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當期目錄

    2014年 第47卷 第13期 刊出日期:2014-07-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    水稻P450基因Oscyp71Z2增強稻瘟病抗性的機制
    李文奇1, 王芳權1, 王軍1, 范方軍1, 朱金燕1, 楊杰1, 邵敏2, 仲維功1
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2485-2493.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.001
    摘要 ( 286 )   HTML ( 2 )   PDF (602KB) ( 571 )   收藏
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    【目的】分析水稻細胞色素P450基因Oscyp71Z2在稻瘟病抗性中的作用,并解析其介導的水稻抗稻瘟病機制。【方法】根據高抗稻瘟病轉hrf1水稻NJH12表達譜結果,篩選到一個表達量高達114.6倍的細胞色素P450基因Oscyp71Z2(NCBI登錄號:Os07g0217600)。根據Oscyp71Z2全長編碼區序列設計引物,以水稻模式粳稻品種日本晴的cDNA為模板,通過PCR擴增Oscyp71Z2全長編碼區序列。將所得的cDNA序列經測序后,與雙元表達載體pVec8連接,構建超量表達載體pVec8::Oscyp71Z2。采用凍融法將構建的超量表達載體pVec8::Oscyp71Z2質粒轉入農桿菌菌株EHA105,并利用農桿菌轉化法獲得Oscyp71Z2超表達水稻。常規PCR技術檢測T4代Oscyp71Z2超量表達水稻中選擇標記基因潮霉素磷酸轉移酶編碼基因(hygromycin phosphotransferase gene,hph),并通過qRT-PCR檢測超量表達水稻中目的基因Oscyp71Z2的表達量。進一步對陽性超量表達水稻(T4、T5和T6)進行稻瘟病表型鑒定,并檢測植保素含量變化(T4)。【結果】RT-PCR和qRT-PCR結果顯示,水稻細胞色素P450基因Oscyp71Z2在高抗稻瘟病的轉hrf1水稻中有較高的表達,與表達譜數據一致。通過生物信息學分析Oscyp71Z2全長1 554 bp,含有2個細胞色素P450保守結構域,是CYP71Z2亞家族成員。將Oscyp71Z2成功連接到雙元載體pVec8,利用農桿菌介導法獲得Oscyp71Z2超量表達水稻。超量表達水稻株系在各生育期、株高等性狀,與非轉基因水稻日本晴基本一致。超量表達株系中Oscyp71Z2的表達量較野生型有顯著升高。超量表達水稻的穗頸瘟抗性等級維持在1—2級,表現為抗病或者中抗,而野生型水稻的穗頸瘟等級為3—4級,表現為感病,Oscyp71Z2在水稻中超量表達顯著增強了對穗頸瘟的抗性。Oscyp71Z2超量表達株系每克新鮮葉片中植保素MA和PB含量平均是328和124 ng,相對于野生型的85和42 ng•g-1新鮮葉片有顯著升高。Oscyp71Z2超量表達株系中涉及到植保素MA和PB合成通路的4個關鍵基因的表達量較野生型有顯著地升高。【結論】水稻細胞色素P450基因Oscyp71Z2通過調控植保素生物合成通路,賦予水稻稻瘟病抗性。
    小麥蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的篩選與驗證
    于太飛1, 2, 徐兆師2, 李盼松2, 陳明2, 李連城2, 張俊華1, 馬有志2
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2494-2503.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.002
    摘要 ( 291 )   HTML ( 2 )   PDF (640KB) ( 796 )   收藏
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    【目的】利用構建的干旱脅迫處理的小麥cDNA文庫,通過酵母雙雜系統篩選與小麥TaMAPK2互作的蛋白,并對其進行驗證分析。【方法】以小麥cDNA為模板克隆得到TaMAPK2,構建pGBKT7-TaMAPK2誘餌載體,將誘餌載體pGBKT7-TaMAPK2質粒以及pGADT7和小麥cDNA文庫共轉化酵母AH109菌株感受態細胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營養缺陷型培養基上30℃培養3—5 d,挑選單克隆于YPDA培養基中培養,吸取1 μL各候選克隆的菌液點至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培養,篩選藍色單克隆。將篩出的單克隆經測序、序列比對分析,初步獲得與TaMAPK2互作的候選蛋白。采用雙酶切的方法構建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90雙分子熒光互補表達載體,將重組載體質粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共轉化AH109酵母感受態細胞,利用酵母雙雜交的方法驗證TaMAPK2與候選蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介導法將雙分子熒光互補表達載體pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共轉化小麥原生質體細胞,激光共聚焦顯微鏡下觀察相互作用產生的YFP熒光信號。根據HSP90的保守序列設計特異引物,在SYBR Green Ⅰ的檢測模式基礎上,構建HSP90的實時熒光定量PCR檢測體系,檢測HSP90在不同脅迫處理以及不同組織的小麥植株中的表達量。【結果】通過對候選蛋白的初步分析表明這些候選蛋白主要參與植物體的信號轉導或免疫過程,表明TaMAPK2在植物的逆境信號轉導、基因轉錄調控過程中發揮著重要作用。通過酵母雙雜交顯藍系統和雙分子熒光互補技術(BiFc)進一步確認HSP90與TaMAPK2的互作關系。HSP90定位在細胞核、細胞膜以及細胞質中,且在植物的根莖葉中均有表達,在根中的表達量最高。通過實時熒光定量PCR分析顯示,HSP90基因受到高溫、低溫、高鹽和ABA脅迫后表達量上調。【結論】HSP90作為分子伴侶,在降解這些受損或異常蛋白以及調控抗逆相關轉錄因子表達的過程中發揮著重要的作用。非生物脅迫會引起植物體內一些受損或異常蛋白聚合物的積累,HSP90能通過折疊已損壞的蛋白底物以及構象的維持來保持細胞的完整性。表明在植物逆境信號轉導過程中,TaMAPK2功能的發揮可能需要HSP90蛋白的參與。
    參與農桿菌侵染及T-DNA轉運過程植物蛋白的研究進展和思考
    趙佩, 王軻, 張偉, 杜麗璞, 葉興國
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2504-2518.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.003
    摘要 ( 285 )   HTML ( 1 )   PDF (818KB) ( 916 )   收藏
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    農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤病原細菌,攜帶具有天然轉基因功能的Ti質粒或Ri質粒,能將一部分遺傳物質插入到寄主植物的染色體上,使其穩定遺傳和表達,賦予植物新的性狀。所以農桿菌作為最有效的轉化媒介,已被廣泛應用于多數雙子葉植物和部分單子葉植物轉基因研究。雖然農桿菌介導的轉化技術具有操作簡單、成本低廉,轉基因沉默幾率小,插入基因拷貝數少等優點,但農桿菌介導植物遺傳轉化是一個復雜的生物學過程,需要一系列農桿菌蛋白和植物蛋白相互作用,共同完成外源基因的轉入和整合。植物相關蛋白在轉化過程中起著重要作用。其中,阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)、植物根鈣粘附蛋白和類玻連蛋白等參與農桿菌附著于植物細胞表面的過程;鳥苷三磷酸腺苷酶(GTPase)和BTI蛋白協助T-DNA和Vir效應蛋白進入植物細胞;actin、GIP、VIP等蛋白參與T-DNA復合體在細胞質中的運輸的過程;與Vir效應蛋白互作的VIP1、VIP2、KAPa、PP2C、Roc等蛋白協助T-DNA定位于植物細胞核;組蛋白、VIP1和VIP2等引導T-DNA在植物基因組上的整合。由于植物種類間存在巨大差異,上述一些植物蛋白基因的過表達雖能提高農桿菌轉化某些植物的轉化效率,但不能提高另一些植物的轉化效率。在容易被農桿菌遺傳轉化的植物如擬南芥、水稻中的研究表明,VIP1、VIP2、AGP、H2A等蛋白與農桿菌轉化關系密切,但這些蛋白在利用農桿菌轉化較難的作物如小麥、玉米中的功能還不明確,因而需要在不同植物中繼續篩選和鑒定與T-DNA轉化相關重要蛋白的編碼基因。目前,農桿菌介導的植物遺傳轉化有2個顯著特點,一是農桿菌介導轉化煙草、擬南芥、水稻等模式植物的技術日漸成熟,二是農桿菌介導轉化小麥、玉米、大豆等重要作物的技術仍然沒有本質突破,植物相關蛋白在T-DNA轉運、整合等過程中的作用還需要深入研究和進一步明確。文章主要對參與農桿菌介導遺傳轉化植物整個過程中相關植物蛋白的研究進展進行了綜述,以期為提高農桿菌轉化頑拗型作物的轉化效率提供參考。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    一個矮稈多分蘗水稻突變體的植物激素動態特性分析
    劉清1, 童建華1, 史齊1, 彭克勤1, 王若仲1, 藺萬煌1, MohammedHumayunKabir1, 沈革志2, 蕭浪濤1
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2519-2528.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.004
    摘要 ( 264 )   HTML ( 1 )   PDF (675KB) ( 408 )   收藏
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    【目的】比較水稻矮稈多分蘗突變體與野生型材料間的植物激素含量差異,并分析不同生長調節劑處理對其株高、分蘗的影響,探析植物激素在突變體形態發育過程中的生理功能。【方法】以T-DNA插入引起的矮稈多分蘗突變體(CA648)及對照中花11(ZH11)為供試材料,采用高效液相色譜法(HPLC)分析三葉期、五葉期、分蘗盛期、拔節孕穗期的根、假莖(或莖)、葉中的赤霉素(GA1,GA4)、生長素(IAA)、玉米素(Z)和脫落酸(ABA)的含量,進行CA648與ZH11在不同生長發育時期的不同器官中的植物激素含量差異比較分析;利用液相色譜-串聯質譜聯用法(HPLC-MS/MS)測定拔節孕穗期根、基部、莖稈及葉片中的IAA、Z及玉米素核苷(ZR)的含量并進行根、莖、葉等不同器官中IAA與Z+ZR含量間的比值差異分析;在CA648與ZH11的不同生長發育時期噴施不同濃度的GA3、IAA、Z及多效唑處理后統計株高、分蘗的變化特性,并比較分析CA648與ZH11對不同生長調節劑處理的反應敏感性差異。【結果】不同生長發育時期的CA648與ZH11的不同器官中的植物激素存在不同變化趨勢。GA1+4含量變化情況為在三葉期和五葉期的葉片中兩者相差不大,而根和假莖中的含量則是CA648高于ZH11;從五葉期至拔節期,隨著生育期延長,ZH11的假莖和根中GA1+4含量升高而葉片中含量降低,但CA648卻表現出相反的變化趨勢,假莖和根中的GA1+4含量降低但葉片中含量卻升高。IAA含量變化情況為五葉期、分蘗盛期時CA648葉片中的IAA含量低于ZH11,而假莖中的IAA含量卻高于ZH11;拔節期時,CA648的根、莖、葉中IAA含量均與ZH11對應器官中的IAA含量相差不大。Z、ZR含量變化情況為三葉期CA648的根與假莖中的Z含量都低于ZH11;在拔節期,分蘗部位的基部和莖中的Z+ZR含量為CA648高于ZH11,而葉片中的Z+ZR含量卻是CA648略低于ZH11。ABA含量變化情況為在三葉期、五葉期時CA648的ABA含量高于ZH11,而拔節期卻顯著低于ZH11。IAA與Z+ZR的比值情況為在頂葉、莖稈中是CA648大于ZH11,而在基部和根中則是CA648中的比值小于ZH11。不同濃度GA3、IAA、Z和多效唑噴施處理表明CA648的株高易受生長調節劑的影響。與噴水對照相比,噴施GA3、IAA、Z均能增加CA648的株高,其敏感性依次為GA3處理>IAA處理>Z處理;噴施多效唑后CA648與ZH11的株高均明顯降低;雖然CA648與ZH11的株高均受GA3、多效唑等生長調節劑的影響,但CA648更敏感,當噴施的GA3濃度≥288 µmol•L-1時,CA648的株高能夠達到或超過ZH11的株高;與株高易受生長調節劑的影響不同,CA648的多分蘗特性幾乎不受長調節劑處理的影響,無論是否噴施生長調節劑,CA648的分蘗數均遠遠多于ZH11。【結論】與對照相比,CA648體內的GA1、GA4、IAA、Z、ZR含量及其IAA與Z+ZR的比值有利于矮稈多分蘗性狀的形成,即植物激素含量與比例能夠反映CA648的生理特性;生長調節劑對CA648的分蘗與株高具有不同調控效果,噴施GA3、IAA、Z和多效唑能夠顯著改變株高,但其多分蘗特性不受株高改變的影響。
    秈稻與粳稻花時對茉莉酸甲酯(MeJA)響應的敏感性差異
    閆志強1, 徐海1, 馬作斌1, 2, 高東昌1, 徐正進1
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2529-2540.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.005
    摘要 ( 332 )   HTML ( 1 )   PDF (739KB) ( 516 )   收藏
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    【目的】秈粳稻雜交可產生明顯的雜種優勢,是培育高產多抗品種的主要途徑,但是秈稻花時早,粳稻花時晚,兩者花時不遇的困難直接影響秈粳間雜種優勢的充分利用。噴施茉莉酸甲酯(MeJA)可有效促進水稻花時提前,本文旨在研究MeJA對秈粳稻花時性狀的調控效果及其敏感性差異,為亞種間雜交稻制種產量的提高和秈粳稻雜種優勢的直接利用提供理論依據。【方法】以6個秈稻和6個粳稻品種為試材,2012年和2013年分別種植于沈陽農業大學水稻研究所試驗田。試驗按隨機區組設計,3次重復。于調查花時性狀的前一日17:00、當日6:00及8:00分別噴施0.04、0.4和4 mmol•L-1濃度的MeJA,調查始花時、盛花時、終花時。花時的判斷標準以一天中稻穗上第一朵穎花開放的時間作為始花時,以一天中穎花開放最多且最集中的時間作為盛花時,以所有穎花都關閉的時間作為終花時,并計算始花至盛花的持續時間(簡寫為始-盛時間)、盛花至終花的持續時間(簡寫為盛-終時間)、始花至終花的持續時間(簡寫為始-終時間)。【結果】對于6個秈稻品種,噴施上述3種濃度的MeJA都能極顯著地促進穎花提前開放,且不同濃度處理之間未見顯著差異,與對照相比差異達極顯著水平;對于6個粳稻品種,噴施高濃度(4 mmol•L-1)與中濃度(0.4 mmol•L-1)的MeJA可極顯著促進花時提前,且高濃度與中濃度MeJA處理之間有極顯著差異,噴施低濃度(0.04 mmol•L-1)的MeJA處理與對照相比差異不顯著。秈粳稻的始-盛時間,盛-終時間在噴施不同濃度MeJA處理下與對照相比并未表現出明顯的規律,但噴施不同濃度的MeJA都能極顯著延長秈稻開花持續時間(始-終時間),而對粳稻的影響不明顯。對于秈稻品種,不同時間噴施MeJA處理之間的花時性狀沒有顯著差異;對于粳稻品種,前日17:00與當日6:00的處理與當日8:00處理間的始花時差異顯著。進一步比較了MeJA對秈粳稻開花促進程度上的差異,噴施高濃度(4 mmol•L-1)的MeJA對秈粳稻開花的促進程度沒有顯著差異,而低濃度(0.04 mmol•L-1)和中濃度(0.4 mmol•L-1)的處理對秈稻開花的提前程度明顯高于粳稻。【結論】MeJA確能顯著促進秈粳稻的開花,秈稻對MeJA調控的敏感性強于粳稻。秈稻不僅能夠響應高濃度的MeJA(4 mmol•L-1)也能響應低濃度的MeJA(0.04 mmol•L-1),而粳稻只能響應較高濃度的MeJA(4 mmol•L-1 , 0.4 mmol•L-1)。秈稻對MeJA調控響應所需的時間較短,而粳稻對MeJA調控響應所需的時間較長。促進粳稻品種開花的最優組合是前日17:00噴施4 mmol•L-1的MeJA,對秈稻品種,促進花時提前的最優組合因具體品種而異,以0.04 mmol•L-1的MeJA于早晨噴施最為經濟有效。
    北方旱寒區冬油菜種植氣候適宜性研究
    周冬梅1, 張仁陟1, 2, 孫萬倉2, 3, 張軍1, 2, 王鶴齡4
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2541-2551.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.006
    摘要 ( 261 )   HTML ( 1 )   PDF (919KB) ( 705 )   收藏
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    【目的】分析北方旱寒區冬油菜種植分布和氣候條件之間的關系,確定影響冬油菜種植分布的主要氣候因子,在區域尺度上劃分冬油菜種植氣候適宜性區域,為改進冬油菜生產布局,合理調整農業生產結構和種植布局提供參考依據。【方法】利用多年不同油菜品種地理分期播種試驗數據和長序列氣候數據,篩選影響冬油菜種植分布的潛在氣候因子,采用基于DEM的小網格推算法建立潛在氣象因子空間數據庫,并在此基礎上利用MaxEnt模型分析北方旱寒區冬油菜種植分布與氣候條件的關系,確定影響北方旱寒區冬油菜種植分布的主要氣象因子,模擬北方旱寒區冬油菜的潛在空間分布概率,并劃分北方旱寒區冬油菜種植氣候適宜性區域。【結果】潛在氣象因子對冬油菜種植分布的總貢獻率達到0.89,按貢獻率大小確定影響北方旱寒區冬油菜種植分布的主要氣候因子包括:年平均溫度、負積溫、極端低溫、最冷月最低溫度、最冷月平均溫度;冬油菜在北方旱寒區潛在分布概率為0—0.84,按其分布概率將北方旱寒區冬油菜種植區域劃分為4個等級:不適宜種植區域、次適宜種植區域、適宜種植區域和最適宜種植區域;冬油菜種植北界,大抵以吉林南部、內蒙古南部、新疆南部為界限,與傳統冬油菜種植北界相比較,向北推進了1 200 km,緯度由39°N提升到45°N。【結論】北方旱寒區超過50%的地區都可以種植冬油菜,冬油菜種植區北移是可行的,且具有很大的擴展潛力,冬油菜將成為北方旱寒區重要的油料作物。這將突破原有傳統的冬油菜種植區劃,改變冬油菜生產的布局結構。
    植物保護
    稻曲病菌致病力喪失突變菌株B-1015的T-DNA標記基因的克隆
    黃磊1, 2, 胡建坤2, 俞咪娜2, 于俊杰2, 王亞會2, 鄭夢婷2, 鄭睿2, 劉永鋒1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2552-2562.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.007
    摘要 ( 287 )   HTML ( 1 )   PDF (764KB) ( 565 )   收藏
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    【目的】研究稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力喪失突變菌株B-1015,克隆和分析T-DNA插入位點的側翼序列,為稻曲病菌的致病機制研究提供參考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA插入突變體B-1015菌株的生長速率、產孢量、孢子萌發率以及致病力等生物學表型。用PCR檢測T-DNA在B-1015基因組中插入的穩定性,用Southern雜交檢測T-DNA插入的拷貝數,用hiTail-PCR擴增T-DNA側翼序列,用RACE PCR克隆T-DNA標記基因,半定量RT-PCR分析所克隆基因的表達情況。【結果】與野生菌株P1相比,突變菌株B-1015的生長速率和產孢量都有較明顯的降低,孢子萌發率無明顯差異,致病力喪失。分子檢測結果表明T-DNA在B-1015基因組中為穩定的單拷貝插入。hiTail-PCR得到的T-DNA兩端側翼序列在野生型菌株基因組上不相連,RACE PCR在兩邊的側翼序列上分別克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。預測分析表明Uvt-1015R包含一個長度為948 bp的開放閱讀框(open reading frame finder,ORF),可編碼295個氨基酸,5′端非編碼區(5′-untranslated regions,5′-UTR)長度為 341 bp,3′端非編碼區(3′-untranslated regions,3′-UTR)長度為271 bp。Uvt-1015L包含一個長度為351 bp的ORF,可編碼116個氨基酸,5′-UTR為31 bp,3′-UTR長度為174 bp。在已知功能的蛋白中檢索,沒有發現與Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析發現T-DNA插入在兩個基因序列中間,RT-PCR結果顯示,在突變菌株B-1015中,Uvt-1015R表達量下降,Uvt-1015L不表達。【結論】 稻曲病菌突變菌株B-1015致病力等重要生物學表型發生改變,可能是由于T-DNA的插入導致了B-1015基因組重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因結構的破壞。
    水稻白葉枯病菌毒性表達的負調控因子PXO_02944的分子鑒定
    李瀟桐, 楊鳳環, 梁士敏, 田芳, 陳華民, 何晨陽
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2563-2570.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.008
    摘要 ( 319 )   HTML ( 1 )   PDF (570KB) ( 482 )   收藏
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    【目的】水稻黃單胞水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 簡稱Xoo)侵染引起水稻白葉枯病,在侵染過程中Xoo可產生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其產生的效應因子等毒性因子。細菌第二信使環鳥苷二磷酸(c-di-GMP)的水平在Xoo毒性調控中發揮了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL結構域的蛋白,是c-di-GMP信號蛋白家族的成員,研究旨在闡明水稻白葉枯病菌的環鳥苷二磷酸信號蛋白家族成員PXO_02944的基因結構和功能。【方法】根據PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因組DNA為模板,設計引物擴增PXO_02944基因全長,將其GGDEF結構域和EAL結構域分別與已經報道的保守的GGDEF結構域或EAL結構域蛋白進行氨基酸序列比對分析;分別擴增PXO_02944左右臂片段,將其與目的載體pK18mobsacB載體連接,得到質粒pK2944,將pK2944與pMD-GmR載體回收獲得的GmR基因片段進行連接,獲得重組質粒pK2944-GmR,用于構建基因突變體。將PXO_02944全長基因克隆到載體pHM1上,獲得重組質粒pHM1-2944并轉化到ΔPXO_02944中,即獲得互補菌株ΔPXO_02944::C。對野生型菌株、突變體和互補菌株進行表型測定,分析PXO_02944 基因缺失突變對Xoo致病性和EPS產生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛運動性的影響,并通過qRT-PCR方法測定EPS合成基因和毒性相關基因的表達。【結果】用特異性引物進行PCR擴增,成功地從野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息學分析發現,PXO_02944蛋白具有磷酸化信號接收的REC輸入結構域和GGDEF、EAL輸出結構域,但GGDEF和EAL結構域保守序列發生了突變。與野生型菌株PXO99A相比,雖然PXO_02944突變體胞外纖維素酶和木聚糖酶活性、鞭毛運動性都無明顯變化, 但其對水稻的致病性、EPS產生和生物膜形成能力顯著增強,T3SS調控基因hrpG和EPS合成基因gumG的轉錄水平也明顯升高。【結論】應答調控因子PXO_02944負調控了水稻白葉枯病菌致病性、EPS產生和生物膜形成這些毒性因子的表達。
    β-氨基丁酸誘導馬鈴薯對晚疫病的抗性組織化學及信號傳導途徑分析
    王靜, 王海霞, 田振東
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2571-2579.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.009
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    【目的】β-氨基丁酸(BABA)田間或離體葉片噴灑能夠有效誘導馬鈴薯防衛反應,增強對晚疫病的抗性。研究從組織化學層面進一步探究BABA誘導馬鈴薯晚疫病抗性過程中誘發的防衛反應及相關信號途徑,為深入研究BABA誘導馬鈴薯產生晚疫病抗性的可能機制奠定基礎。【方法】用4 mmol?L-1 BABA或蒸餾水(對照,Mock)噴灑馬鈴薯植株葉片,3 d后取離體葉片接種晚疫病菌(Phytophthora infestans),接種后不同時間用打孔器取接種點葉盤用于織化學染色和過敏反應(HR)觀察。采用二氨基聯苯胺(DAB)組織化學染色方法檢測接種點周圍活性氧(H2O2)累積情況;葉盤用苯胺藍(aniline blue)染色,然后在熒光顯微鏡下觀察接種點周圍胼胝質積累和表皮細胞HR發生情況;利用干涉了StCOI1(阻斷了茉莉酸JA信號傳導途徑)和超量表達細菌水楊酸羥化酶基因NahG(阻斷了水楊酸SA信號傳導途徑)的轉基因馬鈴薯株系為材料,通過研究BABA能否在這些特殊馬鈴薯材料上有效誘導晚疫病抗性,進而推斷BABA誘導馬鈴薯晚疫病抗性可能參與的信號途徑。【結果】用清水作為空白接種時,Mock和BABA預處理葉片各時間點均未觀察到H2O2積累,而病原菌接種處理24 h后,Mock和BABA預處理葉片接種點周圍都出現H2O2積累,隨著病原誘導時間的延長,H2O2積累增強。但是,BABA預處理葉盤中接種點周圍H2O2累積比對照提前12 h,且累積量顯著強于對照。苯胺藍染顯示Mock和BABA預處理葉片在接種清水時檢測不到胼胝質的沉積,而接種晚疫病菌24 h后,Mock和BABA預處理葉片上均觀察到胼胝質的沉積,BABA預處理葉片在侵染點及其附近胼胝質積累量要顯著高于對照。熒光顯微觀察結果顯示,BABA預處理和Mock葉片晚疫病接種點周圍表皮細胞均有HR發生,BABA預處理葉片早在接種24 h后,接種點周圍就已出現HR反應;接種48 h時,BABA預處理85%葉盤的接種點周圍表皮細胞出現HR,而Mock葉片只有30%葉盤上觀察到HR,BABA預處理葉片HR發生頻率比Mock葉片高出55%。BABA不能在超量表達NahG的馬鈴薯葉片上有效誘發抗性,但能夠在干涉了StCOI1的馬鈴薯葉片上正常誘導產生抗性。【結論】BABA能夠從H2O2和胼胝質累積以及HR發生多個層面有效誘發馬鈴薯基礎防御反應,BABA預處理能夠在病原菌侵染點周圍顯著提高胼胝質和H2O2積累水平,誘發接種點發生較高頻率的HR,從而提高馬鈴薯對晚疫病的抗性;BABA誘導馬鈴薯對晚疫病的抗性依賴水楊酸信號傳導途徑,但不依賴茉莉酸信號傳導途徑。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    長期施肥下淮北砂姜黑土區小麥產量穩定性研究
    陳歡1, 曹承富1, 孔令聰1, 張存嶺2, 李瑋1, 喬玉強1, 杜世州1, 趙竹1
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2580-2590.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.010
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    【目的】分析長期施肥條件下小麥產量的變化規律,試圖探明淮北小麥產量穩定性對不同施肥模式的響應機制,為淮北砂姜黑土合理施肥管理、改善農田生態系統質量提供依據。【方法】以安徽楊柳長期定位試驗為研究平臺,通過研究小麥的平均產量、產量年際波動及土壤養分狀況對5種施肥模式(不施肥、單施化肥、單施有機肥、有機肥與化肥配施(等氮)、有機肥與化肥配施(高氮))的響應,比較不同施肥條件下淮北砂姜黑土區小麥產量穩定性的優劣,并以此評判施肥的合理性。【結果】淮北砂姜黑土區長期不施肥的小麥產量總體呈下降趨勢,年下降量為5.81 kg•hm-2;而長期施肥的小麥產量隨時間呈鋸齒狀波動并總體上升的趨勢,其中有機肥與化肥配施(高氮)處理(HMNPK)的產量趨勢線最高,但其增產優勢逐年減弱,有機肥與化肥配施(等氮)處理(MNPK)以9.75 kg•hm-2的年增長量縮短與其的差距;單施化肥處理(NPK)的小麥產量趨勢線在試驗前期高于單施有機肥(M),但在22年后有被M處理趕超的趨勢。從32年小麥平均產量來看,與不施肥相比,有機肥與化肥配施(高氮與等氮)的增產幅度最大,平均產量分別達5 544.3和5 200.6 kg•hm-2;NPK次之,比當年不施肥處理產量提高了614.6%,M增產幅度最低,但與NPK差異并不明顯。砂姜黑土地力貢獻率在試驗前10年持續降低,降至10%左右趨于穩定,而肥料對小麥產量的貢獻率則是在前10年持續增加至80%—90%便維持動態平衡。長期不施肥易導致小麥產量變異系數(CV)偏高、可持續性產量指數(SYI)偏低,產量穩定性最低;施肥處理中HMNPK和MNPK處理的CV最低、SYI最高,產量穩定性最高,而M處理的產量穩定性和可持續性不及NPK。與長期不施肥相比,施肥可明顯提高淮北砂姜黑土全氮、有機質、有效磷和速效鉀的含量,其中有機肥的施入顯著提高了土壤全氮和有機質含量,而有效磷含量與化肥的投入相關,處理M土壤速效鉀含量較高,但與其他施肥處理差異不顯著;通過相關性分析可知全氮、有機質、有效磷含量與小麥產量呈極顯著正相關關系(P<0.01)。【結論】施肥可有效提高淮北小麥產量,且產量隨時間呈鋸齒狀波動;有機肥與化肥配施(高氮和等氮)的增產效果最佳,但高氮與等氮水平間的產量差隨種植年限的增長而逐漸縮短;在試驗開始前一階段單施化肥的增產效果優于單施有機肥處理,但在22年后有被趕超的趨勢。與長期不施肥相比,有機肥與化肥配施的施肥模式更有利于促進小麥產量穩定性和生產可持續性的提高,其次為單施化肥,單施有機肥最低。施肥可有效提高砂姜黑土養分含量,其中有機肥對有機質、全氮及速效鉀含量的提高作用較強,而化肥則對有效磷含量提高作用較強,且小麥產量與全氮、有機質和有效磷均呈極顯著正相關關系。因此,安徽淮北砂姜黑土區有機肥與化肥配施為最佳施肥模式,土壤養分供應較均衡,小麥產量幅度最大且穩定性最佳,農田生態系統質量最優。
    基于分形理論和地質統計學的表層土壤顆粒大小分布變化特征
    張世文1, 2, 張立平2, 袁君3, 沈重陽2, 陳孝楊1, 葉回春2, 黃元仿2
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2591-2601.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.011
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    【目的】探究多角度、多尺度全面揭示土壤顆粒大小分布特征的方法體系,探索更加簡單而又可綜合定量分析評價土壤質量及其演變過程的手段。【方法】以計算的土壤顆粒體積分形維數(Dv)作為分析對象,建立集分形理論、傳統統計學、分離土壤顆粒Dv的雙對數圖和地質統計學等理論和方法為一體的表層土壤顆粒大小分布變化特征分析方法體系,并基于此從點和區域2個尺度系統全面地研究表層土壤顆粒大小分布變化特征。【結果】粒徑<10 μm的土壤顆粒累積體積百分含量與Dv呈顯著正相關,相關系數為0.46,而>50 μm以內的土壤顆粒累積體積百分含量與Dv呈顯著負相關,相關系數為0.63,土壤顆粒Dv值越小,土壤顆粒越粗;最大和最小Dv的雙對數擬合圖主要變化靠近擬合的直線,R2值均在0.9以上,擬合結果理想,分離的Dv能夠包含整個土壤顆粒大小分布變化的程度。不同土壤有機質含量組之間土壤顆粒Dv存在一定差異性,土壤顆粒Dv能夠客觀地表征農田土壤質量的變化;隨著高程增加,Dv表現相對比較復雜;褐土土壤顆粒Dv均值最大,潮土均值最小;糧田、園地和草地之間的土壤顆粒Dv差異性不明顯。基于土壤顆粒Dv與環境因素關系分析的回歸克里格法預測結果較為準確,區域和樣點土壤顆粒Dv空間分布格局一致,較客觀地反映了區域表層土壤顆粒大小分布變化特征。【結論】建立的方法體系能夠從多角度、多尺度全面地反映土壤顆粒大小分布特征,分析結果符合實際,土壤顆粒Dv可以作為定量化分析評價和表征土壤質量及其演變過程的手段。
    園藝
    蘋果LysM基因家族的生物信息學及表達分析
    周喆, 張彩霞, 張利義, 王強, 李武興, 田義, 叢佩華
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2602-2612.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.012
    摘要 ( 297 )   HTML ( 3 )   PDF (849KB) ( 1240 )   收藏
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    【目的】在蘋果全基因組中鑒定LysM,通過基因聚類分析、染色體定位、結構分析以及組織表達分析,為蘋果LysM的功能研究和利用奠定基礎。【方法】利用已公布的蘋果基因組數據庫GDR和FEM-IASMA,鑒定蘋果LysM基因家族成員,并對其進行編號。MdLysM蛋白氨基酸序列的基本信息通過ExPASy Proteomics Server進行預測,亞細胞定位的預測利用WoLF PSORT進行。采用MEGA5軟件構建了進化樹。應用Plaza程序繪制基因結構,染色體定位信息取自GMDO,鑒定出的39個基因的染色體定位作圖使用MapInspector完成;另外,通過實時熒光定量RT-PCR對各基因的組織表達特性進行分析,差異顯著性分析通過SPSS完成。【結果】系統地鑒定了39個蘋果LysM家族成員。這39個MdLysM蛋白包含241至1 119個不等的氨基酸殘基,等電點分布在4.70—9.60范圍內。亞細胞定位結果表明,蘋果LysM蛋白在細胞核、細胞質、葉綠體、液泡、胞外基質中均有分布。根據聚類分析可將這些基因分為A、B和C 3組,且A組又可進一步被分為Ⅰ、Ⅱ 和 Ⅲ 3個亞族,說明它們的功能可能已經發生了分化。MdLysM蛋白結構域的預測結果及基因結構分析結果均與進化樹聚類結果吻合。染色體定位表明,MdLysM分布在蘋果17條染色體中的13條上,且此家族的基因在13條染色體上的分布為非均勻的,其中以4號染色體上分布最多,達到了9個,而1、5、7和8號染色體上則未見分布。在蘋果LysM家族中鑒定出了10對和1組旁系同源基因,MdLysM基因間存在串聯重復和片段重復,它們是蘋果LysM家族擴張的主要動力。對39個基因在根、莖、葉、花、果5個組織器官中的實時熒光定量RT-PCR結果顯示,5個器官中均能檢測到MdLysM的表達,這些基因的組織表達模式具有多樣性,表明它們在不同組織中可能扮演不同的角色。【結論】蘋果LysM基因家族擁有39個成員,進化上可分為3組,基因結構的復雜程度與進化樹聚類存在聯系。39個基因分布于13條染色體上,存在重復事件。這些信息為今后蘋果LysM基因家族的功能研究奠定了基礎。
    成花素基因PdFT的克隆及其對牡丹成花的影響
    朱富勇, 劉傳嬌, 薛璟祺, 王順利, 張萍, 任秀霞, 張秀新
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2613-2624.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.013
    摘要 ( 293 )   HTML ( 1 )   PDF (907KB) ( 644 )   收藏
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    【目的】克隆紫牡丹FT同源基因,分析其表達模式以及對紫牡丹成花的調控作用。【方法】以紫牡丹為試驗材料,通過RT-PCR的方法克隆紫牡丹FT同源基因PdFT。通過實時熒光定量PCR分析PdFT在紫牡丹不同組織、紫牡丹開花物候期各過程及不同處理的表達情況,并探討PdFT與花芽發育狀態的關系。同時,將克隆到的紫牡丹PdFT克隆到表達載體pET-28a上,構建融合表達載體pET-28a-PdFT,轉化到大腸桿菌BL21(DE3)并誘導表達。【結果】克隆得到包括完整開放閱讀框(ORF)的PdFT cDNA序列,ORF長度為522 bp,編碼173個氨基酸,GenBank登錄號為KF113360。氨基酸序列比對表明:PdFT蛋白具有一個典型的PEBP結構域,屬于PEBP家族;并且與GenBank中已克隆的FT同源基因具有高度的同源性。實時熒光定量PCR分析結果表明,PdFT在紫牡丹根、莖、葉、芽中均有表達,芽中表達量最高,葉中表達量最低。紫牡丹開花物候期各過程PdFT的表達分析表明,在花芽膨大期表達量最高,隨著花蕾的發育,PdFT的表達量逐漸降低。PdFT在不同光照溫度條件下的表達分析表明,短日照和低溫處理均抑制PdFT基因的表達。不同狀態花蕾中PdFT的表達分析結果表明,敗育花蕾PdFT的表達量低于正常花蕾。同時,GA3及去葉處理均能提高PdFT的表達量。所構建的原核表達載體,經IPTG誘導和SDS-PAGE電泳檢測結果表明,表達蛋白與預期蛋白大小一致。【結論】紫牡丹PdFT與已克隆的FT同源基因高度同源,屬于FT亞家族,在紫牡丹頂芽中表達量最高,可能調控牡丹開花,PdFT的克隆及表達分析為研究紫牡丹成花的分子機理奠定了基礎。
    貯藏·保鮮·加工
    水果果實中主要有機酸提取條件的優化
    龐榮麗, 方金豹, 郭琳琳, 謝漢忠
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2625-2633.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.014
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    【目的】建立一種能同時測定水果果實中主要有機酸(檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸)含量的有效提取方法。【方法】以柑橘、葡萄等為試材,以乙醇的水溶液為提取劑,采用超聲提取的方法,對提取劑提取效果(乙醇溶液濃度配比、純水提取效果及主要有機酸的穩定性、不同濃度乙醇溶液提取效果、10%乙醇溶液提取效果及主要有機酸的穩定性等)、提取條件(提取方式、超聲提取時間等)進行優化試驗研究。用優化的提取方法對方法技術參數(檢出限、精密度、重復性、準確度等)進行測試,并將測定結果與已有國標法測定結果進行比較分析。【結果】水果果實中有機酸提取的適宜方法為乙醇溶液超聲提取法:樣品用10%乙醇溶液在超聲波提取器中提取30 min,提取后加入硫酸溶液,使提取液中含有和流動相一致的硫酸質量濃度,然后用10%乙醇溶液定容,混勻后離心過濾。取部分濾液用0.22 μm水性濾膜針頭過濾器過濾,供離子色譜分析用。在此條件下,主要有機酸提取完全,且提取液在室溫條件下穩定性好,至少在15 d內各主要有機酸不會轉變為乳酸和乙酸。優化后的提取方法精密度高(RSD為0.28%—1.20%),重復性好(變異系數為0.236%—3.02%(n=5)),準確度高(回收率為88.9%—101.2%),有機酸組分測定效果優于已有國標測定結果。【結論】該方法快速、簡便,準確度高、重現性好,適合水果果實中主要有機酸含量的測定。
    預乳化液超聲處理對低脂法蘭克福香腸品質的影響
    趙穎穎, 鄒玉峰, 王鵬, 陳林, 李可, 徐幸蓮
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2634-2642.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.015
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    【目的】采用超聲法制備酪蛋白酸鈉-大豆油預乳化液,將其作為豬背脂替代品加工低脂法蘭克福香腸。【方法】研究不同超聲預乳化液替代比例(25%、50%、75%和100%)下,法蘭克福香腸的化學組成、色澤(亮度、紅度、黃度)、質構特性(硬度、咀嚼性、彈性、內聚性、回復性)、保水保油性(蒸煮損失、加壓損失)、水分子分布狀態和微觀結構。【結果】隨著超聲預乳化液替代比例的增加,水分含量增加,脂肪含量和能量減少(P<0.05),各組之間的灰分含量差異不顯著(P>0.05),蛋白質含量變化不大;L*值顯著增大,a*值顯著減小(P<0.05);彈性、內聚性和回復性隨著替代比例的增加而增大,替代比例達到50%以上時,彈性值與對照組差異不顯著(P>0.05),替代比例達到25%以上時,內聚性顯著高于對照組(P<0.05),替代比例高于50%時,回復性顯著高于對照組(P<0.05),硬度和咀嚼性隨著替代比例的增加而減小,但均高于對照組,質構特性提高;蒸煮損失和加壓損失增加,但均低于對照組(P<0.05),保水保油性改善。隨著替代比例的增加,T23從57.22 ms增至64.57 ms,pT23減小而pT24增加,但與對照組比,各處理組的可移動水含量高,自由水含量低。掃描電鏡結果表明,100%超聲替代組香腸中的乳化球體積小,填充均勻。【結論】超聲處理可以減小預乳化液滴的體積并提高蛋白質分子對水油的吸附和保持能力,從而有效改善低脂香腸的食用品質。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    堿性鹽脅迫對超干貯藏苜蓿種子幼苗生長及抗性的影響
    霍平慧, 李劍峰, 師尚禮, 張淑卿
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2643-2651.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.016
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    【目的】研究經硅膠脫水處理并密封貯藏1年后,不同含水量隴東紫花苜蓿(Medicago sativa L. cv. Longdong)種子在堿性鹽脅迫下的出苗、幼苗生長情況及抗性。【方法】采用硅膠干燥法對種子進行不同時間的脫水處理(0、12、24、48、72、96、120、144、216 h),將種子置于透氣網袋并埋入硅膠,種子與硅膠的比例1﹕10(w/w),每天定期更換經120℃高溫烘干至恒重的硅膠,分別得到不同含水量的種子(9.03%、7.09%、6.93%、6.36%、5.72%、5.46%、5.18%、4.97%、4.59%)。鋁箔密封并于室溫下通風干燥處貯藏1年后,以NaHCO3和 Na2CO3按9﹕1摩爾比混合,模擬典型脅迫環境,設置15 mmol•L-1堿性鹽脅迫,并結合Hoagland營養液進行室內盆栽沙培試驗。【結果】超干處理對堿性鹽脅迫條件下苜蓿種子的萌發、植株的高度生長、根系的長度生長及根瘤形成無明顯促進作用。30 d時,含水量大于5.46%的5個處理組植株的出苗數與對照比差異不顯著,而隨著含水量的繼續降低,含水量小于5.18%的4個盆栽處理組出苗數顯著低于對照;60 d時,各超干處理幼苗間株高無顯著差異,除4.59%含水量處理植株的根瘤數顯著低于對照,僅為對照的21.41%外,其他各處理根瘤數與對照比差異不顯著,根系長度除7.09%和4.97%含水量處理顯著高出對照外,其余各處理與對照比差異不顯著。適度含水量處理下,植株的生物量、根體積和葉片數有不同程度提高。各超干處理的地上與地下部鮮重指標變化趨勢基本一致,即6.93%、6.36%、5.72%和4.97%的超干處理植株鮮重顯著高于對照,地上部鮮重為對照的125.08%—147.84%,地下部鮮重為對照的128.36%—271.11%;除6.93%含水量超干處理植株的地上與地下部干重指標顯著高于對照,分別為對照的169.75%和370.16%外,其他各處理的地下部干重與對照比差異不顯著;除4.59%含水量超干處理幼苗的地上部干重顯著低于對照,其余各處理與對照比差異不顯著。60 d時,6.93%和6.36%含水量處理植株的根體積顯著高于對照,分別為對照的175.68%和189.21%, 6.93%、6.36%和4.97%含水量處理的植株葉片數顯著高于對照,其他各處理與對照比差異不顯著。盆栽60 d將植株洗出時,6.93%、6.36%、5.72%、5.46%、5.18%、4.97%等6個含水量處理植株根系活力提高137.45%—199.62%,5.72%、5.46%、5.18%、4.97%等4個含水量處理植株可溶性糖含量提高176.76%—294.20%,所有超干處理種子所得植株的葉綠素含量均高于對照,為對照的137.82%—211.76%,而所有超干處理植株的MDA含量均低于對照,僅為對照的4.66%—51.69%。【結論】對隴東紫花苜蓿種子進行適度超干處理和貯藏有利于其植株生物量、根體積的增加以及葉片的生長和葉綠素的形成,可以促進植株根系活力的提高以及脅迫下植株抗性的增強,表明適度超干處理作為種子預處理方式,可以促進苜蓿種子在堿性鹽脅迫條件下的萌發及幼苗的生長。
    一株中等毒力牛種布魯氏菌的鑒定和毒力測定
    丁家波1, 王芳1, 楊宏軍2, 王楠1, 朱良全1, 顧進華1, 張廣川1, 王海光1, 趙鵬3, 程君生1, 毛開榮1, 馮宇3
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2652-2658.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.017
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    【目的】對初步鑒定的牛種布魯氏菌分離株(B. abortus 343)進行全面的生物學特性檢定,為深入研究布魯氏菌病提供參考菌株。【方法】將B. abortus 343劃線培養及梯度稀釋,使其形成單個菌落,觀察菌落形態。挑取單個菌落進行革蘭氏染色和柯氏染色,觀察其染色特點;分別接種1.5×106 CFU到含硫瑾(1﹕25 000)或含堿性復紅(1﹕25 000)的TSA平板上,觀察其生長狀態;將接種有B. abortus 343的TSA平板分別置于普通培養箱和CO2培養箱37℃培養72 h,觀察其對CO2的依賴性;通過醋酸鉛試紙條測定B. abortus 343代謝過程中是否釋放H2S。通過平板凝集試驗測定布魯氏菌單相特異性血清( 牛種布魯氏菌單因子血清A、羊種布魯氏菌單因子血清M 和 布魯氏菌粗糙型血清R )與B. abortus 343抗原的反應性;利用布魯氏菌AMOS-PCR種屬分型等方法對B. abortus 343進行了PCR種屬特性鑒定;將B. abortus 343免疫小鼠,分別測定其抗血清與光滑型和粗糙型抗原的反應性;通過小鼠和豚鼠感染試驗,全面評價該分離株的毒力;分別以1×105 CFU感染6周齡Balb/c小鼠,測定B. abortus 343在小鼠體內存活時間;以1×109 CFU感染Hartley豚鼠,2周后測定試驗豚鼠每克脾臟含菌量;分別以10 000、1 000、100、25 CFU/只4種不同劑量感染豚鼠,初步測定分離株對豚鼠的最小感染量(MID),在此基礎上,進一步以40、60和90 CFU/只測定MID。【結果】分離株B. abortus 343 為光滑型牛種布魯氏菌,菌落逆光觀察微帶藍綠色乳光;革蘭氏染色為陰性,柯氏染色為紅色,H2S試驗陽性。該菌能在含硫瑾和堿性復紅的培養基上生長,不依賴于CO2。B. abortus 343抗原能與A因子血清呈明顯凝集反應,免疫小鼠后能產生特異性抗體。以1×105 CFU感染6周齡Balb/c小鼠,可在小鼠體內存活29周;以1×109 CFU感染350—400 g雌性豚鼠,14 d后豚鼠每克脾臟含菌量2.4×105—1.2×106;以1×105 CFU感染豚鼠1個月后,所有試驗豚鼠均能產生特異性光滑型抗體,試管凝集效價為320—1 280;B. abortus 343對豚鼠的最小感染量約為40 CFU。【結論】鑒定了一株中等毒力牛種布魯氏菌(B. abortus 343),為深入研究布魯氏菌病提供了參考菌株,豐富了布魯氏菌菌種資源。
    家蠶sirtuin家族基因的鑒定及系統發生與表達芯片分析
    陳聰, 宋江波, 孟剛, 童曉玲, 代方銀, 魯成
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2659-2670.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.018
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    【目的】鑒于sirtuin家族基因重要而多樣性的功能,從家蠶全基因組中鑒定sirtuin家族基因,并進行基因結構、蛋白結構及其理化性質、基因進化、組織表達芯片分析及在不同組織中的定量表達情況分析,為研究家蠶sirtuin家族基因的功能和推動家蠶模式生物系統化的研究奠定基礎。【方法】基于家蠶基因組數據庫,通過生物信息學手段,利用比較基因組學方法,鑒定家蠶sirtuin家族成員;開放閱讀框(ORF)的預測用ORFfinder進行;使用SIM4進行ORF的內含子和外顯子的預測;用GSDS和ExPaSy在線工具分別進行基因結構圖和蛋白序列理化性質的預測;用CLUSTAL_X軟件進行多序列聯配及對其二級結構進行分析,并用ESpript進行二級結構作圖;使用SMART在線軟件進行蛋白功能域預測;MEGA5.0軟件用于系統發生樹分析;利用已有的家蠶幼蟲5齡第3天的芯片數據進行組織表達分析;利用熒光定量PCR技術檢測家蠶sirtuin家族基因在5齡第3天幼蟲不同組織中的表達情況。【結果】系統分析鑒定了家蠶中存在的5個sirtuin家族基因(Bmsirt2、Bmsirt4、Bmsirt5、Bmsirt6、Bmsirt7),共分為4類(I、II、III、IV)。5個基因分布在家蠶5條染色體上,均為單拷貝基因。基因結構分析顯示5個基因均為多外顯子基因。同源比對和系統進化分析發現家蠶的sirtuin家族基因與類群中其他昆蟲的同源基因形成明顯的直系同源關系且高度同源,同樣不含有sirt3。蛋白結構預測發現家蠶的sirt6與其他物種的sirt6蛋白一樣含有兩個sir2結構域聚在一起。組織表達芯片分析發現,sirtuin家族基因在多個組織中具有轉錄活性。熒光定量PCR檢測結果顯示家蠶的Bmsirt4在脂肪體、絲腺中低表達;Bmsirt5在精巢、中腸中高量表達,在脂肪體、血液、絲腺中低量表達,與芯片數據基本一致。【結論】通過全基因組分析,家蠶共有5個sirtuin家族成員,進化上分為4類,且與其他昆蟲高度同源,芯片數據和實時熒光定量 PCR 結果基本一致,分析表明組織表達模式具有多樣性。
    研究簡報
    小麥粒重基因TaCwi-A1功能標記CWI22、CWI21的驗證及應用
    相吉山1, 2, 穆培源1, 2, 桑偉1, 2, 聶迎彬1, 徐紅軍1, 莊麗2, 3, 崔鳳娟1, 2, 韓新年1, 鄒波1
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2671-2679.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.019
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    【目的】驗證已開發的TaCwi-A1功能標記CWI22、CWI21檢測小麥千粒重的可靠性,為分子標記輔助選擇提供參考信息。同時用該標記檢測新疆小麥品種資源,探討TaCwi-A1等位變異類型及分布頻率。【方法】首先以110份新疆冬小麥品種資源為材料,用CWI22、CWI21檢測TaCwi-A1基因型,并利用SKCS測定千粒重,比較TaCwi-A1a、TaCwi-A1b基因型品種間千粒重的差異。再以1 241份新疆小麥品種資源為材料,對TaCwi-A1基因型進行分子標記檢測。【結果】在110份新疆冬小麥品種資源中,有46份材料能夠用CWI22擴增出402 bp的目的片段,說明含有TaCwi-A1a;有64份材料能夠用CWI21擴增出404 bp的目的片段,說明含有TaCwi-A1b;并且TaCwi-A1a基因型品種(系)的千粒重(43.5 g)顯著高于TaCwi-A1b(40.9 g)(P<0.05)。1 241份新疆小麥品種資源中,TaCwi-A1a的分布頻率為62.6%,TaCwi-A1b為37.4%。其中,冬小麥中TaCwi-A1a的分布頻率為63.0%,TaCwi-A1b為37.0%;春小麥中TaCwi-A1a的分布頻率為61.7%,TaCwi-A1b為38.3%,并且TaCwi-A1a在不同類型冬、春小麥品種資源中的分布頻率大小順序均為國外品種(系)>國內品種(系)>自育品系>審定品種>地方品種;新疆小麥審定品種中,冬小麥TaCwi-A1a的分布頻率為40.0%,TaCwi-A1b為60.0%,春小麥TaCwi-A1a的分布頻率為68.6%,TaCwi-A1b為31.4%。在1990年以前、1991—2000年、2001年以后3個階段的審定品種中,TaCwi-A1a和TaCwi-A1b的分布頻率分別為11.1%和88.9%、50.0%和50.0%、69.2%和30.8%。【結論】TaCwi-A1的分子標記CWI22、CWI21能夠較好地區分小麥千粒重的大小,可用于粒重的分子標記輔助選擇。在新疆小麥品種資源中,TaCwi-A1a有較高的分布頻率。其中,冬小麥品種資源中的分布頻率略高于春小麥品種資源,引進品種(系)高于自育品種(系),自育品種(系)高于地方品種。在地方品種和自育品種(系)中,TaCwi-A1a在春小麥中的分布頻率明顯高于冬小麥,說明新疆冬、春小麥育種對粒重的選擇存在一定的差異;但總體都有較強的選擇壓力,使TaCwi-A1a在審定品種中的分布頻率逐漸提高。
    大豆蛋白質和油分含量QTL定位及互作分析
    侯萌1, 齊照明1, 韓雪2, 辛大偉1, 蔣洪蔚2, 劉春燕2, 吳瓊1, 隋麗麗4, 胡國華2, 3, 陳慶山1, 3
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2680-2689.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.020
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    【目的】定位大豆蛋白質和油分含量QTL及互作分析,為大豆品質性狀QTL精細定位和分子輔助育種提供基礎。【方法】以Charleston和東農594為親本,構建了含147個株系的重組自交系,以F2:19—F2:20代重組自交系為試驗材料,利用Windows QTL Cartographer V. 2.5軟件的復合區間作圖法和多重區間作圖法,對該群體的蛋白質和油分含量進行QTL定位分析,并利用QTL Network 2.1軟件分析QTL間的上位性效應及環境互作效應。【結果】采用CIM和MIM 2種算法在2011和2012年哈爾濱、紅興隆、佳木斯和牡丹江每年3個地點共6個種植環境下共定位了9個蛋白質和11個油分含量QTL。蛋白質含量QTL分布在6個連鎖群,分別在A1、C2、D1a、G、H和O連鎖群上,對表型效應的貢獻率為5.3%—18.6%,在H連鎖群上的qPro-H-1貢獻率最大,為18.6%,在D1a連鎖群上的qPro-D1a-2貢獻率最小,為5.3%,在單種植環境下有5個蛋白質含量QTL被2種算法同時檢測到,分別是qPro-O-1、qPro-A1-1、qPro-D1a-1、qPro-D1a-2和qPro-C2-2。油分含量QTL分布在8個連鎖群,分別在A1、A2、B1、C2、D1a、E、L和M連鎖群上,對表型效應的貢獻率為7.1%—24.4%,在B1連鎖群上的qOil-B1-2貢獻率最大,為24.4%,在C2連鎖上的qOil-C2-3貢獻率最小,為7.1%,在單種植環境下有2個油分含量的QTL被2種算法同時檢測到,分別為qOil-C2-1和qOil-M-1。另外,有2個油分含量QTL在2個以上種植環境重復檢測到,為2011年哈爾濱和2011年紅興隆2個種植環境下同時檢測出的qOil-A1-1,2011紅興隆、2011牡丹江和2012哈爾濱3個地點同時被檢測出的qOil-B1-2。在互作效應分析中,共檢測出3對蛋白質上位效應QTL和4對油分上位效應QTL,在蛋白質上位性分析中,上位效應值在0.2068—0.3124,貢獻率在0.0227%—0.0265%,分布在A1、C2、D1和E連鎖群上,其中,qPro-A1-3與qPro-C2-1效應值為負,其余2對效應值為正,連鎖群A1,D1a均有2個QTL發生互作。在油分上位性分析中,上位效應值在0.0926—0.1682,貢獻率在0.0294%—0.0754%,分布在A1、C2、I、J、N和O連鎖群上,其中,qOil-C2-4與qOil-N-1效應值為負,其余3對效應值為正,在N連鎖群的qOil-N-1同時與2個QTL發生互作,分別是C2連鎖群上的qOil-C2-1和qOil-C2-4。在與環境互作中,qPro-D1a-3與qPro-E-1在2012年佳木斯地點沒檢測出,其余6對都檢測出與環境的互作效應,貢獻率分別為0.0001%—0.0378%,互作效應都較小,明顯小于自身的加性效應。【結論】定位到9個蛋白質相關QTL和11個油分相關QTL,并發現3對蛋白質含量上位性效應QTL和4對油分含量上位性QTL。
    牦牛CYGB基因CDS區克隆與生物信息學分析
    孫雪婧1, 3, 杜曉華1, 3, 楊孝樸1, 羅玉柱3, 劉霞2, 3
    中國農業科學. 2014, 47(13):  2690-2698.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.021
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    【目的】豐富牦牛CYGB基因研究的基礎數據,對牦牛CYGB基因的CDS區進行克隆和生物信息學分析。【方法】提取牦牛大腦海馬區組織的總RNA并運用RT-PCR技術反轉錄為cDNA,并根據GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列(GenBank登錄號:DV874786.1),使用Primer3.0在線軟件設計特異性引物,運用PCR擴增技術、TA克隆技術和核酸測序技術獲得CYGB基因的完整CDS區序列及部分5′端和3′端UTR區,并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在線分析軟件與Lasergene7.1軟件包分析CYGB的一級結構、二級結構、三級結構與理化性質,并進行同源性分析及構建系統進化樹;利用PyMol軟件修飾并輸出三維結構;使用在線亞細胞定位工具PSORT II Prediction預測蛋白質的亞細胞定位;使用Protfun軟件對蛋白質的功能進行預測分析。【結果】克隆獲得牦牛CYGB基因650 bp,包括CDS區573 bp(GenBank登錄號:KF669898),堿基組成為A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%,編碼190個氨基酸殘基組成的蛋白質。與普通牛比對,牦牛CYGB基因在CDS區存在4個堿基突變,同源性為99.3%,這個突變未導致氨基酸序列的改變,4個突變均屬同義突變。牦牛CYGB基因編碼蛋白的分子式為C964H1513N263O278S7,分子量約為21.5 kD,理論等電點(pI)為6.32,消光系數為24075,不穩定系數為48.43,疏水指數為83.63,平均親水性為-0.301,屬不穩定可溶性酸性蛋白質,在哺乳動物網織紅細胞內的半衰期為30 h。二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主,其中α-螺旋占64.21%,無規卷曲占35.79%,屬全α類蛋白質。三級結構是一個呈“three-over-three”三明治夾心型的α-螺旋折疊結構。亞細胞定位CYGB分布在細胞質(65.2%)、細胞核(17.4%)、線粒體(13.0%)、分泌系統的囊泡(4.3%)中,主要在細胞質,推測可能在能量代謝和輔因子的生物合成過程中發揮信號轉導和轉錄因子調控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列與普通牛、綿羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原雞、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分別為100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%,物種之間同源性較高,系統進化情況與其親緣關系遠近一致,說明CYGB基因編碼區在進化過程中比較保守。【結論】通過RT-PCR與TA克隆技術及核酸測序技術獲得了牦牛CYGB基因全長573 bp的CDS區,并對其核苷酸序列和編碼蛋白氨基酸序列及其蛋白結構和功能進行了分析,得知牦牛的CYGB是一個由190個氨基酸殘基構成的可溶酸性蛋白質,在能量代謝和輔因子生物合成過程中發揮重要作用。CYGB基因編碼區在長期生物進化過程中具有較強的保守性。該基因的成功克隆及分析為揭示牦牛CYGB基因的遺傳特性提供了理論依據。
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