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當期目錄

    2014年 第47卷 第15期 刊出日期:2014-08-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    水稻斑馬葉突變體zebra524的表型鑒定及候選基因分析
    李燕群, 鐘萍, 高志艷, 朱柏羊, 陳丹, 孫昌輝, 王平榮, 鄧曉建
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2907-2915.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.001
    摘要 ( 426 )   HTML ( 3 )   PDF (726KB) ( 845 )   收藏
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    【目的】對水稻斑馬葉突變體zebra524進行表型鑒定和候選基因分析,為進一步探討該基因功能及在農業生產上的應用奠定基礎。【方法】用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變粳稻品種日本晴建立突變體庫,從突變體庫中篩選得到1份苗期為斑馬葉的突變體,該突變體被命名為zebra524。對突變體的表型進行系統觀察,并調查其主要的農藝性狀。然后,分別測量突變體苗期和孕穗期的葉片及灌漿期籽粒穎殼的光合色素含量。將突變體分別與正常綠色品種進行雜交,并調查雜交F1葉色表型和F2群體葉色分離情況。利用zebra524×岡46B的F2作為定位群體,對zebra524突變體進行基因定位和候選基因遴選,并進行DNA測序驗證及編碼蛋白序列同源性分析。【結果】zebra524突變體表現為苗期葉片白色和淡綠色橫向相間的斑馬葉,孕穗期葉片上白色的區域完全轉變為淡綠葉并且新長出的葉子表現為淡綠色,抽穗至灌漿結實期籽粒的穎殼蒼白色,成熟期節呈褐色、節間基部呈粉紅色、胚和穎果基部呈橙紅色以及在黑暗條件下培養萌發的胚芽呈橙紅色。該突變體苗期及孕穗期葉片葉綠素含量分別降低82.8%和20.9%,類胡蘿卜素含量分別降低64.7%和32.6%;灌漿結實期籽粒穎殼的葉綠素和胡蘿卜素含量分別降低38.1%和42.8%。成熟期,zebra524突變體的株高、每穗著粒數、結實率和千粒重比野生型分別減少12.3%、9.5%、13.0%和5.4%。zebra524突變體F1的植株葉片表現為正常的綠色,雜交F2群體中正常植株與突變植株分離明顯,正常葉色植株數目與突變植株數目的比值接近3﹕1,表明zebra524的突變性狀是由1對隱性核基因控制。該突變基因被定位于第2染色體短臂上的SSR標記RM7082和InDel標記Y2之間,遺傳距離分別為0.5 cM 和1.7 cM,這2個標記之間的物理距離約為235 kb。序列分析發現,zebra524突變體在LOC_Os02g09750編碼區第235堿基處堿基G突變為堿基T,使得編碼蛋白的氨基酸序列第79位甘氨酸(Gly)突變成半胱氨酸(Cys)。【結論】zebra524的突變基因與已報道的β-OsLCY等位,該突變體表型可能是由于β-OsLCY發生單堿基突變造成的。
    小麥骨干親本京411及衍生品種苗期根部性狀的遺傳
    肖永貴1, 路亞明1, 聞偉鍔1, 陳新民1, 夏先春1, 王德森1, 李思敏1, 童依平2, 何中虎1, 3
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2916-2926.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.002
    摘要 ( 372 )   HTML ( 1 )   PDF (1007KB) ( 695 )   收藏
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    【目的】利用高密度SNP標記解析骨干親本京411的遺傳結構,并研究其根系性狀遺傳特征,為培育高產廣適性品種奠定基礎。【方法】選用京411及其14個衍生品種(系),包括衍生一代6份,衍生二代8份,每品種選取飽滿且大小一致的種子在發苗網上生長6 d,每份材料選取大小一致的幼苗轉移至培養盤,每個培養盤種植3次重復,連續培養15 d后測定苗期根部性狀的最長根長、側根長、主根長、總根長、側根表面積、主根表面積、總根表面積、總根尖數和根系干重。利用90K SNP芯片分析京411及其衍生后代群體的遺傳結構和遺傳區段傳遞,結合逐步回歸分析定位苗期根部性狀基因,探討京411攜帶的優異根系基因在衍生后代中的分布。【結果】京411衍生群體平均遺傳相似性為57.9%,該親本與其衍生一代和衍生二代相同的等位變異頻率分別為63.9%和67.9%,顯著高于理論值。在A、B和D基因組間的相同等位變異頻率分別為62.2%、61.3%和74.3%。京411的側根和根尖數均優于其衍生品種,衍生品種的主根長和根干物質重量等性狀的改良較為顯著。以已有定位信息的SNP標記與根系性狀進行逐步回歸分析,共發掘出35個根系性狀位點,3DL和5BL上攜帶控制根長性狀的主效位點,分別與SNP標記wsnp_Ex_c1032_1972861和BS00100708_51關聯,可用于京411衍生群體中分子輔助選擇。來自京411的26個位點對根部性狀起正向效應,中麥175和CA0958攜帶正向效應區段最多,占正向效應位點總數的73.1%。【結論】傳統育種對地上部農藝性狀的選擇,可有效促進地下根系的改良,相當于對優異性狀遺傳片段的聚合。在京411衍生群體中,中麥175是針對骨干親本遺傳改良最成功的品種,不僅攜帶較多的京411優異根系基因,而且其主要根系性狀、產量表現及廣適性均優于京411。
    不同基因型大豆耐蔭性分析及其鑒定指標的篩選
    李春紅1, 2, 姚興東1, 鞠寶韜1, 朱明月1, 王海英1, 張惠君1, 敖雪1, 于翠梅1, 謝甫綈1, 宋書宏2
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2927-2939.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.003
    摘要 ( 426 )   HTML ( 2 )   PDF (728KB) ( 624 )   收藏
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    【目的】探討作物耐蔭性評價的方法,分析不同大豆基因型耐蔭特性,篩選鑒定指標,建立可靠的耐蔭性評價模型。【方法】以30個大豆品種(系)為試材,采用田間試驗的方法,設遮光和自然光照2個處理。遮光處理采用玉米-大豆帶狀復合種植在田間創設蔭蔽條件,玉米品種為鄭單958,在玉米植株長成以后,遮光率為70%;大豆清種作為對照。在成熟期調查主莖高(X1)、莖粗(X2)、主莖節數(X3)、分枝數(X4)、底莢高度(X5)、節間長度(X6)、植株重量平衡點(X7)、倒伏性(X8)、單株莢數(X9)、單株粒數(X10)、每莢粒數(X11)、百粒重(X12)、粒莖比(X13)和單株產量(X14)。根據遮光處理和自然光照條件下的各項指標的耐蔭系數,采用主成分分析、隸屬函數法、聚類分析和逐步回歸分析方法,對大豆的耐蔭性進行綜合評價。【結果】通過主成分分析將14個單項指標轉換為5個相互獨立的綜合指標,代表了全部數據87.685%的信息量。通過隸屬函數法計算綜合耐蔭評價值(D),并對其進行聚類分析,將30個大豆品種(系)按照耐蔭性的強弱劃分為3類。第Ⅰ類屬于強耐蔭類型,第Ⅱ類屬于中度耐蔭類型,第Ⅲ類屬于不耐蔭類型。通過逐步回歸建立大豆耐蔭性評價數學模型,D=-0.5495+0.2932X3+0.0592X4+0.1628X6-0.0244X8+0.5943X9+0.1345X12+0.8210X14(R2=0.9908),估計精度在93.67%以上,并篩選出7個鑒定指標,分別是主莖節數、分枝數、節間長度、抗倒性、單株莢數、百粒重和單株粒重。【結論】30個大豆品種(系)被分成強耐蔭型、中等耐蔭型和不耐蔭型3類,且主莖節數、分枝數、節間長度、抗倒性、單株莢數、百粒重和單株粒重可以作為大豆耐蔭性的鑒定指標。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    干旱脅迫下小麥(Triticumaestivum L.)幼苗中ABA 和IAA的免疫定位及定量分析
    張煒1, 高巍2, 曹振1, 何麗珊1, 譚桂玉1, 王保民1
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2940-2948.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.004
    摘要 ( 471 )   HTML ( 1 )   PDF (1042KB) ( 898 )   收藏
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    【目的】干旱是農業生產中存在的嚴重問題,是制約作物生長和限制農業種植面積進一步擴大的最主要因素,探明植物抗旱機理,將為農業增產增收提供重要保障。本試驗旨在分析干旱脅迫下小麥幼苗中(根、葉鞘、葉片)脫落酸(ABA)和吲哚乙酸(IAA)的定位及含量,探索其動態變化規律,為干旱地區作物栽培的激素調控、干旱條件下小麥的化學調控提供理論依據。【方法】以冬小麥品種魯麥21號為材料,采用溫室盆栽自然干旱法,以免疫組織化學定位方法研究干旱脅迫下小麥幼苗(根、葉鞘、葉片)中內源激素ABA和IAA的定位,并用間接酶聯免疫吸附測定法(icELISA)進行內源ABA和IAA含量分析。通過比較免疫組織化學定位的化學信號強度和icELISA檢測的內源ABA和IAA含量,驗證本試驗結果的有效性。【結果】稱重法控制水分持續干旱4周后,對照組(CK)小麥植株直立生長,葉片健康呈綠色,長勢良好。干旱處理組(ND)小麥植株矮小,葉片面積減小,有不同程度的萎蔫和發黃現象。干旱脅迫下小麥幼苗根、葉鞘、葉片中的ABA免疫組織熒光信號均強于對照,其中葉片強弱差異最顯著,葉鞘次之,各器官中保衛細胞和維管的強弱對比最為明顯;IAA免疫熒光信號強度也高于對照,但相比ABA不明顯;用icELISA進行定量分析,比較免疫組織化學定位的信號強度和icELISA檢測的內源激素含量表明,上述免疫組織化學定位結果與icELISA的測定結果相一致,其中,根中的ABA含量為61.51 ng•g-1 FW,是對照的2.82倍(21.8 ng•g-1 FW);葉鞘中ABA含量增加幅度較大,為175.35 ng•g-1 FW,是對照的3.65倍(48.02 ng•g-1 FW);葉片中ABA含量增幅最大(512.12 ng•g-1 FW),為對照的10.16倍(50.42 ng•g-1 FW)。顯著性分析表明,干旱脅迫與正常供水小麥幼苗根、葉鞘、葉片中ABA含量差異均呈極顯著(P<0.01)。用icELISA對IAA進行檢測,正常供水時,小麥幼苗根、葉鞘、葉片中的IAA含量分別為72.81、274.46 和195.75 ng•g-1 FW。水分脅迫條件下,IAA含量增加但幅度不大,分別為123.56、400.48 和417.30 ng•g-1 FW。葉片中IAA上升的幅度稍大為對照的2.13倍,根、葉鞘中的IAA含量分別為對照的1.70和1.46倍。顯著性分析(t檢驗法)顯示,在干旱脅迫與正常供水條件下小麥幼苗根中IAA含量差異不顯著(P>0.05),但葉片和葉鞘中IAA含量差異極顯著(P<0.01)。【結論】水分脅迫下小麥幼苗根、葉鞘、葉片中ABA和IAA含量均增加,ABA含量增加幅度較大,IAA較ABA含量增加幅度較小。二者之間協調的總趨勢是向著氣孔關閉,促進根系生長,減緩莖葉生長速率的方向發展,可有效的避免缺水傷害。
    綜合農藝管理對夏玉米葉片衰老特性的影響
    朱昆侖, 靳立斌, 董樹亭, 趙斌, 劉鵬, 張吉旺
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2949-2959.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.005
    摘要 ( 347 )   HTML ( 1 )   PDF (678KB) ( 715 )   收藏
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    【目的】研究綜合農藝管理對夏玉米葉片衰老特性的影響。【方法】以鄭單958為試驗材料,對播期、播種方式、密度、氮肥施用時期及用量和收獲時間等農藝措施進行優化組合,設置綜合農藝管理試驗,共4個處理:按當地農戶習慣即麥田后期套種玉米、苗期一次性施氮和苞葉變白、籽粒變硬時收獲等設置為處理1(T1);在此基礎上改套種為直播,減少氮肥施用量,優化施肥時期,延遲收獲時間,設置為處理2(T2);在T2的基礎上進一步提高施肥量,增加磷、鉀肥比例,將氮肥分次施用,增加種植密度,以期達到最高產量,設置為處理3(T3);在T3的基礎上減少施肥量,進一步優化施肥時期,適當降低種植密度,設置為處理4(T4)。然后以T4處理為基礎設置單因素施氮量試驗(0、129.0、184.5和300.0 kg N•hm-2,分別記作N0、N1、N2和N3),研究綜合農藝管理和施氮量對夏玉米葉面積指數、葉片光合色素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響。【結果】從大喇叭口期(V12)到抽雄后42 d,T4處理的LAI平均維持在4.4以上,顯著高于T1和T2處理,且后期下降緩慢。在施氮量試驗中,LAI隨施氮量的增加而增加,從抽雄后28 d到成熟期(R6),N3的LAI平均下降了14.9%,高于其他施氮處理的降幅。綜合農藝管理試驗(MT)和施氮量試驗(NT)的葉片光合色素含量均呈單峰曲線變化,在抽雄后14 d達到最大值,之后逐漸下降,從抽雄后14—42 d,T1、T2、T3和T4處理葉綠素(a+b)的含量分別減少了21.1%、22.0%、27.2%和18.4%,類胡蘿卜素含量分別減少了26.6%、26.9%、32.2%和25.0%。抽雄后42 d,T4的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)和類胡蘿卜素含量分別較T1提高了6.0%、13.0%、6.9%和9.3%。NT試驗中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素(a+b)的含量隨施氮量的增加而增加;N3處理的類胡蘿卜素含量生育后期急劇下降,到抽雄后42 d,N3處理的類胡蘿卜素含量較N0降低4.5%。MT和NT試驗各處理穗位葉的SOD、CAT和POD活性均呈單峰曲線變化,在抽雄后14 d達到最大值,之后逐漸下降,T4處理的SOD、CAT和POD活性始終維持在較高水平且后期下降緩慢;NT試驗中隨施氮量增加,SOD、CAT和POD活性增加,但是,與N2處理相比較,N3 的LAI和葉片的SOD活性、CAT活性等未全部隨施氮量增加而顯著增加,且N3處理生育后期葉片保護酶活性下降快于其他施氮處理。隨生育進程的推進,MT和NT處理穗位葉的MDA含量均呈上升趨勢,T4處理始終維持在較低水平,增施氮肥葉片MDA含量逐漸降低。【結論】在75 000株/hm2種植密度條件下,當施氮量超過184.5 kg•hm-2后,繼續單一增施氮肥不能持續增加保護酶活性,減少MDA含量,且導致保護酶活性下降加快,MDA含量增加變快,不利于氮素的高效利用。通過改麥套為麥收后直播、適當增加種植密度、分次合理施氮和適期收獲等綜合農藝措施優化可提高葉片光合色素含量且生育后期降低緩慢,葉片保護酶活性較高,MDA含量維持較低水平,這可能是其產量和氮素效率提高的原因。
    河西制種基地玉米雜交種種子成熟期與種子活力的關系
    樊廷錄1, 王淑英1, 王建華2, 楊珍3
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2960-2970.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.006
    摘要 ( 339 )   HTML ( 1 )   PDF (757KB) ( 570 )   收藏
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    【目的】研究河西制種基地玉米雜交種種子成熟度與種子活力的關系,確定高活力種子的適宜收獲期,為種子企業躲避早秋霜凍提供依據。【方法】選擇硬粒型先玉335、馬齒型鄭單958和吉祥1號3個雜交種制種田,授粉后每隔3—5 d采集果穗測定籽粒水分,實驗室進行標準發芽和冷浸抗冷試驗,測定種子發芽率和浸出液電導率,籽粒乳線發育按5級分類法記錄:1=整個胚乳是液體狀,無乳線;2=種子長度的25%充滿硬化胚乳層,乳線出現在離種子頂部1/4處;3=種子長度的50%充滿硬化胚乳層,乳線出現在種子1/2處;4=種子長度的3/4含硬化胚乳層,乳線下移到接近種子基部;5=整個種子是硬化的胚乳層,乳線消失。【結果】不同玉米雜交種、授粉后不同采收期對籽粒水分、脫水速率、種子發芽率和活力影響達到極顯著水平,先玉335脫水早、脫水快,授粉后32 d時籽粒水分比鄭單958、吉祥1號低10%—15%,授粉后32—75 d隨著灌漿的進行果穗籽粒水分遞減,平均生理脫水速率先玉335(0.70%/d)高于鄭單958(0.62%/d)和吉祥1號(0.49%/d),籽粒水分每減少1%,先玉335、鄭單958和吉祥1號百粒重依次增加0.73 g、0.50 g、0.29 g。不同采收期種子成熟度和種子活力有較大差異,籽粒水分為70%—40%,隨著水分降低,種子發芽率增加、浸出液電導率減少,水分每減少1%,先玉335、鄭單958和吉祥1號發芽率依次提高3.37%、2.76%、1.67%。隨著灌漿時間推后,籽粒發芽率增加、電導率降低,但雜交種之間有一定差異,授粉后32 d 3個雜交種標準發芽率為30.0%—59.0%,6℃冷浸3 d發芽率為2.5%—36.9%,授粉47 d以后先玉335冷浸芽率與標準發芽率接近,而鄭單958、吉祥1號冷浸發芽率始終明顯低于標準發芽率,即種子抗低溫能力大小為先玉335>鄭單958>吉祥1號。種子發育過程中籽粒水分與乳線發育明顯相關,隨著水分減少乳線下移,先玉335籽粒乳線出現早、消失也早,鄭單958次之,吉祥1號乳線出現最遲、消失最晚,乳線發育到籽粒1/2處時,籽粒水分降到38%—40%,種子標準發芽率和冷浸發芽率均接近較高值,此時先玉335、鄭單958百粒重占生理成熟時最大百粒重的76.6%和88.0%。【結論】玉米種子成熟度影響種子活力大小,發芽率和活力最大的采收期宜在乳線到籽粒中部位置,此時籽粒水分40%左右,而不是干物質達到最大的生理成熟期,甘肅武威制種基地先玉335高活力種子的適宜采收期開始于授粉后47 d,而鄭單958和吉祥1號在授粉后60 d,比目前生產收獲期提前10—15 d,可避免早霜凍對玉米種子質量的影響。
    植物保護
    灰葡萄孢BcKMO在病菌生長、發育和致病過程中的功能
    李培芬, 趙福鑫, 董麗萍, 鄭會欣, 趙斌, 張靖, 司賀龍, 邢繼紅, 韓建民, 董金皋
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2971-2979.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.007
    摘要 ( 331 )   HTML ( 1 )   PDF (661KB) ( 674 )   收藏
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    【目的】明確灰葡萄孢BcKMO在病菌生長、發育和致病過程中的功能,為闡明該基因調控灰葡萄孢生長、發育和致病的分子機理奠定基礎,并為灰霉病的防治提供理論依據。【方法】利用生物信息學方法,對BcKMO及其編碼產物進行分析。擴增BcKMO的編碼區,與pBARKS1-eGFP載體連接,構建基因的表達載體pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介導的原生質體轉化方法,轉化BcKMO的T-DNA插入突變體BCG183的原生質體;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技術,對所獲得轉化子進行鑒定;對野生型菌株BC22、突變體BCG183和回復突變體BCG183/BcKMO的表型(菌落形態、菌絲形態、生長速度、產孢量等)和致病力進行分析。【結果】BcKMO編碼犬尿氨酸單氧酶(kynurenine 3-monooxygenase,KMO),含有單氧酶FAD的保守結構域和4個類似芳香環羥化酶(Aromatic-ring hydroxylase-like)的基序,與核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的Rossmann卷曲NAD(P)(+)-結合蛋白(Rossmann-fold NAD(P)(+)-binding proteins,gi156049701)和從線嘴殼(Ophiostoma piceae)的FAD依賴性氧化還原酶(FAD-dependent oxidoreductase,gi512192943)同源性較高。成功構建了BcKMO的表達載體pBARKS1-BcKMO-eGFP,利用PEG介導的轉化方法,轉化突變體BCG183的原生質體,獲得了草胺膦抗性的轉化子;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技術鑒定轉化子,獲得了BcKMO的回復突變體BCG183/BcKMO。對突變體BCG183和回復突變體BCG183/BcKMO的表型進行了分析,發現BCG183突變體的生長速率減慢,不產生分生孢子和菌核,菌絲纖細;回復突變體和野生型菌株的生長速率、菌絲形態基本一致,均產生分生孢子和菌核。致病力分析發現,BCG183突變體在蕓豆葉片和黃瓜葉片上的致病力均較野生型和回復突變體明顯增強。【結論】灰葡萄孢BcKMO正調控病菌的生長、發育,負調控病菌的致病力。
    蘋果樹腐爛病菌GTP-環化水解酶II基因敲除載體構建及其突變體的表型分析
    宋娜, 戴青青, 宋娜, 黃麗麗, 韓青梅
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2980-2989.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.008
    摘要 ( 330 )   HTML ( 1 )   PDF (695KB) ( 672 )   收藏
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    【目的】利用反向遺傳學方法構建蘋果樹腐爛病菌(Valsa mali)中表達GTP-環化水解酶II基因Vmgtp1的敲除載體,通過同源重組的方法進行基因敲除分析目標基因的功能,為全面解析蘋果樹腐爛病菌致病的分子機制奠定基礎,并為有效控制蘋果樹腐爛病的方法技術和藥劑研制提供理論依據。【方法】通過對筆者實驗室蘋果樹腐爛病菌轉錄組數據的分析比對得到GTP-環化水解酶II基因Vmgtp1(暫命名),該基因在接種5 d后,在病組織中表現出一定的上調表達,推測該基因可能與蘋果樹腐爛病菌致病相關。采用Double-joint PCR方法,將目標基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及篩選標記潮霉素磷酸轉移酶基因(hph)進行片段融合。對得到的PCR產物及質粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS進行雙酶切,通過T4連接酶,將片段UP-HPH-DOWN連接到質粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,轉化到JM109菌株中,挑取陽性克隆,提取質粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除載體,再利用PEG介導的遺傳轉化獲得抗潮霉素的突變體,然后用4對引物對突變體進行PCR檢測及Southern Blot驗證得到敲除突變體,最后對敲除突變體及野生型菌株03-8進行菌落顏色、菌落大小、繁殖體產生情況等表型分析和接種在離體蘋果燙傷枝條上觀察病斑大小的致病性檢測,對檢測數據用SPSS軟件進行差異顯著性分析。【結果】通過上述方法成功構建了表達GTP-環化水解酶II基因的Vmgtp1敲除載體,并利用PEG介導的遺傳轉化方法在蘋果樹腐爛病菌中進行了轉化,共獲得101個能夠在含潮霉素PDA培養基上生長的突變菌株,經過PCR及Southern Blot對101個突變菌株進行分析驗證,得到1個敲除突變體,編號為ΔVmgtp1-90。在PDA培養基上,敲除突變體ΔVmgtp1-90與野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生長速率為11.33 mm?d-1,03-8平均生長速率為24.67 mm?d-1,突變體菌落生長速率明顯變慢,顏色變淺,氣生菌絲稀疏;ΔVmgtp1-90光照培養40 d仍無繁殖體的產生,而03-8光照條件下培養15 d后就能產生繁殖體,30 d后有分生孢子從繁殖體上溢出。致病性檢測試驗發現,接種ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士蘋果枝條上病斑的平均直徑為9.3 mm,與之相比,接種03-8的蘋果枝條病斑平均直徑為24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性顯著減弱。【結論】通過基因敲除和遺傳轉化獲得蘋果樹腐爛病菌中表達GTP環化水解酶II Vmgtp1的敲除突變體ΔVmgtp1-90,比較Vmgtp1突變體與野生型菌株的表型及致病性差異,發現Vmgtp1可能參與調控蘋果樹腐爛病菌菌絲生長和繁殖體的產生過程,并且可能在蘋果樹腐爛病菌致病過程中起作用,但是是否起主要作用還有待進一步研究。
    北京地區二斑葉螨不同種群的藥劑敏感性
    宮亞軍1, 王澤華1, 石寶才1, 崔文夏1, 金桂華1, 孫艷艷2, 魏書軍1
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2990-2997.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.009
    摘要 ( 347 )   HTML ( 1 )   PDF (615KB) ( 497 )   收藏
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    【目的】明確北京地區作物上二斑葉螨(Tetranychus urticae Koch)不同種群對殺螨劑的敏感性水平,了解二斑葉螨對藥劑敏感性與體內4種解毒酶活力的相關性。【方法】在實驗室內采用改進的玻片浸漬法(slide-dip method)檢測北京房山、懷柔、昌平、延慶和平谷5個地區二斑葉螨田間種群對聯苯肼酯、阿維菌素、螺螨酯和噠螨靈4種殺螨劑的敏感性;采用PCR技術對單頭葉螨的CYTB基因進行擴增和測序,檢測二斑葉螨對聯苯肼酯的抗性突變位點;并采用酶標儀微量板法,檢測二斑葉螨體內與抗性相關的多功能氧化酶、乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶的活力。【結果】5個田間種群對聯苯肼酯最敏感,其LC50分別為2.4880、6.4693、6.2398、0.7882和14.7783 mg•L-1。對阿維菌素的敏感性次之,其LC50分別為22.4712、35.4431、14.5260、15.4904和14.0023 mg•L-1。對螺螨酯和噠螨靈的敏感性非常低,螺螨酯的LC50分別為49.6833、81.8826、72.9609、204.4609和1 433.5137 mg•L-1,噠螨靈的LC50分別為202.6902、806.8324、375.3518、188.3234和2 310.9040 mg•L-1。延慶地區二斑葉螨乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶的活性顯著高于其他地區,其活力分別為14.9508 U/(mg protein)、0.2271 μmol•mg-1 protein•30 min-1和58.2962 U/(mg protein)。懷柔地區多功能氧化酶的活性顯著低于其他地區,其活力為1.4272 μmol•mg-1 protein•30 min-1。聯苯肼酯、阿維菌素、螺螨酯和噠螨靈的敏感性水平與乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶和多功能氧化酶的酶活力之間沒有直接的線性關系;采用PCR技術對5個地區的288個二斑葉螨個體進行CYTB基因檢測后,僅發現懷柔地區的一個個體CYTB基因第126位氨基酸密碼子的第一位核苷酸由G突變為A導致氨基酸由G突變為S,其余地區均無突變,這與生物測定方法中各地區對聯苯肼酯較敏感的結果基本一致。【結論】北京地區二斑葉螨不同種群對聯苯肼酯敏感性最高,對阿維菌素的敏感性次之,對螺螨酯和噠螨靈敏感性非常低;二斑葉螨對4種殺螨劑的敏感性水平與乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶和多功能氧化酶的酶活力之間沒有直接的線性關系;通過檢測到的基因突變個體,說明懷柔地區二斑葉螨種群中存在著對聯苯肼酯產生高抗性風險的個體。PCR方法能夠更加快速準確地檢測種群抗性發展程度。基于以上結果,在農業防治二斑葉螨中應降低聯苯肼酯使用頻率,交替使用阿維菌素,避免使用螺螨酯,停止使用噠螨靈,以延緩和降低二斑葉螨產生抗性的風險。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    多種時序NDVI重建方法比較與應用分析
    張晗1, 任志遠1, 2
    中國農業科學. 2014, 47(15):  2998-3008.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.010
    摘要 ( 337 )   HTML ( 4 )   PDF (734KB) ( 731 )   收藏
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    【目的】NDVI時序數列能夠模擬植物的生長過程,反映其生長狀況。目前重建NDVI時序數列的方法有很多,由于模型和參數的不同導致結果存在不確定性以及偏差。本研究旨在對比3種模型(Whittaker平滑、HANTS和Savitzky-Golay濾波)在物候提取和復種指數提取中的應用,以探討各模型的優缺點。【方法】采用16 d間隔的MODIS MOD13Q1 2000—2012年陜西地區影像,利用3種模型擬合重建NDVI時序數列。首先,將研究區劃分為3個氣候區,每區分別選擇林地和耕地兩個采樣點,視覺比較各采樣點3種模型擬合效果。其次,通過均方根誤差、相關系數和信噪比對比各模型擬合精度,并探討不同植被類型之間擬合精度的差異。然后,采用動態閾值法提取13年植被物候參數(生長開始日期SOS、生長結束日期EOS、生長周期LOS),對比模型提取不同植被類型物候參數均值和標準差的差異。最后,利用二次差分算法和提取規則獲取陜西13年復種指數,對比3種模型提取和統計年鑒計算復種指數之間的差異。【結果】Savitzky-Golay濾波擬合精度較高,復種指數提取精度較高,但是提取物候參數方面存在較大誤差;HANTS提取物候參數效果較好,但參數設置復雜以及精度較差;Whittaker平滑參數設置簡單,能有效降低原始影像的信噪比,在精度和物候參數提取均表現良好;均方根誤差和相關系數作為精度檢驗的標準,二者存在負相關,相關系數比均方根誤差更靈敏。【結論】Whittaker平滑能夠很好地平衡NDVI時序數列的保真度和粗糙度,在提取物候參數方面表現良好,在提取復種指數方面還有待進一步研究。
    利用CMIP5多模式集合模擬氣候變化對中國小麥產量的影響
    楊絢1, 湯緒2, 陳葆德3, 田展4, 趙思健5
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3009-3024.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.011
    摘要 ( 409 )   HTML ( 1 )   PDF (874KB) ( 735 )   收藏
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    【目的】利用最新的國際耦合模式比較計劃第五階段(CMIP5)中30個全球大氣-海洋耦合模式(AOGCMs)在典型濃度路徑(RCPs)情景下的氣候預估結果,基于集合模擬的方法評估氣候變化對中國未來小麥產量的影響。【方法】氣候變化對農業的影響評估通常基于未來逐日的氣象資料,然而AOGCMs模擬的逐日數據存在較大的不確定性。利用“虛擬氣候變暖”(PGW)的方法,將CMIP5模式預估的未來氣候變化的信號與當前氣候的逐日站點觀測資料相結合,得到未來氣候預估的逐日數據集合。結合作物過程模型CERES-Wheat,利用集合模擬的方法,以概率的形式量化表述氣候變化對中國小麥產量影響的不確定性。【結果】未來中國冬春小麥代表站在其小麥生育期內的平均氣溫均有升高。預估21世紀末期,冬小麥代表站平均增溫2.7—2.9℃,春小麥代表站平均增溫3.0—3.3℃。RCP8.5情景比RCP2.6情景增溫顯著。預估未來冬、春小麥在其生育期內的降水量普遍增加,并隨著排放量的增長,降水量表現出逐漸增多的趨勢。在僅改變未來氣候變化的條件下,冬、春小麥的灌溉小麥單產相對于1996—2005年普遍減產,并且隨著氣候變化,灌溉小麥的減產概率上升。春小麥代表站在灌溉條件下小麥減產的程度比冬小麥代表站更顯著。預估到21世紀末期,冬小麥代表站在RCP2.6情景下減產2%左右,在RCP4.5情景下減產6%左右,在RCP8.5情景下減產9%左右,減產概率超過85%。預估春小麥代表站在RCP2.6情景下減產5%,在RCP4.5情景下減產8%以上,在RCP8.5情景下減產15%以上,減產概率超過90%。在雨養條件下,冬小麥代表站的小麥單產相較于1996—2005年顯著增產。預估到21世紀末期,冬小麥代表站在RCP2.6情景下增產21%以上,在RCP4.5情景下增產22%以上,在RCP8.5情景下增產25%以上,增產概率超過90%。【結論】利用PGW方法獲得未來氣候預估的逐日數據集合有效的保留了當前氣候的天氣信息,尤其是極端天氣事件的信息。利用集合模擬的方法評估未來氣候在RCP2.6、RCP4.5和RCP8.5情景下對中國小麥單產的影響,表明在灌溉條件下,隨著排放量的增加,氣候變化導致中國小麥單產減產的概率逐漸上升。雨養小麥單產集合的不確定性較灌溉條件大。
    園藝
    秋水仙素對大蒜莖尖試管苗四倍體的誘導
    孔素萍1, 2, 曹齊衛2, 孫敬強2, 劉波2, 徐坤1
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3025-3033.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.012
    摘要 ( 378 )   HTML ( 3 )   PDF (622KB) ( 603 )   收藏
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    【目的】大蒜為無性繁殖作物,難以采用常規育種方法選育新品種,而化學誘變作為種質創制的重要方法之一,在一些作物上獲得了較好的效果。探討秋水仙素對大蒜莖尖組培試管苗多倍體的誘變效應,旨在為創新大蒜種質提供理論依據和技術方法。【方法】選用山東‘蒼山蒲棵’、四川‘正月早’和‘新疆紫皮’3個生態區域的大蒜品種,鱗莖經自然晾干通過休眠后,取鱗芽莖尖為外植體接種到不同處理的培養基上,采用二次飽和-D最優設計方法,研究秋水仙素不同濃度及處理時間對大蒜莖尖試管苗成苗率及染色體加倍率的影響,并建立相關回歸模型;通過對回歸模型進行解析,確定誘變大蒜四倍體的優化方案;采用流式細胞儀檢測幼葉和根尖壓片染色體計數相結合的方法進行染色體倍性鑒定。【結果】利用流式細胞儀檢測的四倍體大蒜植株葉片DNA相對含量是二倍體對照大蒜‘蒼山蒲棵’的2倍;通過染色體計數法鑒定二倍體植株根尖染色體為2n=2x=16,而四倍體植株染色體為2n=4x=32。在秋水仙素處理大蒜莖尖誘變四倍體過程中,隨秋水仙素處理濃度的升高及時間的延長,3個大蒜品種試管苗成苗率均逐漸降低,且處理濃度的影響大于處理時間;品種間成苗率存在顯著差異,以‘正月早’較高,‘新疆紫皮’次之,‘蒼山蒲棵’較低,其處理間平均成苗率分別為48.69%、46.73%和41.83%。秋水仙素對大蒜四倍體的誘變效應以處理濃度大于處理時間,不同大蒜品種對秋水仙素的反應存在顯著差異,雖然‘蒼山蒲棵’、‘正月早’與‘新疆紫皮’的最高四倍體誘導率分別達15.69%、15.69%和23.53%,但大蒜四倍體平均誘導率則以‘正月早’最高,‘蒼山蒲棵’次之,‘新疆紫皮’最低,分別為9.15%、7.84%和6.53%。經計算機模擬尋優,求得的3個大蒜品種試管苗成苗率均超過50%的處理方案為秋水仙素濃度為0.268%—0.694%、處理時間為61.1—113.8 h;3個大蒜品種四倍體誘導率均超過5%的秋水仙素處理濃度和時間分別為0.531%—0.580%和79.8 —112.2 h。【結論】不同大蒜品種對秋水仙素處理濃度和處理時間的反應不同,秋水仙素對大蒜四倍體的誘變效應亦存在顯著差異,但均以處理濃度的影響大于處理時間,且處理濃度與處理時間存在互作效應。3個大蒜品種成苗率超過50%且四倍體率超過5%的秋水仙素處理濃度為0.531%—0.580%、處理時間為79.8—112.2 h。
    野生秋子梨(Pyrus ussuriensis Maxim)果實性狀的遺傳多樣性
    安萌萌1, 王艷廷1, 宋楊2, 冀曉昊1, 劉暢3, 王楠1, 吳玉森1, 劉文1, 4, 曹玉芬2, 馮守千1, 陳學森1
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3034-3043.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.013
    摘要 ( 412 )   HTML ( 1 )   PDF (664KB) ( 580 )   收藏
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    【目的】探討野生秋子梨果實形態、香氣物質及糖酸組分的遺傳變異及遺傳多樣性,為野生秋子梨種質資源的保護與利用提供基本資料。【方法】以遷地保存圃的35個野生秋子梨實生株系的果實為試材,以‘小香水’梨、‘京白’梨和‘南果’梨3個秋子梨栽培品種為對照,測量果實的縱徑、橫徑、果形指數(縱徑/橫徑)及單果重,采用靜態頂空和氣相色譜-質譜聯用、高效液相色譜技術,定性、定量分析果實的糖酸組分和香氣物質。【結果】 野生秋子梨各實生株系果實大小、香氣成分總含量、各類香氣成分種類數及其含量、主要香氣成分分離比率與具體含量、各糖酸組分的含量、總糖以及總酸含量等均存在廣泛的遺傳變異,變異系數均在17%以上,各株系間差異明顯,表現出豐富的遺傳多樣性;進一步與3個栽培品種比較發現,野生秋子梨的果實縱徑、橫徑及單果重均小于3個栽培品種,但果形指數比較接近;野生秋子梨平均每個株系檢測出41種香氣成分,明顯高于栽培品種的平均香氣種類(25種);野生秋子梨平均香氣成分含量為9.44 μg•g-1,顯著高于3個栽培品種的平均含量(5.71 μg•g-1);野生秋子梨與栽培品種相比,含有酸類和烴衍生物類2類特有化合物,含有酯類等9類111種特有成分;野生秋子梨與3個栽培品種共檢測出16種特征香氣,其中1-己醇和己醛等8種化合物為野生秋子梨與3個栽培品種共有的特征香氣,乙酸己酯和乙酸戊酯等8種特征香氣為野生秋子梨特有;35個野生秋子梨實生株系和栽培品種中幾乎均能檢測出果糖、葡萄糖和蔗糖等3種糖組分以及蘋果酸、酒石酸和檸檬酸等6種酸組分,且均以果糖和蘋果酸含量最高;野生秋子梨中酒石酸及蔗糖含量明顯高于栽培品種,其他糖酸組分、總糖及總酸含量最大值均高于3個栽培品種。【結論】野生秋子梨在果實形態、糖酸組分及香氣成分上存在廣泛的遺傳變異,參試的35個實生株系間差異明顯,遺傳多樣性極為豐富,并且含有酸類和烴衍生物類2類特有化合物和111種特有成分,進一步挖掘利用的潛力巨大。
    貯藏·保鮮·加工
    甘薯淀粉加工廢渣制備復合寡糖的條件優化及其活性評價
    董向艷1, 李靜梅2, 石波1, 彭晴1, 喬宇1, OjokohEromosele1, 張迷敏1
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3044-3057.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.014
    摘要 ( 325 )   HTML ( 1 )   PDF (661KB) ( 372 )   收藏
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    【目的】探索商品化β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶共同水解甘薯淀粉加工廢渣(簡稱甘薯渣)制備復合寡糖的最佳條件,并利用復合寡糖誘導大豆生成大豆抗毒素,為復合寡糖的工業化生產及應用提供科學依據。【方法】分別用商品化β-葡聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶水解甘薯渣,以溫度、pH、底物濃度、酶添加量和反應時間為條件開展單因素試驗,利用TLC和HPLC對酶解產物進行測定,分別以纖維二糖得率、果膠二糖和果膠三糖總得率為指標得到單因素試驗的最佳條件,再通過復合酶共同水解甘薯渣制備復合寡糖,并對纖維寡糖、果膠寡糖以及復合寡糖這3種寡糖產物進行誘導大豆抗毒素活性評價。【結果】纖維寡糖制備的單因素試驗結果表明,當溫度40℃、pH3.5、底物濃度1%、β-葡聚糖酶添加量6.9×103 U•g-1甘薯渣膳食纖維、反應時間7 h時酶解效果最好,寡糖產物以纖維二糖為主,纖維二糖得率為100.6 mg•g-1(纖維二糖質量/甘薯渣膳食纖維質量),纖維二糖轉化率為22.37%(纖維二糖質量/甘薯渣膳食纖維中纖維素質量)。果膠寡糖制備的單因素試驗結果表明,當溫度40℃、pH2.5、底物濃度1%、多聚半乳糖醛酸酶添加量1.42×104 U•g-1甘薯渣膳食纖維、反應時間4 h時酶解效果最好,寡糖產物以果膠二糖和果膠三糖為主,果膠二糖和果膠三糖總得率為17.43 mg•g-1(果膠二糖與果膠三糖的總質量/甘薯渣膳食纖維質量),果膠二糖和果膠三糖總轉化率為29.9%(果膠二糖與果膠三糖的總質量/甘薯渣膳食纖維中果膠質量)。根據上述單因素試驗結果優化復合寡糖制備條件,在溫度40℃、pH2.5、底物濃度1%、β-葡聚糖酶添加量6.9×103 U•g-1甘薯渣膳食纖維、多聚半乳糖醛酸酶添加量1.42×104 U•g-1甘薯渣膳食纖維、反應7 h時,復合寡糖產物中以纖維二糖、果膠二糖和果膠三糖為主,纖維二糖得率為136.97 mg•g-1,纖維二糖轉化率為33.57%;果膠二糖和果膠三糖的總得率為25.96 mg•g-1,果膠二糖和果膠三糖總轉化率為44.53%,與單一寡糖制備結果相比均有明顯提高。利用甘薯復合寡糖作為外源誘導劑誘導大豆生成大豆抗毒素,當復合寡糖濃度為1%,大豆在無菌水中浸泡5 h,誘導溫度25℃、濕度50%、黑暗中培養4 d時,大豆抗毒素生成量達到最高,為1.21 mg•g-1干豆重。而在相同條件下纖維寡糖和果膠寡糖誘導得到的大豆抗毒素生成量分別為0.80和0.46 mg•g-1干豆重。結果表明,甘薯復合寡糖對大豆抗毒素的誘導效果優于單一寡糖。【結論】甘薯渣成本低廉,可作為制備復合寡糖的優良原料,試驗得到制備復合寡糖的最佳工藝條件,以其制備的復合寡糖對大豆抗毒素的生成與積累具有極佳的效果。
    N-乙酰胞壁質酶缺失對保加利亞乳桿菌LJJ自溶及形態的影響
    崔文明, 逄曉陽, 張書文, 劉鷺, 李紅娟, 呂加平
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3058-3068.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.015
    摘要 ( 307 )   HTML ( 1 )   PDF (684KB) ( 475 )   收藏
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    【目的】乳酸菌自溶在發酵乳制品生產中廣泛存在,自溶的速率和程度可以對產品的質量、風味、生產周期產生重要影響,在整個發酵過程中非常重要。N-乙酰胞壁質酶作為肽聚糖水解酶中的重要組成,可以破壞細胞壁完整性,在乳酸菌自溶過程中發揮著重要作用。論文旨在研究N-乙酰胞壁質酶缺失對保加利亞乳桿菌自溶的影響及對其形態的影響。【方法】分別以保加利亞乳桿菌基因組和pMG36e載體為參考序列設計引物,PCR分別擴增保加利亞乳桿菌中N-乙酰胞壁質酶的上下游同源臂基因m-up, m-down和pMG36e中的紅霉素抗性基因。上述基因經過測序驗證后,將經Kpn Ι,Xba Ι雙酶切的紅霉素抗性基因和pUC19相連接形成重組載體pUC:Emr并進行驗證。隨后,將經Kpn Ι,Sac Ι雙酶切的m-down和重組載體pUC:Emr相連接形成重組載體pUC:Emr:m-down并進行驗證。最后,將經Pst Ι,Xba Ι雙酶切的 m-up與重組載體pUC:Emr:m-down相連接形成重組載體pUC:m-up:Emr:m-down并進行驗證。以重組載體pUC:m-up:Emr:m-down作為N-乙酰胞壁質酶的同源重組敲除組件, 在電轉化條件電壓1.5 kV,電阻400 Ω和電容25 μF下,電轉入保加利亞乳桿菌,在含有紅霉素的MRS瓊脂平板上篩選N-乙酰胞壁質酶基因敲除突變菌株并進行PCR驗證。采用核酸溶出法檢測基因缺失菌株與野生型菌株間的自溶度變化。掃描電子顯微鏡觀察基因缺失菌株與野生型菌株間的形態變化。【結果】構建得到在N-乙酰胞壁質酶中間插入紅霉素抗性基因為篩選標記的敲除組件用于保加利亞乳桿菌中N-乙酰胞壁質酶的基因敲除。獲得帶有紅霉素抗性基因的N-乙酰胞壁質酶缺失的保加利亞乳桿菌突變菌株。突變菌株相比野生型菌株自溶特性及形態均發生顯著變化,其中自溶度顯著降低,37℃下自溶24 h,野生型菌株的自溶度約為73%,而突變菌株的自溶度約為35%,自溶度降為原來的1/2。野生型菌株的單個菌體細胞長度約10 μm,突變菌株的單個菌體細胞約30—40 μm,相比野生型菌株約增長了3—4倍。【結論】N-乙酰胞壁質酶在保加利亞乳桿菌自溶與細胞分裂過程中起著重要作用。保加利亞乳桿菌中N-乙酰胞壁質酶的缺失會導致菌體自溶的降低和菌體增殖過程中的細胞分裂受阻,產生菌體長度增長約3—4倍的菌體細胞。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    綿羊RARG基因在發情不同階段卵巢中的mRNA表達
    王維民, 胡庭溪, 李發弟, 馬友記, 樊紅櫻, 潘香羽
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3069-3076.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.016
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    【目的】分離鑒定綿羊視黃酸受體-γ(Retinoic acid receptor gamma,RARG)基因,分析該基因的分子特征,研究其在發情周期不同階段卵巢中的表達差異。【方法】選取年齡和體況相近、健康的甘肅高山細毛羊周歲母羊8只,通過同期發情處理,根據卵巢生理狀態,將其分為兩組:黃體期組和卵泡期組,各4只,屠宰后,采集卵巢組織,以周歲母羊卵巢組織RNA為模板,采用RT-PCR技術擴增綿羊RARG基因并克隆到pMD18-T載體中進行測序驗證。利用ORF Finder和DNAStar等生物信息學軟件分析綿羊RARG基因的理化性質、同源性和預測結構域和功能。利用Q-PCR技術,檢測綿羊RARG基因在母羊發情周期不同階段卵巢組織中的相對表達量,用SPSS19.0軟件進行差異顯著性分析,探討RARG基因對綿羊發情周期的調控機制。【結果】獲得了綿羊RARG基因包含完整編碼區序列在內的1 588 bp的綿羊RARG基因序列,并提交至NCBI,GenBank登錄號為KF019682。該序列含有1個1 377 bp的完整開放閱讀框(Open reading frame,ORF),編碼458個氨基酸,其蛋白分子質量為50 955.8 D,理論等電點為7.45。綿羊RARG基因與牛、普通狨、家犬、倉鼠、家貓、人、小鼠、虎鯨、狒、家鼠、野豬、海牛、海豚和蟾蜍等14個物種的同源性分析,結果顯示RARG基因在上述物種間高度保守,且與牛的親緣關系較近,序列同源性最高。GO功能分析結果顯示,綿羊RARG基因作為結構蛋白參與轉錄調控的幾率最高,分別為0.272和0.223。在綿羊RARG基因編碼的氨基酸序列上發現了2個功能結構域,分別是核激素受體c4鋅指結構域(c4 zinc finger in nuclear hormone receptors,ZnF_C4)和 激素受體配體結構域(ligand binding domain of hormone receptors,HOLI)。Q-PCR結果顯示,綿羊RARG mRNA 在甘肅高山細毛羊卵泡期卵巢中的相對表達量顯著高于黃體期(P<0.05)。【結論】綿羊RARG基因在物種間高度保守,含有ZnF_C4和HOLI等2個與轉錄調控相關的功能結構域,推測該基因可能作為一種重要的轉錄因子參與母羊發情周期調控。
    豆狀帶絳蟲TPO18基因的原核表達及保護性分析
    韓進歡, 茍惠天, 尚清炎, 孫曉林
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3077-3084.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.017
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    【目的】明確重組蛋白 pGEX-TPO18 的免疫保護效果。【方法】提取豆狀帶絳蟲六鉤蚴 RNA,根據帶科其他種屬絳蟲 18 kD 基因的保守區設計引物,5′端分別引入EcoR I、Xho I限制性酶切位點,RT-PCR 擴增,產物克隆于 pMD18-T中進行序列測定,并對序列進行生物信息學分析。將純化后的 PCR 產物和質粒 pGEX-4T-1 分別用 EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切,回收目的片段,連接后轉化至 E.coli BL21感受態細胞,挑斑搖菌,通過 PCR 方法和重組質粒測序技術進行鑒定,將鑒定正確的重組表達質粒命名為 pGEX-TPO18。用 IPTG 誘導表達重組質粒,收集菌體進行 SDS-PAGE 分析,用 GST 瓊脂糖樹脂純化 TPO18 蛋白,進行 Western blottting 檢測。將純化后的重組蛋白分別乳化弗氏佐劑、206 佐劑、氫氧化鋁佐劑后免疫家兔,每次 50 μg/只,共免疫 3 次,末次免疫后 34 d 每只家兔感染 1 500 個蟲卵,感染 58 d 后撲殺并計算各免疫組減囊率。免疫前后每隔 7 d 采血分離血清,ELISA 法檢測血清抗體水平,以 40 µg•mL-1重組蛋白包被酶標板,血清 1﹕200 稀釋,檢測血清樣品的 OD492nm 值。【結果】TPO18 基因的 RT-PCR 擴增產物為 339 bp, 與預期大小相符;測序結果表明無堿基突變,重組質粒pGEX-TPO18構建成功。pGEX-TPO18 在大腸桿菌中獲得高效表達,表達產物為 38.6 kD 的可溶性蛋白,Western blotting分析結果顯示兔抗豆狀囊尾蚴陽性血清與重組蛋白在38.6 kD處有一條明顯的反應條帶,表明該重組蛋白具有反應原性。經ELISA檢測,免疫后7 d 免疫組家兔抗體水平開始升高,第43 天達到峰值。經口感染蟲卵后,免疫組抗體水平開始降低,但仍保持一定水平。家兔免疫保護試驗表明弗氏佐劑、206 佐劑和氫氧化鋁佐劑免疫組減囊率分別為 79.13%、65.66% 和 50.43%。【結論】研究表明弗氏佐劑免疫效果較好,有望研制出抗豆狀囊尾蚴病的高效疫苗。
    家蠶免疫負調控分子BmFAF的功能
    馬曉娟, 李亞明, 胡翠美, 王菲, 夏慶友
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3085-3093.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.018
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    【目的】在細胞和個體水平上探討家蠶BmFAF的免疫負調控功能,為研究昆蟲免疫穩態提供參考。【方法】通過RT-PCR技術克隆BmFAF并進行結構域預測和分析;利用熒光定量PCR檢測BmFAF在家蠶各齡期以及5齡第3天幼蟲的各組織中的時空表達特征和家蠶感染細菌后的免疫誘導表達特征;構建BmFAF的細胞表達載體以及合成用于RNAi的dsRNA,通過質粒或dsRNA的轉染在BmE細胞中過表達BmFAF或降低BmFAF的表達水平,并利用Western blotting或定量PCR予以確認,同時檢測抗菌肽基因表達水平的變化;通過注射dsRNA在個體中降低BmFAF的表達水平,并檢測BmFAF對抗菌肽基因表達水平和家蠶感染細菌后存活率的影響。【結果】BmFAF與其他物種FAF家族成員有較高的同源性,與人類HsUBXD8、HsFAF1和果蠅DmCaspar分別具有60%、42%和47%的相似性,并具有保守的UBX結構域。時空表達特征分析表明,除生殖腺外,BmFAF在免疫組織中表達量略高于其他組織,眠蠶期表達量顯著高于起蠶期,尤其在2齡和3齡眠蠶中的表達量最高;5齡時BmFAF的表達量普遍較低,而從5齡發育至預蛹期時,BmFAF的表達水平有所上升。免疫誘導表達譜顯示,家蠶在注射感染黑胸敗血芽孢桿菌或黏質沙雷氏菌0.5 h后,脂肪體中BmFAF的表達水平即顯著下降,且在12 h內沒有恢復,而抗菌肽BmCecropinA1的表達則持續上升,并在12 h時達到最高。在BmE細胞中過表達BmFAF,抗菌肽BmCecropinA1、BmAttacin和BmMoricin的表達水平與轉染對照質粒的細胞中的抗菌肽相比,均顯著降低。在細胞中轉染dsRNA后,BmFAF的表達水平被有效地降低50%—60%,抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin的表達水平與對照相比均顯著升高。對5齡第2天家蠶幼蟲注射dsRNA,24 h后通過熒光定量PCR檢測到BmFAF的表達水平在注射dsFAF的家蠶中下降至注射dsEGFP對照中的45%;而抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin、BmAttacin的表達水平均被顯著上調。這些家蠶通過注射感染黏質沙雷氏菌24 h后,死亡率即低于對照組,在感染72 h后仍有40%左右的家蠶存活,而對照組中則無家蠶存活。【結論】結構分析、表達特征以及細胞和個體水平上的功能研究表明,BmFAF是一個具有免疫負調控作用的分子,通過抑制抗菌肽的表達維持家蠶免疫穩態, 而降低BmFAF的表達水平則導致抗菌肽表達水平升高,從而有助于減緩甚至避免家蠶在感染細菌后的死亡。
    研究簡報
    擬南芥PMRP的表達特性及功能分析
    張昊, 由詩東, 高靜, 張海麗, 李生輝, 邢繼紅, 王鳳茹, 董金皋
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3094-3102.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.019
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    【目的】分析擬南芥中功能未知基因PMRP(putative membrane related protein)的表達特性;明確PMRP在調控擬南芥生長發育過程中的作用。【方法】利用生物信息學方法,尋找擬南芥中與PMRP含相同結構域的基因,并繪制進化樹;利用Real-time PCR技術分析PMRP在生長8和21 d的擬南芥根、莖中的相對表達量,比較生長21 d的擬南芥第1、2、3、4對蓮座葉及莖生葉中PMRP的表達情況,分析花器官的萼片、花瓣和雄蕊及生長后期擬南芥種子中PMRP的表達量的高低;構建35S::PMRP過表達載體,轉化Columbia野生型擬南芥,通過RT-PCR技術驗證PMRP的表達量,獲得過表達PMRP的轉基因植株;通過對過表達PMRP的轉基因擬南芥的表型觀察,分析PMRP對擬南芥葉片發生、莖的生長部位等的調控作用;通過對過表達PMRP轉基因擬南芥莖稈橫切面的石蠟切片觀察,分析PMRP在莖稈維管束木質部和韌皮部分化過程的作用;通過對花器官的解剖學觀察,明確PMRP對擬南芥花器官生長發育的影響;通過對過表達PMRP轉基因擬南芥果莢形成的觀察,分析PMRP對擬南芥育性的影響。【結果】PMRP是一個含有START保守域的411個氨基酸的蛋白質,具有跨膜結構域,在擬南芥中含有START結構的基因共35個;Real-time PCR結果表明,PMRP在莖生葉中表達量最高(相對表達量約為2 935)、蓮座葉中次之,且蓮座葉生長時間越長,PMRP的表達量越多(PMRP在第1、2、3、4對蓮座葉中的相對表達量分別約為1 650、1 113、734、507),然后是花器官中的萼片(PMRP相對表達量約為937),PMRP在莖、根、種子中都有的表達,但相對表達量都低于270;PMRP在花器官中雄蕊的相對表達量最低(約為64),遠遠低于同屬花器官的萼片中PMRP表達量(937),PMRP在根、莖中的表達量隨生長時間的增加而增加,PMRP在8和21 d的根中相對表達量分別為154和222,PMRP在8和21 d的莖中相對表達量分別為200和264;過表達PMRP轉基因擬南芥表現為在枝條上產生蓮座葉,莖稈容易倒伏,維管束沒有明顯的形成層,且木質部和韌皮部排列紊亂,花器官中雄蕊的花絲變短,形成的角果數量減少,育性降低。【結論】START結構域在功能上極度保守;PMRP在擬南芥不同組織器官均有表達,且隨著時間的延長,PMRP的表達量也增加,但在花器官的雄蕊表達最低,一旦過表達PMRP,擬南芥花器官的雄蕊發育異常,造成育性降低;PMRP對擬南芥的葉片發生、莖稈維管束分化和花器官發育具有重要作用。
    蘋果褐斑病潛育動態
    雍道敬, 李保華, 張延安, 王彩霞, 董向麗, 郭長飛
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3103-3111.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.020
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    【目的】褐斑病是導致蘋果早期落葉的主要病害。研究旨在通過調查褐斑病的流行規律,為制定綜合防治方案提供理論依據。【方法】2011和2012年,將褐斑病菌(Diplocarpon mali)分生孢子懸浮液分4—6次噴霧接種于富士蘋果各齡期的葉片,接種后觀測記錄每個接種葉片第1個病斑出現的時間,每3 d觀測一次,依此計算褐斑病在富士葉片上的平均潛育期、最短潛育期和顯癥歷期。接種期間用全自動氣象站,每30 min記錄接種蘋果樹附近的氣溫、降雨量和相對濕度。【結果】蘋果褐斑病在富士蘋果葉片上的平均潛育期23.8 d;最短潛育期為8—20 d,平均為13.6 d;顯癥歷期為12—54 d,平均為31.3 d。在顯癥歷期內,不同的時期顯癥病斑數不同。6、7月份接種葉片比8月份接種葉片的最短潛育期和顯癥歷期長。防雨棚內培育葉片的最短潛育期和顯癥歷期長于自然條件下培育的葉片的最短潛育期和顯癥歷期。蘋果褐斑病在基部老齡葉片上潛育期短,在代謝旺盛的梢部葉片上潛育期長。蘋果生長前期(6、7月份)接種葉片的潛育期顯著的長于生長后期(8、9月份)接種葉片的潛育期。【結論】蘋果褐斑病的顯癥是一個動態的過程,其潛育時間和顯癥歷期都相對較長。除取決于病原與寄主的組合外,蘋果褐斑病潛育時間和顯癥歷期的長短主要受葉片齡期、衰老程度和生理狀態,即葉片抗病性的影響。6—9月份是蘋果褐斑病的主要發病期,在此期間氣溫對褐斑病潛育期的影響不大,而降雨和高濕能促進病斑顯癥。在褐斑病菌侵染后的15 d,甚至20 d內,使用內吸治療性殺菌劑能抑制絕大部分潛育期病斑發病。
    玫瑰與月季種間雜交障礙原因分析
    于曉艷1, 邢樹堂2, 趙蘭勇1
    中國農業科學. 2014, 47(15):  3112-3120.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.021
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    【目的】探明玫瑰(Rosa rugosa)與月季(Rosa hybrid)種間雜交障礙原因,為提高觀賞玫瑰育種效率提供理論依據。【方法】以牟平野生玫瑰(MP)、‘唐紅’玫瑰,以及月季品種‘塞爾維亞’和‘紅帽子’為試材,統計分析種間雜交(MPב塞爾維亞’、MPב紅帽子’)和品種間雜交(MPב唐紅’)的田間坐果率、每果種子數、種子縱徑、有胚率、萌發率和成苗率;采用熒光顯微法觀察花粉管在花柱中的生長狀況;利用常規石蠟切片觀察受精及胚胎發育狀況。【結果】(1)MPב塞爾維亞’種間雜交坐果率和每果種子數均顯著低于品種間雜交,MPב紅帽子’種間雜交則未結籽。(2)MPב塞爾維亞’種間雜交種子大小不一,76.67%的小種子縱徑僅(0.24±0.07)cm,無胚、胚乳,不萌發;23.33%的大種子縱徑達(0.61±0.05)cm,有胚、胚乳,萌發率和成苗率顯著低于品種間雜交。(3)授粉后2 h,種間雜交花粉和品種間雜交花粉均已在柱頭上大量萌發,但種間雜交花粉管頂端卻大量沉積胼胝質;授粉后20—24 h,品種間雜交花粉管進入子房,但全部MPב紅帽子’花粉管和多數MPב塞爾維亞’花粉管卻于花柱1/2處停止生長;品種間雜交花柱通道細胞及間隙中無明顯胼胝質沉積,但種間雜交花柱通道細胞及間隙中卻大量沉積胼胝質。(4)少量MPב塞爾維亞’花粉管能夠進入子房,并完成受精。但79.42%的雜種胚在授粉15 d左右的心形胚階段敗育,20.58%的雜種胚仍能繼續發育。【結論】(1)MPב紅帽子’為受精前障礙,MPב塞爾維亞’為受精前后雙重障礙;(2)受精前障礙主要由花粉管在花柱1/2處停止生長而導致,可能與花粉管頂端和花柱通道細胞及間隙中大量沉積的胼胝質有關;(3)受精后障礙主要由雜種胚在心形胚階段敗育而造成。
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