后期的果實硬度與脆度整體均呈下降趨勢,其中在采前50-35 d有個快速下降過程,但脆肉芽變的果實硬度與脆度均顯著高于‘喬納金’;‘喬納金’蘋果酯類化合物的種類數與含量分別是其脆肉芽變的1.5倍和1.2倍,而醇類和醛類化合物含量分別僅是其脆肉芽變的15.1%和14.3%;‘喬納金’蘋果ACO基因表達量前后變化很大,在花后120 d有一個明顯的表達峰,花后113-120 d表達量(2 995.8)占總表達量(3 039.6)的98.6%,而‘喬納金’硬肉芽變果實ACS和ACO基因表達量前后變化不大,總表達量僅分別相當于‘喬納金’的73.9%和1.1%,且表達峰均滯后于‘喬納金’;‘喬納金’蘋果PG及XET等6個基因在花后113-120 d表達量均占總表達量的35%以上,是引起‘喬納金’蘋果果實硬度與脆度快速下降的主要原因,而‘喬納金’脆肉芽變果實參試的12個基因總表達量(1 021.9)僅是‘喬納金’(4 399.1)的23.2%,其中PG、α-L-Af、 XET和β-Gal等4個基因表達量分別是‘喬納金’的12.5%、62.7%、72.6%和75.3%。【結論】‘喬納金’蘋果酯類成分種類多、含量高,而脆肉芽變醇類和醛類成分種類多、含量高;兩份材料果實發育后期果實硬度和脆度的差異及其變化可能是ACS、ACO、PG、β-Gal、β-xyl、α-L-Af和 XET等多種基因協同作用的結果,其中ACO、PG、β-Gal和XET是關鍵基因。
    貯藏·保鮮·加工
    不同貯藏方式對贛南紐荷爾臍橙果實品質的影響
    何義仲1, 陳兆星1, 2, 劉潤生1, 方貽文2, 古祖亮3, 嚴翔2, 陳紅3, 張洪銘2, 唐煥慶3, 程運江1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  736-748.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.014
    摘要 ( 402 )   HTML ( 5 )   PDF (3290KB) ( 436 )   收藏
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    【目的】研究機械冷庫(Mcs)、山區水冷貯藏庫(Ecvs)和通風貯藏庫(Vws)對贛南紐荷爾臍橙(Citrus sinensis Osbeck‘Newhall’)果實的貯藏效果,為優化柑橘貯藏條件及貯藏庫的改良提供理論依據。【方法】將商業成熟度的紐荷爾臍橙果實分別放置于3種不同類型的生產貯藏庫,持續跟蹤貯藏庫的環境參數變化;運用氣相色譜儀、紅外線CO2分析儀等設備,分析貯藏果實的生理和生化指標,并進行感官評價。【結果】在貯藏期內,3種貯藏庫內部環境參數持續變化,Mcs內部溫度和相對濕度分別維持在2.1—11.2℃和64.4%—99.0%之間。隨著氣溫升高,Mcs內部與運輸或貨架期環境的溫差逐漸加大,與Vws、Ecvs存在顯著差異。Vws與Ecvs內部溫度和相對濕度的皮爾森系數分別達到0.80以上,變化趨勢一致,但是,比較兩種貯藏庫相同時刻的溫度和相對濕度,Ecvs延緩庫內部溫度升高,維持庫內相對濕度的能力優于Vws。同時,Mcs內部CO2和乙烯濃度顯著高于其他貯藏庫。果實可滴定酸和可溶性固形物含量隨著貯藏期的延長逐漸下降,而且果實可滴定酸比可溶性固形物下降更劇烈。在105 d(days of storage,DOS)后,Ecvs貯藏果實的可滴定酸含量顯著高于Vws和Mcs貯藏果實,而果實可溶性固形物含量在各貯藏方式之間無顯著性差異。果實的檸檬酸和蘋果酸濃度在135 DOS顯著下降,3種貯藏方式之間,果實檸檬酸和蘋果酸的濃度存在差異,在65 DOS后,Ecvs貯藏果實檸檬酸和蘋果酸濃度高于Mcs、Vws貯藏果實。在135 DOS前,Mcs維持果實硬度、可溶性糖、Vc效果明顯優于Ecvs和Vws;但是在160 DOS,Mcs貯藏果實的硬度、可溶性糖和Vc損耗加劇,其含量顯著低于Ecvs貯藏的果實。此外,果實的乙醇、乙醛、甲醇的濃度在105 DOS顯著升高,3種貯藏方式之間,Mcs貯藏果實在160 DOS的乙醇積累量(723.02 μg•L-1)顯著高于Ecvs、Vws貯藏果實,果實風味品質降低。Ecvs、Vws貯藏果實感官滿意度隨貯藏期延長不斷波動,而Mcs貯藏果實感官滿意度先升高后逐漸下降,在160 DOS顯著低于Vws和Ecvs貯藏的果實。【結論】貯藏庫與運輸、貨架期環境的溫差,貯藏庫內氣體成份,尤其是乙烯,顯著影響果實有機酸、乙醇、乙醛和甲醇的含量,導致不同貯藏庫的果實品質和感官滿意度的差異。Mcs貯藏果實在135 DOS品質出現劣變,Ecvs貯藏果實壽命可延長至160 DOS,而Vws貯藏果實品質在65 DOS后顯著下降,不適于長期貯藏臍橙。
    氧化羊骨油對羊肉味調味基料揮發性風味物質的影響
    劉金凱1, 2, 高遠1, 王振宇1, 陳麗1, 張德權1, 艾啟俊2
    中國農業科學. 2014, 47(4):  749-758.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.015
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    【目的】確定添加適度氧化的羊骨油對熱反應型羊肉味調味基料揮發性風味物質的影響,為高品質羊肉味調味基料風味的開發提供理論依據。【方法】評價以過氧化值、酸價和茴香胺值表征的氧化羊骨油對調味基料揮發性風味物質的影響,利用Pen3型電子鼻對不添加羊骨油、添加未氧化羊骨油和添加適度氧化羊骨油的3個熱反應體系進行研究,以電子鼻主成分分析中的區分指數作為檢測指標,確定3個熱反應體系的區分度;應用固相微萃取-氣質聯用技術分離鑒定基料的揮發性風味物質,通過“相對氣味活度值(ROAV)”評價各揮發性風味物質對調味基料總體風味的貢獻,并結合聚類分析方法,確定添加氧化羊骨油后羊肉味調味基料的關鍵揮發性風味物質。【結果】電子鼻結果顯示,未添加羊骨油與添加未氧化羊骨油的調味基料間區別指數為0.589,未添加羊骨油與添加氧化羊骨油的調味基料間區分指數為0.917,添加未氧化羊骨油與添加氧化羊骨油的調味基料間區分指數為0.787。氣質聯用結果顯示,不添加羊骨油、添加未氧化羊骨油和添加適度氧化羊骨油的3組調味基料中揮發性風味物質的種類分別為42種、63種和61種,主要為醛類、烴類;在添加未氧化羊骨油組和添加氧化羊骨油組中,含硫、含氮雜環化合物的相對含量差異不顯著,而對調味料風味改善貢獻較小的烴類物質相對含量顯著降低,同時醛類物質的相對含量顯著增加,添加羊骨油尤其是氧化羊骨油可使熱反應體系生成更多的醛類揮發性風味物質;確定3組調味基料中關鍵揮發性物質(ROAV≥1)有11種:辛醛、壬醛、癸醛、反,反-2,4-癸二烯醛、桃醛、庚醛、反-2-壬烯醛、十二醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、反,反-2,4-壬二烯醛,這些關鍵揮發性物質主要以脂肪香氣為主,并包含甜香、青香、焦香和柑橘等香氣;通過聚類分析將11種關鍵風味物質分為三類,第一類物質在添加氧化羊骨油后ROAV值變化較小;第二類包括反,反-2,4-癸二烯醛、反-2-壬烯醛,在添加氧化羊骨油后ROAV值顯著增加;第三類為癸醛,在添加氧化羊骨油后ROAV值顯著降低,而第二類與第三類物質在未添加羊骨油組和添加未氧化羊骨油組間的差異不顯著(P >0.05)。【結論】添加氧化羊骨油,可以顯著影響羊肉味調味基料揮發性風味物質的種類,增強熱反應型羊肉味調味基料的風味,反,反-2,4-癸二烯醛與反-2-壬烯醛是改善調味基料最關鍵揮發性風味物質。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    基于DGGE和T-RFLP分析采食不同粗飼料梅花鹿瘤胃細菌區系
    李志鵬1, 姜娜2, 劉晗璐1, 崔學哲1, 荊祎1, 楊福合1, 李光玉1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  759-768.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.016
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    【目的】細菌區系在梅花鹿(Cervus nippon)瘤胃發酵中發揮著重要作用,然而有關梅花鹿瘤胃細菌區系的研究鮮有報道。研究梅花鹿瘤胃細菌區系,為梅花鹿瘤胃發酵調控提供分子生物學依據。【方法】選取4頭2歲齡的裝有永久性瘤胃瘺管的成年雄性梅花鹿為研究對象,分別飼喂以柞樹葉(OL組,梅花鹿A和B)和玉米秸稈(CS組,梅花鹿C和D)為主要粗飼料的日糧,持續飼喂30 d。通過瘤胃瘺管取瘤胃內固液混合物,提取瘤胃微生物基因組DNA。擴增瘤胃細菌16S rRNA基因V3區以及16S rRNA基因,分別用于DGGE和T-RFLP分析。DGGE圖譜進行聚類分析,并切取優勢條帶進行克隆測序,鑒定瘤胃內細菌組成。根據T-RFLP圖譜結果計算細菌群落的多樣性、優勢度、均勻度和豐富度,通過Microbial Community AnalysisⅢ(MiCAⅢ)數據庫推測T-RFs可能代表的微生物種類,并進行T-RFLP圖譜的聚類分析。【結果】DGGE圖譜聚類表明,CS組和OL組瘤胃細菌區系相似性低于65%,表明粗飼料種類影響梅花鹿瘤胃細菌區系。OL組梅花鹿A和B的DGGE圖譜相似度大于70%,CS組梅花鹿C和D的DGGE圖譜相似性大于75%,而且同組不同個體之間瘤胃細菌區系存在差異。OL組和CS組分別獲得20和24個DGGE特異性條帶。序列分析表明,CS組條帶可歸類為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門,而OL組條帶可歸類為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和互養菌門。OL組與CS組中存在大量Prevotella spp.,但不同組中Prevotella spp.在種水平組成不同,主要纖維降解菌為Clostridium spp.與Eubacterium spp.。T-RFLP結果顯示,梅花鹿D(CS組)具有最高的豐富度、多樣性、均勻度和最低的優勢度,梅花鹿A和B的各項指數相近但低于梅花鹿D,說明OL組中的粗飼料(柞樹葉)影響瘤胃中微生物的相對生物量。梅花鹿C和D的各項指數相差較大而且梅花鹿C的指數低于梅花鹿A和B,表明同組不同個體之間存在差異。81、214、272和308 bp的T-RFs為OL組優勢條帶,90、95、175、273和274 bp的T-RFs為CS組優勢條帶,161、259、264、266和284 bp的T-RFs為共同條帶。根據MiCAⅢ結果,這些T-RFs代表細菌歸類于擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和酸桿菌門。T-RFs圖譜聚類表明,4頭梅花鹿T-RFs聚為兩類,粗飼料來源影響梅花鹿瘤胃細菌T-RFs圖譜特征,其中梅花鹿A、B和C的T-RFs特征條帶圖譜相似。【結論】Prevotella spp.是梅花鹿瘤胃優勢細菌,但不同粗飼料影響梅花鹿瘤胃細菌區系組成。
    人凝血因子Ⅸ乳腺特異表達載體的構建及細胞轉染
    韓雪潔, 薩日娜, 梁浩, 李雪玲, 李榮鳳
    中國農業科學. 2014, 47(4):  769-778.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.017
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    【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,hFIX)是凝血過程中的關鍵因子,對臨床治療血友病有著極其重要的意義。研究旨在構建人凝血因子Ⅸ乳腺表達載體,在豬乳腺上皮細胞中驗證其乳腺特異表達能力,獲得hFIX轉基因雌性乳腺上皮細胞和豬胎兒成纖維細胞,為克隆乳腺特異表達人凝血因子Ⅸ的轉基因豬做準備。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR試劑盒的說明書,從人胎兒肝臟中提取RNA并擴增出人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,hFIX)cDNA序列,利用PCR方法擴增牛生長激素(BGH) polyA序列,將hFIX的cDNA序列與BGH polyA序列分別連接到表達載體pbCSN2-RC的牛酪蛋白(CSN2)啟動子之后,構建帶有新霉素抗性和紅色熒光蛋白雙篩選標記的乳腺特異性表達載體pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期豬乳房組織,利用組織塊種植法培養豬乳腺細胞,并通過控時消化分離純化豬乳腺上皮細胞,進行染色體分析后,挑選含有正常染色體數目的細胞,通過脂質體法將表達載體導入,經過G418篩選獲得穩定表達紅色熒光蛋白的轉基因細胞,反轉錄、實時定量PCR驗證乳腺表達載體構建的合理性和有效性。為了只對雌性胎兒成纖維細胞進行轉基因操作,首先對培養的豬胎兒成纖維細胞進行SRY基因PCR擴增,確定其性別。之后,利用脂質體將證明有效的表達載體導入細胞,并進行G418和紅色熒光蛋白表達篩選,對經過鑒定的陽性細胞進行擴大培養和冷凍保存,為下一步的體細胞克隆做準備。【結果】經PCR和酶切鑒定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到載體pbCSN2-RC中,獲得具有雙篩選標記的pbCSN2-hFIX-pA-RC。轉染后G418和紅色熒光蛋白表達陽性的豬乳腺上皮細胞,經實時定量PCR鑒定,hFIX有高效表達,證明所構建載體具有指導人FIX在乳腺特異表達的能力,可以用于生產乳腺特異表達的動物。將構建的載體轉入雌性豬胎兒成纖維細胞,經G418和紅色熒光蛋白的表達篩選,成功獲得hFIX轉基因陽性細胞。【結論】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白啟動子可以成功特異性誘導hFIX在豬乳腺細胞的特異表達,獲得的hFIX轉基因陽性豬胎兒成纖維細胞,為下一步通過體細胞克隆培育hFIX乳腺生物反應器奠定了基礎。
    F4ac型產腸毒素大腸桿菌菌液上清對仔豬小腸 上皮細胞的免疫刺激作用
    周傳麗1, 劉錚鑄1, 2, 俞英1, 張勤1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  779-785.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.018
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    【目的】豬源產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是一類世界范圍內流行的致仔豬腹瀉的病原菌。依據養豬業生產實踐中對致仔豬腹瀉病原菌血清學鑒定結果可知,F4ac型ETEC的流行性最為廣泛。到目前為止,對ETEC導致仔豬腹瀉的機理已經有了比較透徹的闡釋。但對ETEC培養液的免疫原性尚未有研究和描述。論文以F4ac型ETEC為研究對象,探索其菌液上清(即培養液)對仔豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)的免疫刺激作用。【方法】首先收集F4ac型ETEC菌株200培養12h后的培養液,后經4℃,4 000 r/min,離心15 min收集培養液上清,將該上清液經0.22 µm濾器過濾,并與DMEM/F12培養基以1﹕1的比例混合,以此混合液共孵育IPEC-J2細胞3 h,重復此處理3次獲得處理組細胞;同時設新鮮的LB培養基與DMEM/F12培養基同樣以1﹕1的比例共孵育3 h的IPEC-J2 細胞為對照組細胞,對照處理亦重復3次。然后用TRIZOL試劑按照說明書提取對照組和攻毒組IPEC-J2細胞的總RNA,并用TaKaRa 公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(反轉錄試劑盒)按照說明書將提取的總RNA反轉錄成cDNA。應用文獻報道或自行設計的跨內含子的引物通過實時熒光定量PCR方法,以豬的持家基因β-actin作為內參,檢測IL8、TNF-α、CXCL2、IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13共9個免疫相關基因和黏蛋白基因在攻毒組和對照組中的mRNA表達差異性。【結果】較之對照組,在攻毒組中,3個重要的促炎細胞因子基因IL8、TNF-α和CXCL2的mRNA均出現了顯著性地過表達。其中,在攻毒組中,IL8的表達量為對照組的3.24倍(P < 0.05);TNF-α的表達量亦為對照組的3.24倍(P < 0.01);CXCL2 的表達量為對照組的1.65倍(P <0.001)。在攻毒組和對照組之間,其他6個基因(IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13)的表達差異未達到統計學上的顯著水平。【結論】研究采用F4ac型ETEC菌株200的培養液上清對IPEC-J2細胞系進行3 h攻毒處理,并通過熒光定量PCR方法檢測到了3個重要的促炎因子基因IL8、TNF-α和CXCL2在攻毒組較之非攻毒組中的過表達。這表明豬F4ac型ETEC培養液上清對仔豬小腸上皮細胞確實具有一定的免疫刺激作用。研究為更明確地了解豬F4ac型ETEC釋放的腸毒素及黏附素等抗原物質對仔豬小腸上皮細胞的免疫刺激作用提供了一定的實驗證據。
    農業經濟與管理
    耕地資源非農化價值損失評價模型與補償機制研究
    任平, 吳濤, 周介銘
    中國農業科學. 2014, 47(4):  786-795.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.019
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    【目的】耕地資源生態價值和社會價值長期被忽視是我國耕地保護中最大的不足和缺陷,耕地非農化價值損失遠遠超過傳統意義上的經濟價值損失。耕地資源流失、非農化的核心問題之一是對耕地資源非農化價值理論認知的缺失,是對耕地資源(保護)非農化價值構成、體系、方法等科學問題研究還不夠透徹、不夠深入,這是必須認識到的一個基礎理論問題。通過構建耕地價值評價方法與模型,實現耕地資源(保護)非農化價值損失定量評價與模擬,以期為耕地保護、耕地補償決策等提供理論和實踐參考。【方法】以耕地資源價值分類為基礎,運用收益還原法、等效替代法、市場價值法構建耕地資源經濟價值、社會價值和生態服務價值綜合評價模型。耕地資源經濟價值主要通過修正不同農作物的收益差異權重指數,運用收益還原法計算經濟價值;耕地資源社會價值主要運用等效替代法計算,其中采用城鎮養老保險金修正參數代替基本保障價值,用農民農業生產效益參數代替農民就業工資水平,用區域糧食供需差額參數代替社會穩定價值;耕地資源生態服務價值在修正單位耕地面積生態當量因子的基礎上,考慮生態服務當量因子的經濟價值與平均糧食單產市場價值的相關關系,運用市場價值法進行計算。【結果】(1)評價模型客觀地還原了耕地資源貨幣化價值,具有一定的可行性和科學性,并可以實現不同區域耕地價值的評價與模擬,具有較強的通用性和適用性。(2)實證研究表明,四川省耕地資源保護價值為122.85萬元/hm2,其中經濟價值、社會價值與生態服務價值分別占5.74%、64.17%、30.09%。(3)以2010年為基準年,四川省耕地資源保護價值為82 555.20億元,是四川省當年GDP的4.8倍,耕地非農化價值損失量為436.12億元,為當年GDP的2.5%。【結論】(1)耕地(保護)非農化利益主體的微觀響應表明,中央政府不能被排除在耕地資源(保護)非農化價值損失補償之外,其應該承擔耕地保護的生態服務價值和社會穩定價值,并以此為基礎建立耕地保護基金提供給耕地保護者,地方政府和非農用地企業要承擔耕地非農化損失全部價值補償。(2)耕地資源價值具有較強的區域性差異性,建立耕地價值評價和修正體系是今后需要解決的重要技術問題之一。(3)該評價方法和結果可用于耕地資源非農化價值損失評價實踐,研究結果為中央政府應承擔耕地保護基金提供了理論依據,為具體補償標準制定提供了技術支撐,為耕地補償機制建立提供了一個新的視角,有助于改變傳統耕地保護模式并建立耕地保護補償新機制。
    基于種業市場份額的中國種業國際競爭力分析
    王磊, 劉麗軍, 宋敏
    中國農業科學. 2014, 47(4):  796-805.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.020
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    【目的】種業是國家戰略性、基礎性核心產業,中國巨大的種業市場正成為主要跨國公司競爭的焦點。種業競爭力不僅決定種業自身發展,而且也決定農業產業安全,不斷提升種業競爭力是保障現代農業持續健康發展和國家糧食安全的根本。隨著經濟全球化、全球市場一體化進程的加快,市場份額競爭成為現代種業國際競爭的焦點,因此,從種業市場份額角度開展中國種業國際競爭力研究,以期全面、準確、科學的認識中國種業國際競爭力水平。【方法】運用國際種子聯盟(ISF)、世界貿易組織(WTO)以及中國海關統計資訊室發布的相關數據,利用統計分析與顯示性比較優勢指數(RCA)、出口質量升級指數(QC)等常用市場份額分析指數對中國種業國際競爭力進行描述性與實證分析。【結果】中國雖然擁有世界上第二大的種子市場(2012年為99.50億美元,僅次于美國120億美元),但在全球種子市場份額競爭中,得到的國外市場份額少,失去的國內市場份額多;出口市場主要集中在亞洲(59.04%),而種子大額市場非洲(0.83%)和南美洲(0.18%)等占據的份額較少;競爭優勢品種缺乏,相對來說,目前蔬菜與水稻種子占有的市場份額較多,均在1億美元左右,而全球種子市場需求旺盛的小麥、玉米、大豆等種子占據的市場份額較少,均不到0.01億美元。整體來看中國種業國際競爭力較差。從RCA計算結果來看,中國種業RCA指數較低且遠小于評價標準值0.8,與美國、荷蘭等種業強國相比還有很大差距,中國種業不具備顯示性比較優勢,種業國際競爭力較差但競爭力上升趨勢明顯,相對來說,蔬菜品種競爭力要高于農作物品種;從QC計算結果來看,中國種業種子出口質量升級指數大于評價標準值1且高于美、荷等種業強國,出口的各類型種子除小麥種子與大豆種子外其余種子附加值均相對較高,其中,2011年蔬菜種子QC值甚至達到了4.86,遠高于判定標準值1,中國種業種子產品具有一定的質量競爭優勢。【結論】中國種業在國際市場份額競爭中處于弱勢地位,不具有顯示性比較優勢,出口市場集中且品種類型單一,競爭力較弱但整體處于上升態勢;種業產品除小麥、大豆外,水稻、玉米、油菜、向日葵、甜菜、棉花、草本花卉植物、瓜果、蔬菜及牧草等作物種子目前附加值均較高,中國種業種子產品具有質量競爭力且各類型種子質量上升趨勢明顯,中國種業應注重以此為契機加速提升和鞏固種業市場份額的拓展和掌控能力,以便應對日益激烈的國際種業市場份額競爭。
    研究簡報
    亞洲璃眼蜱不同發育階段及其組織中microRNA-10表達分析
    袁小松1, 2, 羅金1, 田占成1, 謝俊仁1, 王芳芳1, 田美媛1, 張以芳2, 劉光遠1
    中國農業科學. 2014, 47(4):  806-813.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.021
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    【目的】MicroRNA(miRNA)是一類長度為20—22個核苷酸(nt)且高度保守的非編碼小RNA。迄今為止,在病毒、動物、植物中都有發現,如在Mareks病毒、果蠅、斑馬魚、人類以及擬南芥等多種生物中都有存在。其通過與靶基因特異性的堿基互補配對使靶基因降解或者受到抑制,在轉錄后水平調控靶基因的表達水平。miRNAs參與多種生物的細胞增殖、分化、代謝與死亡等多種生物學過程。為了解microRNA-10在亞洲璃眼蜱中的潛在生物學功能,試驗獲得亞洲璃眼蜱miR-10的前體、成熟體序列;分析亞洲璃眼蜱不同發育階段及組織miR-10的表達水平,及亞洲璃眼蜱miR-10的生物學意義;為進一步研究miR-10與亞洲璃眼蜱生長發育間的關系奠定基礎。【方法】用Trizol Reagent分別提取不同發育階段及組織的總RNA,用SYBR ®Prime Script TMmiRNA RT-PCR Kit( TaKaRa Code: RR716) 制備cDNA。參考miRBase數據庫中isc-miR-10(登錄號:MI0012262)序列,設計特異性引物,通過PCR的方法從亞洲璃眼蜱中擴增獲得miR-10前體序列,通過MEGA4軟件將此前體序列與已知物種的miR-10前體序列進行比對分析;利用qPCR技術分析亞洲璃眼蜱不同發育階段及組織miR-10的表達情況;推測miR-10在亞洲璃眼蜱中的生物學功能。【結果】獲得亞洲璃眼蜱miR-10的前體序列CUACAUCUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUUUGCCACUAGACUACAAAUUCGGUUCUAGAGAGGCUUUGUGUGG,大小為73bp;亞洲璃眼蜱的miR-10前體序列與肩突硬蜱的相似性最高,是95.9%,且與其他節肢動物相似性在88.9%—91.7%之間;miR-10在不同物種間高度保守。miR-10的成熟體序列為UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU,種子序列為ACCCUGU。在亞洲璃眼蜱的不同發育階段中,饑餓若蜱的miR-10的表達水平最高,是卵的48.3倍;饑餓成蜱是卵的7.78倍;饑餓幼蜱是卵的2.78倍。在饑餓雌性成蜱吸血過程中,吸血3d的成蜱是饑餓成蜱的約4.28倍,吸血5d的成蜱是饑餓成蜱的約0.31倍,飽血自然脫落的成蜱是饑餓成蜱的約0.087倍。吸血初期miR-10的表達量上調,隨著吸血時間的延長其表達量逐漸下調;在唾液腺、氣管、卵巢、表皮、中腸中miR-10的表達情況有明顯不同,其中唾液腺的表達量最高,是表皮的13.2倍;卵巢的表達量是表皮的2.98倍,氣管的表達量是表皮的6.46倍。【結論】從亞洲璃眼蜱中克隆miR-10序列,序列分析顯示此序列在節肢動物中相對保守。miR-10在亞洲璃眼蜱不同發育階段及不同組織的表達明顯不同,表明其表達具有選擇性;依據miR-10表達的差異性及已報道miR涉及的生物學功能,推測miR-10在亞洲璃眼蜱的細胞增殖、發育及吸血方面有潛在的重要作用。本研究為寄生蟲miRNAs功能的研究提供一定的依據,并有可能為防控寄生蟲疾病開辟新的途徑。
    伊拉兔宰后肌糖原變化及其與兔肉品質的相關性
    薛山, 賀稚非, 李洪軍
    中國農業科學. 2014, 47(4):  814-822.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.022
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    【目的】探討伊拉兔宰后36 h內肌糖原變化規律及與肉品品質變化的相關性。【方法】伊拉兔經屠宰之后,肌肉內的糖原會在一定時間內酵解轉化為乳酸,從而改變胴體的pH值,并進一步影響肉品的持水力、剪切力、肉色等品質指標。以伊拉兔背最長肌(LD)和左后腿肌(LL)為原料,用試劑盒法分別測定了伊拉兔宰后45 min、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h肌糖原含量的變化,并對兔宰后相應時間點的肉品品質指標如pH值、蒸煮損失、滴水損失、剪切力、色澤變化進行了檢測與分析。此外,將主要設計因子(pH、蒸煮損失、滴水損失、總損失、剪切力、L*、a*、b*、C*)作為X變量,以肌糖原的含量作為Y變量,用偏最小二乘回歸分析法(PLS2)對伊拉兔宰后LD和LL肉品品質與肌糖原變化規律的相關性進行探討。【結果】伊拉兔宰后36 h內部位LD和LL的肌糖原含量均下降顯著(P<0.05),二者分別從屠宰初期的(2.61±0.50)mg•g-1和(2.77±0.55)mg•g-1減少為宰后36 h的(0.94±0.05)mg•g-1和(0.99±0.07)mg•g-1。與此同時,伊拉兔LD和LL的pH分別從宰后初期的(6.91±0.02)和(6.85±0.04)下降至(5.62±0.09)和(5.61±0.09)。在此期間,隨著pH的下降,伊拉兔肉品品質指標也發生了相應地改變,如剪切力、亮度L*值、紅度a*值降低;蒸煮損失、滴水損失、總損失、b*值和C*值升高。PLS2分析顯示,以上各肉品品質指標與兔宰后肌糖原含量變化的相關性均較大,部位LD和LL的回歸系數R值分別達0.796—0.972和0.890—0.996。其中,2個部位的總損失指標(蒸煮損失與滴水損失之和)較其他肉品品質的差異來源更為顯著。此外,可以用以上兔肉宰后品質指標為自變量,運用Unscrambler建立回歸方程對肌糖原變化評分較好地進行預測。【結論】伊拉兔宰后36 h內肌糖原下降顯著,與其間肉品品質的變化密切相關,可利用其酵解規律與各品質指標的相關性建立回歸方程,從而對肌糖原含量變化進行較好地預測。
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