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當期目錄

    2014年 第47卷 第11期 刊出日期:2014-06-06
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    一個水稻早衰突變體基因的精細定位
    趙春德1, 2, 張迎信1, 2, 劉群恩1, 2, 余寧1, 2, 程式華1, 2, 曹立勇1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2069-2077.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.001
    摘要 ( 296 )   HTML ( 3 )   PDF (657KB) ( 753 )   收藏
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    【目的】對水稻葉片早衰突變體W330進行遺傳分析及精細定位,獲得控制突變表型的基因。【方法】用60Co-γ輻射誘變秈型水稻恢復系中恢8015,從突變體庫獲得一份葉片早衰突變體W330。對該突變體進行表型觀察和主要農藝性狀調查。利用多代自交穩定的突變體W330與粳稻品種02428雜交,觀察F1和 F2的表型,并統計F2群體中早衰突變表型與正常野生型的分離情況,分析該突變表型的遺傳行為。利用構建的F2群體進行精細定位和候選基因分析,然后對候選基因進行DNA測序、酶切分析、表達分析、酶活測定及進化分析。【結果】突變體W330從三葉期開始出現葉片衰老,直至抽穗期及黃熟期。與野生型相比,突變體W330株高變矮、分蘗減少、葉片變窄、抽穗期不變、每株有效穗數、每穗著粒數和結實率亦顯著降低。W330與02418雜交的F1表現正常,F2群體中正常植株與早衰突變植株的分離比符合3﹕1,表明突變體W330的突變性狀受1對隱性核基因控制。利用F2定位群體及SSR、Indel標記,最終將目標基因定位在第3染色體短臂上2個分子標記CD-5與CD-7之間,物理距離約為21.5 kb。基因預測表明該區域共有4個完整的ORFs。其中,LOC_Os03g0131200編碼一個過氧化氫酶OsCATC,基因組序列分析表明,W330突變體中的該基因從ATG開始第109位,在第一個內含子的末位發生了一個C到G的顛換,造成第一個內含子沒有剪切,最終導致翻譯提前終止,酶切試驗驗證了這一突變位點。與野生型親本中恢8015相比,W330突變體在三葉期葉片中的過氧化氫酶的活力下降了47.8%,而過氧化氫含量上升了2.7倍。由此,推定W330與OsCATC等位。系統進化分析發現,OsCATC與水稻中同源的過氧化氫酶不在同一進化分支上。實時熒光定量PCR發現,與其野生型相比,突變體W330葉片中的OsCATA和OsCATB的表達量顯著上升,而OsCATC的表達量沒有明顯的變化。推測,這3個高度同源的基因在水稻體內可能存在互補機制。【結論】W330突變體基因是已報道的過氧化氫酶基因OsCATC的等位基因。W330突變體在第一個內含子上發生的一個點突變造成可變剪切的發生,使得水稻一個過氧化氫酶失活,導致突變體W330突變表型的出現。
    基于基因特異性標記分析Pm21在中國冬小麥品種(系)中的分布
    江崢1, 2, 王琪琳1, 3, 吳建輝1, 3, 薛文波1, 2, 曾慶東1, 3, 黃麗麗1, 3, 康振生1, 3, 韓德俊1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2078-2087.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.002
    摘要 ( 341 )   HTML ( 1 )   PDF (666KB) ( 470 )   收藏
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    【目的】來自小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系的抗病基因Pm21對小麥白粉病具有持久和廣譜抗性,開發該基因的特異性標記,分析其在全國冬麥區中的應用情況,為Pm21的合理布局及分子標記輔助選擇育種提供理論依據和技術支撐。【方法】根據已克隆的與Pm21抗性途徑緊密相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因Stpk-V的序列(GenBank登錄號為HQ864471.1),提取其蛋白序列并利用Pfam軟件分析其保守結構域起止位點,在其保守結構域外設計開發特異序列標記WS-1;構建Pm21載體品種92R137和感病品種Avcoet S(AvS)的F2群體,以小麥白粉病菌E09對該群體每個單株進行苗期抗白粉病表型鑒定,同時利用WS-1對F2群體進行分子檢測,分析檢測表型與抗病表型,以驗證WS-1標記的準確性;利用WS-1標記對來自中國不同冬麥區的662份小麥品種(系)進行分子標記檢測,分析Pm21在不同麥區小麥品種(系)的分布情況,并將檢測到含有Pm21的品種(系)在田間進行抗白粉病鑒定;選取WS-1已檢測到及沒有檢測到Pm21的品種(系)各50份,利用曹愛忠等開發的標記NAU/xibao15902進行PCR擴增,進一步證明WS-1的準確性。【結果】(1)開發的Pm21特異標記WS-1為顯性標記,含Pm21的小麥材料在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中擴增出一條大小為949 bp的片段,而不含該基因的小麥材料中無該片段。(2)在包含377個株系的F2群體中,286個單株為抗病,91個單株為感病,抗感比符合3﹕1的分離比例,表明在該群體中Pm21表現為顯性單基因,WS-1對F2群體的每個株系的檢測結果與抗/感表型完全一致。(3)供試的662份小麥材料中,49份攜帶Pm21,平均分布頻率為7.4%,其中,西南冬麥區中檢測到33份,占該區參鑒品種(系)數的34.4%,而北部冬麥區、黃淮冬麥區和長江中下游冬麥區,分別檢測到4份、9份和3份,各占該區參鑒品種(系)數的5.3%、3.1%和1.5%。【結論】開發的Pm21特異性標記WS-1可以作為該基因的檢測標記,也可應用到今后的基因聚合育種中;該基因在不同麥區分布相差很大,其中,西南冬麥區四川、貴州省的小麥品種(系)中Pm21使用頻率過高,有促進病原菌定向選擇的風險,在當前小麥育種中應給以重視。
    綠豆高密度分子遺傳圖譜的構建
    吳傳書1, 2, 王麗俠2, 王素華2, 陳紅霖2, 吳健新2, 程須珍2, 楊曉明1, 3
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2088-2098.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.003
    摘要 ( 340 )   HTML ( 1 )   PDF (1223KB) ( 878 )   收藏
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    【目的】在前期研究的基礎上,進一步利用綠豆基因組SSR、EST-SSR、STS和普通菜豆基因組SSR等標記構建綠豆遺傳連鎖圖譜,為綠豆重要性狀相關基因的定位、克隆及分子標記輔助選育新品種等研究搭建技術平臺。【方法】利用澳大利亞引進的Berken(高感豆象綠豆栽培種)× ACC41(高抗豆象綠豆野生種)及其重組自交系(recombinant inbreed line,RIL)群體,對6 686對引物進行PCR擴增及多態性篩選,包括6 100對綠豆基因組SSR、149對EST-SSR、13對STS和424對普通菜豆基因組SSR引物,將親本間多態性引物,進一步分析重組自交系群體。結合前期研究的分子標記數據,利用Mapmarker/Exp 3.0軟件構建遺傳圖譜,并設置LOD≥3.0,最大圖距50.00 cM。用Joinmap 4.0軟件進行圖譜整合。【結果】用2個親本共篩選了6 686對SSR引物,共有3 691對引物有穩定的擴增產物,得到有多態的引物有588對。其中,通過磁珠富集法開發的綠豆SSR引物6 100對,有效擴增3 459對,有效擴增率56.7%,得到多態性引物559對;通過轉錄組測序開發的綠豆MGCP引物149對,有效擴增126對,有效擴增率84.6%,得到多態性引物21對;通過磁珠富集法開發的菜豆SSR引物424對,有效擴增97對,有效擴增率22.9%,得到多態性引物6對;綠豆STS引物13對,有效擴增9對,有效擴增率69.2%,得到多態性引物2對。表明不同來源和種類的SSR引物在RIL群體親本中的有效擴增率有明顯差別,綠豆EST-SSR引物(84.6%)最高,綠豆STS引物(69.2%)和SSR引物(55.7%)次之,菜豆SSR引物(22.9%)最低。獲得一張含有585個標記(499個SSR標記、74個RFLP標記、9個STS標記和3個RAPD標記)的綠豆遺傳圖譜,圖譜總長732.9 cM,包括11個連鎖群,每個標記間的平均距離為1.25 cM,平均長度為66.63 cM。每個連鎖群長度為45.2—112.8 cM,每條染色體上面的標記數為35—92個,平均53.18個。標記位點數最多的連鎖群LG1含92個標記,長度為112.8 cM;標記位點數最少的連鎖群LG11僅含有35個標記,長度為48.7 cM。對圖譜的585個標記位點進行χ2測驗,在P<0.05和P<0.01條件下,分別有79個和151個標記表現為偏分離,占總標記位點數的39.3%。【結論】構建了一張目前國內外發表的標記數最多、密度最高的綠豆遺傳連鎖圖譜。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    精確定量施肥對貴州高原山區雜交秈稻產量與群體質量的影響
    羅德強1, 2, 王紹華1, 江學海1, 2, 李剛華1, 周維佳2, 李敏2, 姬廣梅2, 丁艷鋒1, 凌啟鴻1, 劉正輝1
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2099-2108.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.004
    摘要 ( 325 )   HTML ( 1 )   PDF (704KB) ( 611 )   收藏
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    【目的】水稻產量在很大程度上受環境、栽培技術等多種因素的影響。根據各地的氣候特點有針對性地采用栽培技術,可以充分挖掘水稻產量潛力,大幅度提高單產。論文旨在探明精確定量施肥對貴州高原山區雜交秈稻群體質量及產量形成的影響效應。【方法】于2010—2011年在貴州省黃平、綏陽、余慶、興義4個不同生態稻區,以當地具有高產潛力的雜交秈稻品種為試材,設計精確定量施肥模式(accurate fertilizer,AF)與常規施肥模式(conventional fertilizer,CF),通過對兩種施肥模式的比較,研究不同施肥模式的群體質量及產量形成的差異。精確定量施肥模式以斯坦福(Stanford)方程為基礎,根據目標產量需氮量、土壤供氮量及氮肥當季利用率計算總施氮量,各階段的施肥量根據目標產量的階段需氮量確定。精確施肥模式的總氮按照基肥﹕分蘗肥﹕促花肥﹕保花肥為30%﹕20%﹕35%﹕15%施用,常規施肥模式氮素總量按基肥﹕分蘗肥﹕促保花肥為20%﹕60%﹕20%施用。在有效分蘗臨界葉齡期、拔節期、抽穗期、成熟期分別取地上部分測定葉面積和干物質量,成熟期考查穗數、穗粒數、結實率和千粒重。【結果】精確定量施肥模式顯著提高了黃平、綏陽、余慶、興義4個點的水稻產量,增產幅度為12.4%—48.0%,從產量構成因素看,穗數和穗粒數均較常規施肥模式有不同程度提高,穗數增加8.1%以上,穗粒數增加2.5%以上,群體穎花量增加14.3%以上,而結實率和千粒重兩種施肥模式的差異較小;比較分析兩種施肥模式的穗型大小,精確定量施肥模式較常規施肥模式穗粒數小于100粒的小穗比例降低、100—250粒的大穗和250粒以上的特大穗比例增加,小穗比例減少了36.7%—100%,大穗比例提高了2.2%—11.4%,特大穗比例提高了23.3%—94.9%;在葉面積指數與粒葉比方面;精確定量施肥模式比常規施肥模式的群體葉面積指數拔節前有所降低(4.2%—11.8%)、抽穗期顯著提高(4.2%—13.9%);粒葉比明顯增大,其中穎花/葉為9.3%—32.7%、實粒/葉為12.8%—35.7%、粒重/葉為10.1%—36.3%;干物質積累量表現為精確定量施肥模式比常規施肥模式拔節前有所降低,拔節至抽穗期提高了9.8%—50.8%,抽穗至成熟期提高了26.9%—62.7%。【結論】精確定量施肥模式顯著提高了貴州雜交秈稻產量,其途徑主要通過控制拔節前的群體生長,促進拔節后的群體發展,適度減小拔節前群體葉面積和干物質積累,擴大拔節后尤其是抽穗后群體葉面積和干物質積累,在穩定提高穗數的基礎上,控制晚生小穗數量、促進大穗形成,提高穗粒數和粒葉比,實現抽穗后群體干物質的高積累,從而獲得高產。
    高溫和外源ABA對不同持綠型小麥品種籽粒發育及內源激素含量的影響
    楊東清1, 王振林1, 倪英麗1, 2, 尹燕枰1, 蔡鐵1, 楊衛兵1, 彭佃亮1, 崔正勇1, 江文文1
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2109-2125.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.005
    摘要 ( 298 )   HTML ( 1 )   PDF (818KB) ( 881 )   收藏
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    【目的】探討花后高溫和外源脫落酸(ABA)對不同持綠型小麥籽粒胚乳細胞增殖、籽粒灌漿和內源激素的影響,為高溫逆境下采用激素調控措施提高粒重提供理論依據。【方法】選用持綠型汶農6號和非持綠型濟麥20,花后1—5 d,用透明聚乙烯塑料膜搭設增溫棚進行高溫處理,同時花后1—3 d噴施10 mg?L-1的ABA于穗部,用量100 mL?m-2,3次重復。定期取籽粒樣,用高效液相色譜法測定4種內源激素,用簡易胚乳細胞計數法測定胚乳細胞數目,Richard方程對籽粒增重及胚乳細胞增殖動態模擬并計算相關參數。【結果】高溫處理顯著降低了兩品種強弱勢籽粒的胚乳細胞數目,降低胚乳細胞增殖速率,但延長了籽粒胚乳細胞活躍分裂期和實際分裂終期;顯著降低兩品種弱勢籽粒的灌漿速率,縮短了兩品種弱勢粒的生長活躍期及實際灌漿終期。高溫處理顯著降低兩品種千粒重和穗粒數,其中汶農6號強、弱勢粒分別減少3.7和8.2 粒/穗,濟麥20強、弱勢粒分別減少1.3和4.3 粒/穗;顯著降低兩品種產量,汶農6號和濟麥20產量分別降低19.65%和26.22%。常溫及高溫下噴施ABA均顯著提高了兩品種灌漿速率,提高了籽粒胚乳細胞增殖速率,擴大胚乳細胞數目。高溫處理降低了強弱勢籽粒ZR含量,顯著提高了濟麥20強、弱勢粒花后3—27 d的GA3含量,顯著提高汶農6號花后12—27 d的GA3含量;但降低了弱勢粒花后15—27 d的IAA含量。高溫處理下噴施ABA,降低了濟麥20強勢粒花后3—9 d ZR含量,但顯著提高濟麥20強勢粒花后3—28 d內源ABA含量,顯著提高汶農6號強勢粒花后3—18 d ABA含量。常溫下噴施ABA顯著降低了濟麥20和汶農6號強、弱勢粒的GA3含量;高溫下噴施ABA,顯著降低了汶農6號強弱勢粒的GA3含量,降低濟麥20強勢粒花后3—12 d的GA3含量,顯著降低弱勢粒花后6—15 d的GA3含量。常溫下噴施ABA顯著提高濟麥20強勢粒花后12—18 d的IAA含量;提高了汶農6號強勢粒花后6—18 d IAA含量,顯著提高兩品種弱勢粒花后6—27 d IAA含量。持綠型汶農6號的千粒重和產量均顯著大于非持綠型濟麥20。【結論】高溫脅迫對非持綠型品種的產量和兩品種弱勢粒粒數影響較大,高溫降低了兩品種籽粒胚乳細胞數目,降低籽粒灌漿速率,最終導致粒重及產量降低。噴施外源ABA通過調節內源激素水平,促進胚乳細胞分裂,擴大了常溫及高溫下籽粒庫容量,提高了籽粒灌漿速率,從而提高了籽粒產量。
    硒減輕油菜幼苗硼毒害機理的研究
    段碧輝, 劉新偉, 矯威, 趙竹青, 胡承孝
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2126-2134.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.006
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (480KB) ( 600 )   收藏
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    【目的】硼是植物生長發育所必需的微量元素,但在土壤中過量存在會對植物產生毒害。在干旱半干旱地區硼毒害是限制作物生長的重要因子,此外,硼礦開采以及硼肥用量過大或施用不均勻均會導致硼濃度過高,從而限制作物生長。適量硒能提高作物抗性,減輕作物因逆境產生的傷害,本文旨在通過適量硒處理,研究硒對高硼條件下油菜生物量及油菜活性氧代謝的變化,探討硒緩解高硼對油菜生長抑制作用的機理,進而提高作物對硼的適宜范圍,減輕硼毒害對農業生產的危害。【方法】本文以油菜(湘農油571)為試驗材料,設置硼和硒2因素2水平(硼水平為:50、500 μmol•L-1,分別用B50、B500表示,硒水平為:0、1 μmol•L-1,分別用Se0、Se1表示)完全隨機試驗,共4個處理,通過苗期溶液培養,研究硒對高硼(500 µmol•L-1)脅迫條件下油菜幼苗生長、硼吸收累積和抗氧化酶及非酶系統的影響。【結果】高硼脅迫條件下油菜幼苗地上部和地下部干物質重顯著降低,與正常硼(50 μmol•L-1)處理相比分別降低20.1%和32.0%;硼含量和累積量顯著增加,與正常硼處理相比分別增加2.95和2.97倍;油菜幼苗因硼毒害導致葉片內抗氧化酶(過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX))活性和非酶抗氧化物(谷胱甘肽(GSH))含量顯著降低,與正常硼處理相比,CAT、POD和APX活性分別降低19.7%、11.0%和15.0%;而過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量顯著增加,比正常硼處理分別增加19.0%和18.5%。高硼條件下,經1 μmol?L-1硒處理,與無硒處理相比,地上部和地下部干物質重分別增加22.8%和28.6%,硼含量和累積量分別降低38.6%和31.9%;油菜幼苗葉片內抗氧化酶活性和非酶抗氧化物含量顯著增加,CAT、POD和APX活性分別增加12.8%、15.1%和15.3%,GSH和ASA含量分別增加9.7%和21.0%;而過氧化氫和丙二醛含量分別降低25.1%和21.2%。【結論】適量硒可降低高硼脅迫下油菜幼苗硼的吸收累積,增強抗氧化酶和非酶系統抗氧化作用,降低活性氧累積,減輕細胞質膜因過氧化作用而產生的損傷,從而顯著減輕過量硼對油菜生長的影響,提高油菜幼苗對硼過量的適應性。
    基于邊界域修正粗糙熵模型的遙感影像分類不確定性評價
    競霞1, 2, 魏曼3, 王紀華1, 宋曉宇1, 胡榮明2
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2135-2141.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.007
    摘要 ( 250 )   HTML ( 1 )   PDF (1628KB) ( 460 )   收藏
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    【目的】遙感影像分類是獲取地表覆蓋信息的有效技術手段,客觀合理地評價遙感影像分類的不確定性對農業資源調查、作物估產等方面的遙感應用具有重要的意義。論文針對修正粗糙熵模型在評價遙感影像分類不確定性時存在的問題,構建基于邊界域修正粗糙熵模型的遙感影像分類不確定性評價指標,以期更好地度量地物類別尺度上的遙感影像分類的不確定性。【方法】考慮邊界域對遙感影像分類結果不確定性的影響,對修正粗糙熵模型進行改進,以類別的邊界域被分類知識劃分的結果取代所有像元被分類知識劃分的結果作為衡量分類知識不確定性的依據,建立基于邊界域的修正粗糙熵模型。首先依據粗集理論對所建模型的合理性進行數學推導,然后以北京市的Landsat TM影像和新疆石河子地區的IKONOS影像為例,分別應用修正粗糙熵模型和基于邊界域的修正粗糙熵模型對分類結果在地物類別尺度上的不確定性進行評價,用不同空間分辨率和不同研究區域的試驗數據的不確定性評價結果印證理論推導結論。【結果】與修正粗糙熵模型相比,基于邊界域的修正粗糙熵模型在評價遙感影像分類的不確定性時能夠更好地刻畫分類知識所引起的不確定性,使遙感影像分類結果的評價更加客觀和合理。通過對兩種模型下試驗數據的分析表明,當所研究的地表覆蓋類型在研究區域內的分布比較零碎,成片區域不多,類別與類別之間的邊界部分所占比重較大,混合像元現象比較嚴重的時候,采用修正粗糙熵模型計算遙感影像分類結果的不合理性還不是非常明顯,還能夠比較客觀地反映遙感影像分類的不確定性問題。但是如果評價分布比較集中,面積比較大的地物類型的分類精度時,修正粗糙熵模型則難以客觀地反映遙感影像分類的不確定性問題,其評價結果的不合理性也更為明顯。【結論】采用修正粗糙熵模型進行遙感影像分類的不確定性評價時,放大了由于邊界域存在所產生的不確定性,而基于邊界域的修正粗糙熵模型則可以較好地避免這一情況的發生,更合理地度量地物類別尺度上的遙感影像分類的不確定性。
    植物保護
    通過缺失大麗輪枝菌Vdku80構建其高效基因敲除受體菌株
    田李1, 劉娜1, 徐榮旗2, 曲志才1, 劉乾1
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2142-2150.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.008
    摘要 ( 263 )   HTML ( 1 )   PDF (642KB) ( 596 )   收藏
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    【目的】驗證大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)非同源末端連接途徑關鍵基因Vdku80的功能,構建高效的大麗輪枝菌基因敲除受體菌株。【方法】利用常規基因敲除的方法,構建大麗輪枝菌Vdku80基因缺失的突變體菌株ΔVdku80。即將Vdku80的同源重組DNA片段(Vdku80的基因組上下游DNA片段之間連接潮霉素抗性基因)通過農桿菌介導的轉化轉入大麗輪枝菌,通過同源區段的重組,潮霉素抗性基因便會替換掉野生型Vdku80,從而獲得突變體菌株ΔVdku80。對突變體菌株ΔVdku80的生物學表型,即生長速率、產孢量和對棉花的致病性進行測試。分別以大麗輪枝菌野生型菌株和ΔVdku80作為受體菌株,采用上述基因敲除方法測試2個幾丁質合成酶編碼基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【結果】成功構建了Vdku80缺失突變體ΔVdku80。野生型和突變體菌株ΔVdku80在PDA培養基上的菌落形態相似,且培養8 d后菌落直徑無明顯差別。野生型和突變體菌株ΔVdku80產孢高峰均出現在搖瓶培養后第5天,且該時期產孢量亦無明顯的變化。濃度為0.02%的MMS對野生型和突變體菌株ΔVdku80的生長均有明顯的抑制作用,且抑制程度相同。接種野生型和突變體菌株ΔVdku80 4周后,棉株真葉均開始表現出萎蔫、褪綠等發病癥狀,野生型和突變體菌株ΔVdku80對棉花造成的病情指數分別為54.2±4.9和53.6±5.4,亦無明顯變化。因此,突變體菌株ΔVdku80的生長速率、產孢量和致病性相對于野生型菌株均未發生明顯變化。使用野生型菌株作為基因敲除的受體菌株,幾丁質合成酶編碼基因ChsV和ChsVI的基因敲除轉化子在總轉化子中的比例分別為44%和31%;而使用ΔVdku80作為基因敲除的受體菌株,幾丁質合成酶編碼基因ChsV和ChsVI基因敲除轉化子在總轉化子中的比例分別為94%和87%。【結論】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作為受體菌株可以提高其他基因的基因敲除效率,且Vdku80的缺失對大麗輪枝菌的生長速率、產孢量和致病性均無影響,因此不會干擾其他基因的敲除所帶來的表型變化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作為高效的大麗輪枝菌基因敲除受體菌株。
    柑橘木虱黃龍病菌攜帶量與其內生菌群相關性
    孫麗琴, 殷幼平, 王芳, 吳曉芳, 王中康
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2151-2161.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.009
    摘要 ( 316 )   HTML ( 1 )   PDF (818KB) ( 668 )   收藏
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    【目的】分析柑橘木虱(Diaphorina citri)體內可能與黃龍病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)互作的內生細菌,為黃龍病菌的人工培養及其病害防控奠定基礎。【方法】首先通過傳統分離培養方法比較不同地理來源帶黃龍病菌(帶菌)和不帶菌黃龍病菌(不帶菌)的木虱中可培養內生細菌的差異。其次將帶菌狀況不同的木虱分別分為頭、胸、腹3部分,經PCR擴增其16S rDNA的V6—V8區,用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)方法,比較帶菌狀況不同的木虱內生細菌的差異和木虱不同部位內生細菌的差異。選擇3種差異的內生細菌:Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.,在8份帶菌狀況不同的木虱樣品中通過q-PCR分別對其進行實時熒光定量分析,再以總細菌量為校正計算包括黃龍病菌在內的4種細菌的相對含量,數據經LSD檢驗,以各種細菌相對含量的-lg值作圖,先比較同一樣品中3種細菌分別與黃龍病菌的相對含量關系,再比較同種細菌在不同樣品中的特性,分析3種內生細菌和黃龍病菌的互作關系。【結果】不帶菌木虱中可培養內生菌菌落豐富度和菌落形成單位均大于帶菌木虱中。在不帶菌木虱中共獲得14株形態不同的菌株,分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus,3株)、歐文氏菌屬(Erwinia,1株)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella,1株)、葡萄球菌屬(Staphylococcus,2株)、節桿菌屬(Arthrobacter,1株)、泛菌屬(Pantoea,2株)、果膠桿菌屬(Pectobacterium,1株)、沙門氏菌屬等(Salmonella,1株)、鏈霉菌屬(Streptomyces,1株)、Massilia brevitalea(1株)等10個細菌屬。在帶菌木虱中分得的4株細菌在不帶菌木虱中均分離到,分屬于克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、果膠桿菌屬。其中Dc-11(嗜氣芽孢桿菌屬)在帶菌木虱和不帶菌木虱中分離頻率均達到100%,表明其為木虱體內常駐細菌;對木虱不同部位(頭、胸、腹)內生細菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜顯示,帶菌與不帶菌木虱中細菌種群差別明顯,帶菌狀況相同的木虱不同部位之間差別不明顯。其中優勢條帶10 (Wolbachia sp.)、12(Wolbachia pipientis)、13(Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri)、14(Uncultured bacterium)、19(Serratia marcescens)、21和22(均為嗜麥芽寡養單胞菌Stenotrophomonas maltophilia)在木虱體內穩定存在,帶菌木虱腹部特有優勢內生細菌為Enterobacter sp.,木虱中同樣也存在次級內生菌Wolbachia。q-PCR的結果驗證了所選的3種細菌在前期傳統分離培養和16S rDNA-PCR-DGGE中結果的可靠性,同時表明腸桿菌屬在8份樣品中與黃龍病菌呈正相關關系。【結論】黃龍病菌進入木虱體內會改變木虱內生細菌菌群種類和結構;嗜氣芽孢桿菌(B. aerophilus)在柑橘木虱體內穩定存在,為木虱體內常駐菌群;Enterobacter sp.與黃龍病菌帶菌量呈正相關,推測其可能與黃龍病菌互作。
    綠盲蝽超氣門蛋白ALUSP的克隆、原核表達及純化
    譚永安, 肖留斌, 孫洋, 趙靜, 柏立新
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2162-2172.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.010
    摘要 ( 296 )   HTML ( 1 )   PDF (1765KB) ( 542 )   收藏
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    【目的】克隆綠盲蝽超氣門蛋白基因(ALUSP),獲得原核表達的重組蛋白,為ALUSP的功能研究奠定基礎,也為進一步解析綠盲蝽蛻皮及變態發育的機制提供理論依據。【方法】根據已知昆蟲的USP基因序列設計簡并引物,獲得ALUSP的保守序列;再通過設計特異性引物,利用RACE方法,分別克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通過拼接獲得ALUSP全長序列;應用生物信息學方法,對ALUSP基因序列特征及其所編碼蛋白的特性進行分析,建立系統進化樹;將含有ALUSP的T載體經EcoR I及Xho I雙酶切,構建ALUSP原核表達載體pEGX6P1-ALUSP,將該表達載體分別在15、25、30和37℃條件下進行誘導表達,再通過GST瓊脂糖親和層析和分子篩層析后獲得ALUSP功能區純化蛋白。【結果】ALUSP開放閱讀框長1 005 bp,編碼334個氨基酸,預測分子量56.63 kD,理論等電點8.42;序列特征分析表明,該基因翻譯后的蛋白質具有超氣門蛋白的典型特征,由A/B域(249 bp)、C域(198 bp)、D域(69 bp)和E域(489 bp)組成,其中C域高度保守,包含2個鋅脂結構并含有1個P-盒和1個D-盒,且含有由8個氨基酸構成的核定位信號,D域含有1個識別DNA元件的T-盒,E域含有1個由8個α螺旋和1個β折疊形成袋狀結構;氨基酸比對結果表明,ALUSP的氨基酸序列與稻綠蝽USP序列一致性最高(57.82%),與其他昆蟲的USP序列一致性較低,如膜翅目的Melipona scutellaris(46.05%)、Scaptotrigona depilis(45.94%);系統進化樹分析結果顯示,半翅目與膜翅目、直翅目等昆蟲的USP較為分化,位于不同分支,ALUSP與稻綠蝽USP進化關系最近,可能來源于共同的祖先。EcoR I和Xho I雙酶切的重組克隆載體可成功亞克隆到pEGX-6P-1載體上,命名為pEGX6P1-ALUSP;經37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG誘導的pEGX6P1-ALUSP重組質粒可特異性表達1個約65 kD的蛋白,并且該重組ALUSP蛋白主要以包涵體形式存在;收集含有目的基因的菌株進行GST瓊脂糖親和層析和分子篩層析,最后進行復性和純化后在65 kD附近僅出現1條清晰的特異性條帶,表明已得到純化的靶蛋白。【結論】克隆了ALUSP全長,其具有昆蟲超氣門蛋白的典型特征,并獲得了原核表達的重組蛋白。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    長期不同施肥紅壤粒徑分布的多重分形特征
    孫梅1, 2, 孫楠2, 黃運湘1, 徐明崗2, 王伯仁2, 張旭博2
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2173-2181.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.011
    摘要 ( 283 )   HTML ( 2 )   PDF (700KB) ( 492 )   收藏
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    【目的】通過探討長期不同施肥后紅壤粒徑分布非均勻性和異質性的變化特征,揭示不同施肥模式對土壤粒徑分布的影響,為農田土壤發育過程以及科學合理利用紅壤提供理論支撐。【方法】以湖南省祁陽試驗點紅壤旱地長期定位試驗(1990年至今)為依托,采用激光粒度分析儀測定1990年初始土樣(O)與連續22年不施肥(CK)、單施化肥(NPK)、有機無機配合施用(NPKM)和單施有機肥(M)4種施肥模式下小麥-玉米輪作系統中耕層土壤(0—20 cm)顆粒分布;應用多重分形理論以盒計維方法分析了土壤粒徑分布多重分形參數的變化趨勢;并對多重分形參數、土壤顆粒與土壤有機質進行相關性分析,闡明多重分形參數表征土壤粒徑分布的精準性。【結果】多重分形參數可以反映土壤粒徑分布的非均勻程度,與紅壤黏、粉粒含量、土壤有機質含量顯著相關;運用多重分形參數表征土壤粒徑分布具有較高的靈敏性與精準度。紅壤粒徑廣義維數(D(q))在﹣10≤q≤10的范圍內,其中D(q<0)比D(q>0)更為敏感,表明廣義維數(D(q))在稀疏區域的標度性低于密集區域的標度性。與初始土樣(O)相比,長期不同施肥對容量維數(D0)與信息維數(D1)無顯著影響,但顯著提高了關聯維數D2(0.864—0.883)、D1/D0(0.921—0.932);處理間均表現為M、NPKM>NPK、CK、O,也顯著提高了奇異強度α0(1.129—1.177)和奇異譜寬Δα(1.966—2.707)等多重分形參數,處理間均表現為NPK、CK>M、NPKM>O。【結論】在成土條件、種植制度和管理措施均一致的條件下,無論是單施有機肥(豬糞)還是有機肥(豬糞)配合施用化肥均可以顯著提高紅壤粒徑分布局部密集程度,促進土壤細化,加快土壤不均勻性發展,增強了土壤顆粒異質性。多重分形參數可以表征土壤粒徑分布的細微差別,為土壤粒徑分布的精準研究提供了技術支持。
    辣椒生長對土體構造和水分條件的響應
    姬雅琳1, 邵明安2, 魏孝榮3
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2182-2192.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.012
    摘要 ( 250 )   HTML ( 1 )   PDF (560KB) ( 481 )   收藏
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    【目的】土體構造和土壤水分條件直接影響水分有效性,從而影響植物生長與生理過程。辣椒是中國重要的經濟作物之一,研究不同土體構造和水分條件處理對辣椒植株開花結果期比葉面積、光合作用和總蒸發量的影響,旨在揭示其生理機理和土壤物理學機制,從而為沙土區土壤改良提供科學依據。【方法】采用盆栽試驗,以湘研5號為供試材料,設計了4種土體構造模式(上土下沙、上沙下土、沙土混合和土壤)和3種水分條件(正常供水:75%—90%田間持水量(Field capacity,FC;適度缺水:60%—75% FC;嚴重缺水:45%—60% FC)處理,于開花結果初期(6月28日)、中期(7月10日)、后期(7月28日)和末期(8月10日)分別測定辣椒葉片的比葉面積(SLA)、凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr),同時記錄4個時期的總蒸發量數值。【結果】整個開花結果期內,上土下沙處理的比葉面積顯著高于其它處理;土壤和沙土混合處理中的葉片光合速率分別比上沙下土處理高35%和27%, 土壤、沙土和上土下沙處理的蒸騰速率分別比上沙下土高53%、34%和31%,在不同水分條件下光合和蒸騰速率差異不顯著,土壤、沙土混合和上土下沙處理中的葉片氣孔導度分別比上沙下土處理高64%、41%和40%,正常供水和適度缺水處理分別比嚴重缺水處理高29%和36%,表明土體構造處理對辣椒光合和蒸騰速率的影響大于水分的影響。土體構造對光合性能的影響與生育期與水分條件有關,光合速率在開花結果初期、中期和后期受土體構造影響,氣孔導度和蒸騰速率在初期受土體構造影響。正常供水和適度缺水條件下土壤和沙土混合處理葉片光合和蒸騰速率以及氣孔導度高于上沙下土處理,但嚴重缺水條件下不同土體構造處理差異不顯著。辣椒生長受生育期的顯著影響,末期的葉片比葉面積顯著高于其他3個時期;后期的葉片的凈光合速率和蒸騰速率顯著高于初期、中期和后期;初期、中期和后期的氣孔導度顯著高于末期。土體構造和水分條件對整個開花結果4個時期的總蒸發量影響顯著,土壤處理總蒸發量最高、上沙下土最低。【結論】土體構造處理對辣椒生長的影響大于水分對其的影響,同時土體構造對光合性能的影響與生育期和水分條件有關。半干旱沙土區土體構造改良可采用上土下沙和沙土混合模式,土壤水分條件控制在田間持水量的60%—75%為宜。
    園藝
    新疆紅肉蘋果雜種一代的遺傳變異及功能型蘋果優株評價
    陳學森, 張晶, 劉大亮, 冀曉昊, 張宗營, 張芮, 毛志泉, 張艷敏, 王立霞, 李敏
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2193-2204.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.013
    摘要 ( 304 )   HTML ( 1 )   PDF (715KB) ( 635 )   收藏
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    【目的】研究新疆紅肉蘋果與蘋果品種雜種F1群體童期、果實性狀的遺傳變異特點,并進行功能型蘋果優株評價,旨在為功能型蘋果育種技術體系的創建及新疆野蘋果資源的利用保存提供基本資料。【方法】以新疆紅肉蘋果與‘寒富’等蘋果品種6個雜交組合的雜種一代868株實生苗及從中選育出的4個優株為試材,以國外引進的紅肉蘋果‘德紅脆’及蘋果栽培品種‘金冠’為對照,檢測童期、果實單果重、硬脆度、可溶性固形物、可滴定酸、果皮與果肉總酚、抗氧化能力以及類黃酮含量與組分,討論功能型蘋果育種技術。【結果】新疆紅肉蘋果為親本的5個雜交組合在定植第3年的開花株率均在15%以上,童期僅2.33—4.33年,而對照‘金帥’ב寒富’蘋果雜交組合在定植第4年的開花株率僅為8.0%,童期3.33—5.33年;果肉花青苷含量等各性狀均出現廣泛分離,變異系數均在20%以上,進一步選擇的潛力很大;果皮與果肉總酚及花色苷含量的廣義遺傳力均在85%以上,遺傳能力較強;新疆紅肉蘋果的5個雜交組合均出現了紅-綿肉及紅-脆肉等株系的分離現象,其中紅肉和脆肉株系分離比率分別為26.2%—37.5%和23.9%—27.5%;紅肉面積較大的紅脆1號和10號總酚與花青苷含量、抗氧化能力及類黃酮含量和種類數極顯著地高于果肉略帶紅色的紅脆8號和白脆1號及其對照‘德紅脆’和‘金冠’。【結論】新疆紅肉蘋果與蘋果品種雜種F1結果年齡早,果皮與果肉總酚含量等功能成分遺傳能力強,從雜種F1代群體中能夠選育出抗氧化能力強、類黃酮含量含量高的功能型紅肉脆肉優良株系。
    蘋果細菌人工染色體雙色DNA纖維熒光原位雜交體系的建立及應用
    王三紅, 章鎮, 蔡斌華, 渠慎春
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2205-2213.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.014
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (616KB) ( 509 )   收藏
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    【目的】建立蘋果DNA纖維熒光原位雜交(Fiber FISH)技術體系,從而為利用該技術確定蘋果基因組DNA序列間的位置關系、構建精細物理圖譜等方面的應用奠定基礎。【方法】以‘Florina’蘋果幼葉為試材,通過液氮研磨,尼龍膜過濾和TritonX-100去除葉綠素等步驟提取細胞核。細胞核經堿裂解,采用蓋玻片拉伸方法制備DNA纖維。比較細胞核不同裂解時間和在5種不同包被類型的載玻片上DNA纖維拉伸的效果。用堿裂解方法提取來自蘋果‘Florina’自交不親和S9基因座的4個細菌人工染色體(Bacterium Artificial Chromosome)BAC 34G16、 BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的質粒經PEG純化,用地高辛或生物素標記探針。探針與DNA纖維制片經過80℃變性、37℃雜交2—3 d和洗片,采用“三明治”方法進行信號放大和檢測,在熒光顯微鏡下觀察試驗結果。【結果】建立了以蘋果幼葉為材料,液氮研磨提取細胞核,堿裂解細胞核和蓋玻片拉伸制備DNA纖維的試驗方法。提取的細胞核純凈、結構完整,細胞核濃度>5×103個/μL。試驗結果表明,細胞核裂解4 min,在多聚賴氨酸包被的載玻片上制備的DNA纖維平直、伸展均勻,纖維量多、細長,效果好。經原位雜交和信號檢測,獲得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的“念珠狀”雜交信號。對已知大小和位置關系的兩個BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19進行雜交信號測量和分析,得出BAC 克隆大小(Y,Kb)與信號長度(X,μm)的相關方程為Y=3.47X(R2=0.9215),其斜率即為該試驗技術體系Fiber FISH的分辨率3.47 kb•μm-1。試驗對未知大小和位置關系的兩個BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地進行了鑒定,它們大小分別為(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3 )kb,之間有(90.2±7.3)kb的重疊區域。【結論】建立了以蘋果幼葉提取細胞核,制備DNA纖維和原位雜交的方法,獲得了高分辨率的蘋果DNA纖維原位雜交試驗技術體系。
    貯藏·保鮮·加工
    60Co-γ輻照處理對低溫儲藏糙米品質及微結構的影響
    陳銀基1, 陳霞1, 蔣偉鑫1, 董文2, 陳兆波2, 戴炳業2
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2214-2223.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.015
    摘要 ( 441 )   HTML ( 1 )   PDF (795KB) ( 485 )   收藏
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    【目的】中國是稻谷消費大國,稻谷儲藏關系國家安全和社會穩定。輻照處理在食品儲藏加工領域廣泛應用。本研究欲通過分析60Co-γ輻照處理后糙米在1年的儲藏過程中蒸煮品質和質構品質的變化,闡明60Co-γ輻照處理對儲藏糙米品質的影響機理,為確定適用于糙米儲藏的γ輻照劑量水平參數和技術方法提供理論依據。【方法】晚粳稻谷收獲后,經去殼處理制成糙米,裝入塑料薄膜樣品袋,用輻照劑量分別為0.2、0.5、1.0和2.0 kGy的60Co-γ射線進行輻照。在測量初始指標后,恒溫(15±0.5℃)儲藏的1年期中,每3個月進行一次品質測定:用直鏈淀粉儀測定直鏈淀粉含量,用RNA黏度測定儀測定糊化參數,用物性測定儀測定米飯的質構品質,用掃描電鏡觀察輻照糙米淀粉顆粒的微觀結構。【結果】①糙米糊化峰值黏度隨儲藏時間延長而增加,不同輻照劑量處理后糊化峰值黏度增加趨勢不同,熱漿黏度和崩解值隨儲藏時間延長而增加;60Co-γ輻照降低了儲藏糙米蒸煮時糊化峰值黏度、熱漿黏度、最終黏度、回升值及崩解值,糊化溫度隨輻照劑量增加而升高,糊化溫度高糙米耐蒸煮,其蒸煮品質越高,各糊化品質中以輻照對糙米的糊化消減值和最終黏度影響最大,0.2 kGy就能顯著提高糙米的冷糊穩定性(P<0.05)、改善蒸煮品質,最終黏度的變化趨勢與消減值類似。②直鏈淀粉含量隨儲藏時間延長呈升高趨勢,60Co-γ輻照后糙米直鏈淀粉含量上升;對低表觀直鏈淀粉含量的大米,硬度與直鏈淀粉含量相關性不明顯(P>0.05)。③糙米在1年儲藏期內,蒸煮硬度隨儲藏時間呈上升趨勢,而輻照后糙米蒸煮硬度降低,0.5 kGy及以上劑量(1.0和2.0 kGy)的蒸煮糙米的硬度與未輻照糙米相比差異達顯著水平(P<0.05);輻照處理可以達到延緩黏著性下降的效果,所以,0.5 kGy的輻照就可改善儲藏糙米的蒸煮品質。④輻照處理對淀粉顆粒的結構和形態有修飾作用,淀粉顆粒間空間變大,糙米在蒸煮時可滲入更多水分,進而可以改善蒸煮品質。【結論】60Co-γ輻照處理可改變糙米淀粉顆粒形態和結構,0.5 kGy以上且不超過2.0 kGy的輻照劑量可改善儲藏糙米的蒸煮品質和質構品質。
    應用表面增強拉曼光譜技術快速檢測較大嬰幼兒配方奶粉中的香蘭素
    王石, 程劼, 蘇曉鷗
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2224-2232.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.016
    摘要 ( 363 )   HTML ( 1 )   PDF (675KB) ( 419 )   收藏
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    【目的】香蘭素(3-甲氧基-4-羥基苯甲醛)是一種嬰幼兒配方食品中常用的食品添加劑,因具有濃郁奶香被廣泛使用,但過量使用香蘭素會引起嬰兒肝腎損傷。目前,國家尚未出臺相關檢測標準,現場檢測手段相對缺乏,建立嬰幼兒配方奶粉中香蘭素檢測方法特別是現場快速檢測方法迫在眉睫。本文建立了基于納米金粒子的表面增強拉曼光譜對較大嬰幼兒配方奶粉中香蘭素的速測方法,為政府監管提供技術支撐。【方法】本文主要從樣品前處理方法優化,增強基底的制備以及上機參數的選擇3方面進行研究。比較不同萃取溶劑對香蘭素提取效率的影響,確立較佳的樣品前處理方法;研究不同粒徑的納米金膠溶液對香蘭素的表面增強拉曼光譜信號強度的影響,確定較佳的增強基底;探明pH、離子強度等對上機液的影響,得到較優的檢測條件。【結果】確立了較優的前處理方法:首先以飽和醋酸鉛溶液作為沉淀劑去除基質中蛋白,之后以二氯甲烷為萃取溶劑對香蘭素進行提取,最終使用pH為9的氫氧化鈉水溶液對提取液進行純化;確立了較佳的檢測條件:以粒徑約58 nm的金膠溶液作為增強基底,同時,在上機液中加入200 μL 1%硝酸溶液、50 μL 1%硝酸鉀溶液,此時香蘭素特征拉曼信號最強,有利于進行定性定量分析。本文建立的速測方法以1 149、1 497、1 575 cm-1處拉曼位移作為定性依據,以1 531 cm-1峰強度作為歸一化標準,繪制1 497 cm-1處峰強度對香蘭素濃度的標準曲線,在質量濃度30—300 μg•mL-1內實現定量計算,線性相關系數0.9913,檢出限為10 μg•mL-1。在50、100和200 μg•mL-1 3個添加水平下,回收率為80.5%—86.9%,相對標準偏差小于8.6%。【結論】通過實際樣品檢測并將結果與現有文獻報道方法相比較發現,該方法樣品前處理簡單、分析時間短(單個樣品分析時間約5 min),檢測結果可靠,適用于對較大嬰幼兒奶粉的現場快速檢測,為市場監管提供了新的手段。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    飼糧油菜籽添加水平對肉牛生長性能、瘤胃發酵及血液生化指標的影響
    張杰杰1, 2, 趙紅波1, 游偉1, 成海建1, 劉曉牧1, 萬發春1, 孫國強2, 宋恩亮1, 劉倚帆1
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2233-2241.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.017
    摘要 ( 344 )   HTML ( 9 )   PDF (574KB) ( 491 )   收藏
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    【目的】旨在探討飼糧中不同油菜籽添加水平對肉牛生長性能、瘤胃發酵及血液生化指標的影響,從而為肉牛育肥過程中合理使用油菜籽提供依據。【方法】試驗采用單因子完全隨機設計,選取18月齡、平均初始體重為(447±35.67)kg的西門塔爾雜交公牛40頭,依據飼糧中油菜籽含量隨機分為對照組(0%)、低菜籽組(8.7%)、中菜籽組(17.4%)、高菜籽組(26.0%),預飼期10 d,正試期90 d。試驗結束后稱重,計算飼料成本,并采集瘤胃液和血液分別用氣相色譜法、比色法和放射免疫法測定瘤胃液揮發性脂肪酸、氨態氮和血清中三碘甲狀腺原氨酸酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺素(TSH)。用SAS9.2軟件中一般線性模型對試驗數據進行方差分析。【結果】試驗結束各組牛末重之間差異不顯著(P>0.05),中菜籽組日增重最高,為1.33 kg•d-1,顯著高于高菜籽組(P<0.05),比對照組和低菜籽組分別高6.40%和7.25%;高菜籽組干物質采食量最高,對照組最低,但各組之間差異不顯著(P>0.05)。隨油菜籽添加水平的提高,飼料成本降低(P>0.05);中菜籽組料重比最低,高菜籽組最高,各組之間差異不顯著(P>0.05);不同油菜籽添加水平不顯著影響瘤胃液pH、氨態氮以及揮發性脂肪酸的含量(P>0.05),但隨油菜籽添加水平的提高瘤胃液中氨態氮、丁酸和乙酸/丙酸的含量呈降低的趨勢,丙酸呈上升趨勢,總的揮發性脂肪酸先上升后降低;血清中三碘甲腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)各組之間差異不顯著(P>0.05),中菜籽組和高菜籽組血清中促甲狀腺素(TSH)顯著低于對照組(P<0.05),與低菜籽組差異不顯著(P>0.05)。飼糧油菜籽添加水平對血清中谷丙轉氨酶、肌酐、膽固醇含量影響差異不顯著(P>0.05),對照組和低菜籽組的谷草轉氨酶活性顯著低于中菜籽組和高菜籽組(P<0.05),中菜籽組尿素氮水平顯著低于對照組(P<0.05),與其它各組差異不顯著(P>0.05)。【結論】添加不同水平的油菜籽對瘤胃發酵參數無顯著影響,肉牛育肥期間飼糧油菜籽添加到17.4%時日增重不受影響,飼糧中添加油菜籽可加重甲狀腺和肝臟的代謝負擔。
    復方苦芩對感染豬傳染性胃腸炎病毒的PK-15細胞中Bcl-2/BAX mRNA轉錄的影響
    邵秋紅, 凌榕鑌, 朱兆榮, 劉娟, 郭志興, 王鵬
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2242-2250.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.018
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    【目的】探討中藥復方苦芩對感染豬傳染性胃腸炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)的豬腎細胞(PK-15)中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA轉錄的影響。【方法】體外擴增TGEV,用TGEV感染PK-15細胞的模型進行體外試驗研究,試驗中設有復方苦芩組、空白組、模型組及黃芪多糖組,在測定了病毒半數感染細胞量(TCID50),復方苦芩及黃芪多糖藥液對PK-15細胞的最大無毒濃度后,制作細胞爬片采用瑞士染色法染色觀察PK-15細胞的形態變化;按試劑盒操作提取各試驗組RNA并及時反轉錄為cDNA,采用實時熒光定量PCR法檢測細胞中Bcl-2和BAX mRNA轉錄情況。【結果】與空白組相比,模型組的PK-15細胞發生了明顯的細胞病變效應(cytopathic effect,CPE),細胞變細長,細胞間成網狀,細胞核著色較淺,出現核濃縮、固縮、碎裂等現象;與模型組比,復方苦芩組與黃芪多糖組細胞病變得到改善,而復方苦芩組效果更加明顯,大部分細胞核結構清晰,染色質著色均一,少部分細胞核變大或碎裂;與空白組相比,模型組Bcl-2 mRNA轉錄量減少(P<0.01),復方苦芩組Bcl-2基因轉錄量增加,為模型組的1.403倍(P<0.01)、黃芪多糖組的1.078倍(P>0.05);與空白組相比,模型組BAX mRNA轉錄量明顯升高,而其他3組BAX基因轉錄差異不明顯(P>0.05),模型組BAX基因轉錄量為空白組的1.440倍、復方苦芩組1.290倍、黃芪多糖組的1.490倍,差異極顯著(P<0.01),復方苦芩組、黃芪多糖組BAX基因轉錄量分別為空白組的1.116倍、0.966倍,差異不顯著(P>0.05);與空白組相比,模型組Bcl-2/BAX mRNA轉錄比值降低,差異極顯著(P<0.01);與模型組相比,復方苦芩組、黃芪多糖組Bcl-2/BAX mRNA轉錄比值均增加,分別為模型組1.809倍和1.940倍,差異極顯著(P<0.01),復方苦芩組Bcl-2/BAX mRNA轉錄比值分別為空白組的0.749倍(P<0.01)、黃芪多糖組的0.933倍(P>0.05)。【結論】復方苦芩可通過上調PK-15細胞Bcl-2 mRNA轉錄,下調BAX mRNA的轉錄,從而抑制TGEV引起的PK-15細胞凋亡。
    氟羅沙星殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒的研制
    賈國超1, 2, 職愛民1, 李夢琴2, 宋春美1, 王玲玲1, 劉儒彪1, 胡驍飛1, 王方雨1, 張改平1
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2251-2261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.019
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    【目的】利用蛋白質連接技術合成氟羅沙星(FLE)人工抗原,制備FLE高親和力抗體,通過建立、優化FLE的icELISA檢測方法研制出快速、靈敏的FLE殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒。【方法】用DCC法偶聯FLE和載體蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶聯FLE和載體蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通過紫外掃描法(UV Scan)和聚丙烯凝膠電泳法(SDS-PAGE)鑒定人工合成抗原。選擇經初步鑒定成功合成的FLE-BSA免疫SPF級6—7周齡Balb/c雌性小鼠5只,采用多點免疫法,對小鼠背部皮下4-6點注射免疫,免疫劑量為30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液與等體積FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液與等體積FIA混合乳化后免疫,免疫間隔3周,4次免疫后,利用間接ELISA和間接競爭ELISA測定其多抗血清效價和敏感性,選出效價高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、優化FLE的icELISA檢測方法,確定其包被濃度、包被時間、封閉液選擇、封閉時間、抗體工作濃度、二抗稀釋度、底物顯色時間等條件,制備出FLE快速檢測試劑盒,同時測定該試劑盒的靈敏度、精密度、準確度以及特異性等指標,并與高效液相色譜法做相關性比較,同時對市場上購買4個批次的氟羅沙星藥品含量進行了實際測定,以確證試劑盒在實際應用中的質量。【結果】通過上述蛋白質連接技術所制備的免疫原經紫外掃描法和聚丙烯凝膠電泳法鑒定,結果顯示BSA與FLE偶聯后,FLE-BSA波峰整體出現右移且凝膠上BSA的泳動速度大于FLE-BSA,初步證明人工合成抗原偶聯成功。通過間接ELISA和間接競爭ELISA方法測定5號小鼠多抗血清得到其效價大于2.5×104,抑制價為162.18 ng•mL-1。通過優化FLE icELISA檢測方法,其工作條件:包被濃度:5 μg•mL-1;抗體工作濃度:1﹕6400;二抗稀釋度:1﹕1000;底物顯色時間:10 min。所制備的試劑盒靈敏度為16.22 ng•mL-1,標準曲線回歸方程為y=-0.3627x + 1.3517(R2 = 0.9956),與同系藥物及其它藥物均無明顯交叉反應,陽性豬肝樣的回收率在67.5%—87.9%,平均78.7%,變異系數在9.34%—10.7%,平均10.0%;陽性豬肉樣的回收率在74.0%—88.2%,平均81.42%,變異系數在8.3%—10.4%,平均9.48%;平均變異系數均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5個標準濃度 B/B0的批內變異系數在3.39%—6.68% ,批間變異系數在4.69%—9.67%。批內和批間平均變異系數分別為5.07%和7.44%,且與HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通過實際測定其結果基本符合2010年版《中國藥典》中所規定的含量要求(90%—110%),進一步說明二者具有良好的相關性以及FLE-Kit的準確性。【結論】首次利用兩種方法分別合成FLE免疫原和包被原,利用所制備的抗FLE血清建立并優化FLE殘留icELISA檢測方法,制備出FLE快速檢測試劑盒。該試劑盒具有靈敏、準確、簡便、快速的特點,為氟羅沙星免疫學快速檢測方法的建立奠定了堅實的基礎。
    研究簡報
    棉花2個新的PPR基因的克隆及表達模式分析
    何鵬, 黃鵬, 黃圣, 錢慧, 俞嘉寧
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2271.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.020
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    【目的】從棉花中克隆2個新的PPR基因,分析其序列結構、基因表達和亞細胞定位,為深入研究這2個基因在棉花中的功能提供依據。【方法】利用棉花EST庫,通過RT-PCR從陸地棉徐州142中克隆得到2個PPR基因:GhPPRH1和GhPPRH2;應用生物信息學方法對2個基因編碼蛋白序列進行預測分析,利用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR的方法分析目的基因在不同組織及纖維不同發育時期的表達模式;利用棉花子葉瞬時表達系統對上述2個基因編碼的蛋白進行亞細胞定位。【結果】GhPPRH1和GhPPRH2均屬于PPR基因家族的PLS亞家族;GhPPRH1和GhPPRH2的開放讀碼框的長度分別為1 917和2 556 bp,編碼638和851個氨基酸;GhPPRH1蛋白有18個PPR基序,包含1個E+結構域和1個DYW結構;GhPPRH2蛋白有17個PPR基序,包含1個E結構域,1個E+結構域和1個DYW結構;將GhPPRH1和GhPPRH2蛋白的氨基酸序列與GenBank數據庫中的9條同源蛋白以及棉花中已經報道的5個PPR蛋白的氨基酸序列進行比對,構建系統進化樹,結果顯示,GhPPRH1與水稻RF1b蛋白親緣關系較近,推測其可能與胞質雄性不育的育性恢復相關,而GhPPRH2與玉米PPR5蛋白親緣關系最近,推測可能會影響細胞器一些轉錄本的RNA編輯;半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR的結果表明,GhPPRH1和GhPPRH2在根、莖、葉、花及纖維發育不同時期均有表達,GhPPRH1在根中表達較高,而GhPPRH2在根、葉及15 d的纖維中表達較高;亞細胞定位結果顯示,GFP標記的GhPPRH1蛋白的綠色熒光與線粒體Marker的紅色熒光重疊,表明該蛋白可能定位于線粒體,GFP標記的GhPPRH2蛋白的綠色熒光與葉綠體自發的紅色熒光重疊,表明GhPPRH2可能定位在葉綠體。【結論】從棉花中獲得2個新的PPR基因,均屬于PLS亞家族成員,亞細胞定位顯示可能在線粒體和葉綠體中,推測其功能可能與細胞器中RNA的加工、修飾等過程有關。
    不同發育時期花生胚混合全長cDNA文庫的構建與分析
    陳華1, 2, 鄧燁1, 2, 張沖1, 蔡鐵城1, 2, 鄭奕雄1, 2, 3, 莊偉建1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(11):  2272-2280.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.021
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    【目的】深入了解花生胚發育的分子機制,獲得花生胚發育相關基因。【方法】以優質花生品種閩花6號為材料,分別取花生果針入土后10、20、30、40、50和60 d(day after pegging,DAP)的胚作為試驗材料,用CTAB法提取花生胚總RNA,采用SMART(Switching Mechanism At 5’ end of RNA Transcript)技術合成雙鏈cDNA,經SfiⅠ酶切后膠回收純化雙鏈cDNA,連接到質粒載體pDNR-LIB上,電擊轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,構建不同發育時期花生胚混合全長cDNA文庫,進行小規模測序。采用生物信息學分析手段對所獲得的EST進行功能注釋。【結果】構建了不同發育時期花生胚混合全長cDNA文庫,文庫的庫容為3.5×106 cfu/mL,重組率95.8%,插入片段長度在500—2 000 bp,平均長度超過1 000 bp。隨機挑取 60 個克隆進行5′端測序,共得到60條高質量的EST序列,BLASTX結果顯示,有39條序列(65%)與GenBank中大豆、花生、苜蓿等植物上已公布的序列有較高同源性,其中,有32條具有已知或推測的功能,7條序列功能未知。其余21條(35%)序列在NCBI的非冗余蛋白數據庫中沒有找到與之相匹配的序列,可能為花生新的EST序列。利用BLAST2GO對所得序列進行GO注釋分析,結果表明,參與抗逆與防御、蛋白質合成與運輸、油脂合成與代謝、轉錄與調控以及種子萌發、休眠、胚發育相關的基因比較豐富,還有部分基因參與信號傳導以及光形態建成等過程。KEGG代謝途徑分析表明,隨機測序所獲得的序列中主要包括α-亞麻酸代謝和亞油酸代謝。【結論】利用SMART技術成功構建了不同發育時期花生胚混合全長cDNA文庫;小規模EST測序分析獲得了部分與花生胚發育相關的基因,如亞油酸9S-脂肪氧合酶、油體蛋白、鋅指蛋白、熱休克蛋白90、胚胎發育晚期豐富蛋白、脂肪氧合酶以及DREB轉錄因子等。
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