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當期目錄

    2014年 第47卷 第17期 刊出日期:2014-09-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    不同雜種優勢群玉米籽粒灌漿速率分析
    張冬梅,劉洋,趙永鋒,祝麗英,黃亞群,郭晉杰,陳景堂
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3323-3335.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.001
    摘要 ( 344 )   HTML ( 1 )   PDF (635KB) ( 704 )   收藏
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    【目的】研究不同雜種優勢群玉米自交系籽粒灌漿速率的特性,篩選灌漿速率快的自交系,為高產玉米雜交種的選育提供借鑒。【方法】采用烘干法測定173份玉米自交系在授粉后10、20、30和40 d籽粒灌漿速率以及6個相關性狀。應用SAS軟件對灌漿速率在年際、自交系、取樣時間、重復、年際×自交系、自交系×取樣時間、年際×自交系×取樣時間進行聯合方差分析。應用SPSS軟件對灌漿速率及其相關性狀如10、20、30和40 d苞葉的含水率、苞葉數、40 d穗軸含水率、穗軸長、穗軸粗及40 d籽粒含水率進行相關分析。利用均勻覆蓋玉米全基因組的210對SSR標記對試驗材料進行全基因組掃描,通過Structure V2.3.4軟件分析其群體結構。對不同雜種優勢群平均籽粒灌漿速率進行方差分析,并篩選出各個群中籽粒灌漿速率快的自交系。【結果】表型分析結果表明,在P=0.01水平上,籽粒灌漿速率在不同年際、自交系、取樣時間、自交系×取樣時間、年際×自交系×取樣時間上存在極顯著差異,而重復、年際×自交系間差異不顯著。通過對不同自交系籽粒灌漿速率與其相關性狀間相關分析,發現10 d籽粒的灌漿速率與20 d的灌漿速率在0.01水平上達到了極顯著的正相關(0.515),與40 d的灌漿速率和籽粒的含水率在0.01水平上達到了極顯著的負相關(-0.198,-0.228);20 d的籽粒灌漿速率只與40 d籽粒含水率在0.05水平上達到了顯著的負相關;在授粉后30和40 d,籽粒的灌漿速率與40 d穗軸的含水率、穗軸粗以及40 d籽粒的含水率、30和40 d苞葉含水率在0.01水平上達到了極顯著正相關,30 d籽粒的灌漿速率與10 d苞葉含水率達到了顯著正相關;40 d籽粒的灌漿速率與20 d苞葉的含水率達到了顯著地正相關。群體結構分析表明,參試自交系分成P、旅大紅骨、瑞德、蘭卡斯特和塘四平頭5個雜種優勢群。蘭卡斯特和塘四平頭群在0.05水平上沒有顯著差異;瑞德、P群和旅大紅骨群間同樣不存在顯著差異(P=0.05);而蘭卡斯特、塘四平頭群與瑞德、P群、旅大紅骨群間則存在顯著差異。對各群內自交系間進行多重比較,各群內自交系間灌漿速率在0.05水平上差異均不顯著。試驗共篩選到33個灌漿速率高于0.8 g•100 grain-1•d-1的自交系,其中瑞德群有13個,P群、旅大紅骨、蘭卡斯特、塘四平頭群分別有9、6、3、2個自交系。【結論】不同玉米自交系籽粒灌漿速率存在較大差異,雜種優勢群間的灌漿速率變化節奏不同,P群、旅大紅骨、瑞德的表現快-快-慢的節奏,蘭卡斯特、塘四平頭的表現快-慢-慢的節奏。
    高粱胚乳細胞與母體組織發育關系的研究
    李棟梁,荊彥平,李小剛,顧蘊潔,王忠
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3336-3347.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.002
    摘要 ( 308 )   HTML ( 1 )   PDF (2169KB) ( 650 )   收藏
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    【目的】探明高粱穎果發育過程中胚乳細胞與母體組織發育關系及其胞內淀粉體的發育特性。【方法】通過掛牌和記號筆點穎相結合的方法對供試高粱品種KS-304花后發育天數進行精確標記,詳細跟蹤觀測了穎果的生長;采取Spurr樹脂包埋、番紅-甲基紫復染法制作半薄切片,光鏡下詳細觀察了高粱穎果發育各過程中胚乳各部位以及種皮果皮結構的變化差異與聯系;采用掃描電鏡研究發育中后期及成熟時穎果斷面不同部位細胞內淀粉體的形態;應用冰凍切片,熒光顯微鏡觀察了成熟穎果橫斷面的結構。【結果】穎果發育分形成期、乳熟期、蠟熟期與完熟期,內胚乳發育分為游離核期、細胞化期、分化期、發育期及成熟期;其中穎果發育形成期與胚乳發育的前3個時期相對應,乳熟期對應發育期,而蠟熟期與完熟期對應胚乳的成熟期。穎果發育早期,珠心組織存留時間較長,珠心表皮細胞約在花后15 d消失。花后7 d,表層胚乳細胞開始積累脂質體,11 d時轉為糊粉層細胞,成熟時糊粉層為1層,其細胞內除常規糊粉粒圓球體外,還含有少量單粒淀粉體,粒徑約3 μm。亞糊粉層細胞位于糊粉層細胞與內胚乳細胞之間,兼糊粉層與內胚乳細胞特點,貯藏大量蛋白體,細胞內淀粉體構成復雜。內胚乳發育存在區域差異,中央近胚處的細胞物質積累滯后于周緣胚乳細胞,成熟時,前者淀粉體充實較為疏松,發育為粉質胚乳,后者充實緊密,淀粉體彼此受到擠壓呈多面體,最終發育為角質胚乳。高粱胚乳細胞內存在于不同于其他谷物穎果胚乳淀粉體的“發生中心”結構,主要表現為淀粉粒在管狀質體內生長,隨著體積的增長,后期與“發生中心”分離而形成新的淀粉體。果皮發育前期增厚,中后期呈緩慢減薄的趨勢,中果皮發育后期細胞內觀察到淀粉體存在特殊的二次增長,構成從前期復粒淀粉體為主轉為單粒;“種皮”來源于珠心、珠被細胞依次降解后的胞壁殘留堆疊而成,中間含有透明角質層。【結論】白高粱KS-304胚乳發育與玉米穎果胚乳類似,最終形成角質與粉質胚乳;穎果胚乳淀粉體發育存在獨特的“發生中心”;中果皮發育后期其細胞可能行使積累同化產物“庫”的作用。
    苧麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因的克隆及其轉基因煙草特性
    鄭建樹,喻春明,陳平,王延周,譚龍濤,陳繼康,朱濤濤,盧凌霄,朱娟娟,段葉輝,熊和平
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3348-3358.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.003
    摘要 ( 312 )   HTML ( 1 )   PDF (753KB) ( 695 )   收藏
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    【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分別構建其超量表達載體,并探討其在轉基因煙草中對氮代謝的影響。【方法】依據苧麻轉錄組unigenes和RT-PCR技術克隆苧麻BnGS2等位基因,利用內切酶TaqⅠ對目的等位基因在中苧1號自交F1和親本中進行酶切鑒定,并利用生物信息學對基因序列和結構特征進行分析;通過同源重組技術分別構建BnGS2等位基因的超量表達載體,并在農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的介導下,通過葉盤法將超量表達載體轉入煙草中,通過Kan篩選、轉化植株基因組DNA PCR驗證獲得轉基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在轉基因T1植株中的相對表達水平,并測定植株葉片中的GS活性、株高、鮮重、可溶蛋白及總氮含量。【結果】首次從苧麻中克隆了一對GS2等位基因,命名為BnGS2-1和BnGS2-2,等位基因序列全長1 340 bp,含有一個1 293 bp的ORF區,編碼430個氨基酸殘基多肽;等位基因核苷酸序列在11個位點上存在差異,導致編碼的多肽在195、382位點上的氨基酸殘基存在替換現象(BnGS2-1為脯氨酸和天冬酰胺,BnGS2-2為蘇氨酸和絲氨酸);NCBI BLASTP分析表明苧麻BnGS2與Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的親緣關系;構建了能分別超量表達BnGS2-1和BnGS2-2的載體,并獲得能分別超量表達BnGS2-1和BnGS2-2轉基因煙草植株;與野生型煙草植株相比,超量表達BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)都能顯著性提高轉基因植株葉片GS活性、鮮重和可溶性蛋白的含量,株高和總氮含量也有增加,但沒有達到顯著性水平。另外,超量表達不同BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)的轉基因煙草植株,在株高、鮮重、葉片可溶性蛋白及總氮含量上并沒有顯著性差異。【結論】在煙草中分別超量表達來源苧麻的BnGS2等位基因(BnGS2-1或BnGS2-2)均能顯著提高轉基因植株的生物產量和氮利用效率,并且所克隆的2個等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并無顯著差異。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    耕作方式與秸稈還田對冬小麥-夏玉米耗水特性和水分利用效率的影響
    趙亞麗,薛志偉,郭海斌,穆心愿,李潮海
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3359-3371.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.004
    摘要 ( 301 )   HTML ( 2 )   PDF (717KB) ( 1276 )   收藏
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    【目的】黃淮海地區是中國糧食主產區之一,但農業生產中旱澇頻繁發生,同時還存在土壤緊實、耕層變淺和土壤蓄水保墑能力低等問題,嚴重影響了該區的糧食生產。耕作方式和秸稈還田作為農業生產中兩項重要的技術措施,對改善土壤結構、提高土壤蓄水能力和水分利用效率有顯著作用。本文旨在探索耕作方式、秸稈還田以及二者交互對冬小麥-夏玉米耗水特性和水分利用效率的影響,為優化黃淮海地區的土壤耕作方式提供依據。【方法】采用土壤耕作方式與秸稈還田相結合的方法,設置常規耕作+秸稈還田、常規耕作+無秸稈還田、深耕+秸稈還田、深耕+無秸稈還田、深松+秸稈還田、深松+無秸稈還田6個處理,研究耕作方式與秸稈還田對冬小麥-夏玉米一年兩熟農田耗水量、耗水模系數、土壤貯水消耗量、株間蒸發量、籽粒產量和水分利用效率的影響,分析不同耕作方式、秸稈還田以及二者交互對冬小麥-夏玉米耗水特性和水分利用效率的影響。【結果】耕作方式、秸稈還田對土壤容重、農田耗水量、土壤貯水消耗量、株間蒸發量、籽粒產量和水分利用效率均存在顯著或極顯著影響。與常規耕作相比,深耕和深松主要降低了20—40 cm土層的土壤容重,增加了冬小麥、夏玉米和周年總農田耗水量,提高了0—100 cm土層的土壤貯水消耗量,同時降低了休閑期無效農田耗水量。此外,深耕和深松還降低了夏玉米的株間蒸發量,但深耕顯著增加了冬小麥的株間蒸發量,深松則相反。秸稈還田也可以降低土壤容重,提高土壤貯水消耗量,增加冬小麥農田耗水量,降低夏玉米和休閑期農田耗水量,增加冬小麥的株間蒸發量,降低夏玉米的株間蒸發量。與常規耕作相比,深耕和深松處理的周年作物產量分別提高了10.7%和9.8%,周年水分利用效率分別提高了8.8%和6.3%。秸稈還田處理的周年作物產量和水分利用效率分別比秸稈不還田處理提高了6.3%和7.6%。耕作方式與秸稈還田對冬小麥-夏玉米的耗水特性、籽粒產量和水分利用效率存在顯著交互作用。與常規耕作+無秸稈還田處理相比,深耕+秸稈還田和深松+秸稈還田處理的周年農田耗水量分別提高3.3%和2.4%,冬小麥-夏玉米的農田耗水量分別提高了4.2%和3.3%,休閑期的農田耗水量分別降低了7.0%和9.9%,周年作物產量分別提高了18.0%和19.3%,水分利用效率分別提高了15.9%和15.1%。【結論】在幾種耕作模式中,深耕+秸稈還田、深松+秸稈還田的周年作物產量和水分利用效率最高,且二者無顯著性差異,表明深耕或深松結合秸稈還田有利于作物產量和水分利用效率的提高。因此,在本試驗條件下,在秸稈還田的基礎上深松或深耕是黃淮海地區適宜的耕作方式。
    營養液漂浮育苗棉苗根系適應水生環境的機理研究
    張昊,陳金湘,劉海荷,周仲華,王峰
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3372-3381.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.005
    摘要 ( 217 )   HTML ( 1 )   PDF (911KB) ( 586 )   收藏
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    【目的】棉花營養液漂浮育苗是一種新型的育苗技術,但棉花根系對水生環境的適應機理尚不清楚。作者從根系的結構、蛋白質組學以及關鍵基因表達等方面研究棉花根系的適應機理。【方法】以基質育苗為對照,用透射電鏡和光學顯微鏡觀察營養液漂浮育苗不同苗期棉苗主根尖的超微與顯微結構,以蛋白質雙向電泳技術分析營養液漂浮育苗3葉1心期棉苗水生根的蛋白質差異,并用實時熒光定量PCR技術進行營養液漂浮育苗不同苗期棉苗水生根以及3葉1心期棉苗不同部位關鍵基因即乙醇脫氫酶基因與烯醇酶基因的表達驗證。【結果】營養液漂浮育苗棉苗主根中各個時期均出現了通氣組織。漂浮育苗的皮層薄壁細胞體積較小。漂浮育苗棉苗主根的韌皮部生長基本正常,而木質部生長出現弱化,其導管直徑明顯比對照小,導管占中柱的比例也比對照小。1葉1心期,漂浮育苗棉苗主根尖細胞中出現酚類物質。2葉1心期,漂浮育苗的主根尖皮層細胞之間存在明顯的細胞間隙。3葉1心期,漂浮育苗的主根尖中出現淀粉粒。4葉1心期,漂浮育苗棉苗的主根尖中出現含晶細胞,同時,細胞中出現明顯的質壁分離現象。分析漂浮育苗條件下3葉1心期棉苗的水生根與對照根系蛋白質雙向電泳的結果,總計28個差異蛋白被鑒定出來,28個差異蛋白包括20個非冗余蛋白。對這些蛋白進行功能分類,主要涉及新陳代謝、細胞結構、細胞防衛、能量代謝、蛋白質合成、細胞生長等,涉及的主要代謝途徑為:糖酵解、乙醇發酵、三羧酸循環等途徑。營養液漂浮育苗棉苗水生根中的乙醇脫氫酶2a基因從2葉1心期至5葉1心期與對照相比均有顯著差異。水生根中1葉1心期至4葉1心期相對表達量呈上升趨勢,4葉1心期至5葉1心期呈急劇下降趨勢,在3葉1心期漂浮育苗棉苗水生根中的乙醇脫氫酶2a基因相對表達量與漂浮棉苗莖、葉相比有顯著差異。營養液漂浮育苗棉苗水生根中的烯醇酶基因從1葉1心期至4葉1心期的相對表達量比對照均有顯著差異,其相對表達量從1葉1心期至5葉1心期呈逐漸下降的趨勢,在3葉1心期漂浮育苗棉苗水生根中的烯醇酶基因相對表達量與漂浮棉苗莖、葉相比有顯著差異。【結論】在營養液漂浮育苗環境下,棉苗水生根通過根系結構及基因表達的變化來適應水生環境,是棉花對水生環境適應機理。
    植物保護
    蛋白激酶A催化亞基VdPKAC1對菌絲型大麗輪枝菌V07DF2培養性狀及致病力的調控
    鄧晟, 張昕,林玲
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3382-3391.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.006
    摘要 ( 272 )   HTML ( 1 )   PDF (913KB) ( 496 )   收藏
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    【目的】通過同源重組敲除技術,解析菌絲型大麗輪枝菌中蛋白激酶A催化亞基基因VdPKAC1在調控微菌核發育、產孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技術構建VdPKAC1的同源重組敲除質粒。該質粒的潮霉素抗性基因盒兩端分別為靶標基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通過農桿菌AGL-1的介導,將該質粒的T-DNA區域整合到來源于棉花的菌絲型大麗輪枝菌V07DF2菌株中。從6個隨機選擇的含有潮霉素抗性基因片段的轉化子中,通過靶標基因的PCR檢測,獲得了5個VdPKAC1基因敲除突變體。經過Southern雜交檢測,選擇了3個敲除突變體材料(2B5、C5和HH2)進行突變表型的觀察和分析。在液體PDB培養7 d后觀察敲除突變體與野生型菌株的黑色素產生情況;在固體PDA培養28 d后,觀察敲除突變體與野生菌株的菌絲生長和休眠結構形成情況。此外,利用棉花根提取物對液體Cazpek-Dox培養7 d的各菌株分別進行誘導處理,在處理24、72 h后分別統計分生孢子數量,以此對敲除突變體和野生菌株的分生孢子產生能力進行評估。最后,將孢子濃度為1×107個/mL的突變體和野生菌株的分生孢子液灌根接種2葉期的棉花,測定其致病力。【結果】Southern雜交結果表明,在上述5個敲除突變體中,只有2B5和C5兩個菌株為T-DNA單拷貝插入,而其他菌株均存在T-DNA異位整合的情況。在PDA培養條件下,3個敲除突變體(2B5、C5和HH2)與野生型相比具有黑色素合成增加,氣生菌絲更加發達的特點。其中,敲除突變體2B5和C5在平板培養條件下還形成了野生型菌株沒有的、與典型微菌核形態不同的深褐色“鏈狀休眠菌絲體結構”。在棉花根提取物的誘導處理下,3個敲除突變體產生的分生孢子數量少于野生型菌株。另外,致病力分析結果表明,敲除突變體材料仍然具有一定的致病力,但卻顯著弱于野生菌株V07DF2。【結論】在大麗輪枝菌中,通過蛋白激酶A介導的環腺苷酸信號途徑控制多種重要性狀,而VdPKAC1是這一途徑中的重要成員。以前的報道證實,VdPKAC1負調控微菌核的數量,而本研究利用菌絲型菌株V07DF2在PDA培養基上不產生微菌核的這一特性,通過同源重組原理敲除該負調控基因,成功獲得可以在PDA上產生休眠結構的菌絲型大麗輪枝菌菌株的突變體。這些突變體材料將為大麗輪枝菌微菌核發育信號途徑及其調控基因的發掘提供平臺和基礎。
    植物病原真菌對幾類重要單位點殺菌劑的抗藥性分子機制
    詹家綏1;2;吳娥嬌1;2;劉西莉3;陳鳳平1;2
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3392-3404.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.007
    摘要 ( 267 )   HTML ( 2 )   PDF (772KB) ( 1554 )   收藏
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    單位點殺菌劑是植物病害管理的重要組成部分,隨著單位點殺菌劑的大量、廣泛使用,抗性問題也隨之產生。目前為止,有植物病原菌對各大類單位點殺菌劑均具抗性的報道。本文作者主要闡述了生產中常用的5類單位點殺菌劑,包括苯并咪唑類殺菌劑(MBCs)、二甲酰亞胺類殺菌劑(DCFs)、14α-脫甲基酶抑制劑(DMIs)、QoIs和琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHIs)的作用機理及抗性分子機制的研究進展,并進一步論述了抗藥性產生的機理及抗性治理原則。MBCs作用于β-微管蛋白,抗性主要與靶標蛋白基因的點突變有關,突變造成的氨基酸變化多集中于第50、167、198、200和240等5個位置,主要突變位點為第198位,同一菌株通常只發生一個氨基酸變異,不同位點的點突變甚至同一位點的不同氨基酸替代均會引起抗性水平的差異;DCFs的作用靶標尚不清楚,病原真菌對其抗性可能與雙元組氨酸激酶OS基因的點突變有關;DMIs通過抑制14α-脫甲基酶最終影響麥角甾醇的合成,抗性主要與Cyp51的點突變或過量表達或運輸體的過量表達相關,Cyp51點突變是抗DMI的主要機制,同一突變對不同的三唑類殺菌劑敏感性表現不盡相同,不同位置的點突變在同一病原菌中對不同三唑類殺菌劑的敏感性影響也不同。點突變數量在不同的真菌中表現不同,有單個發生,也有多個同時發生,且對抗藥性具有積累效應;QoIs作用于電子傳遞鏈的復合物III,抗性主要與Cytb的點突變有關,與抗性相關的點突變主要發生在Cytb的120—155和255—280兩個編碼區,其中G143A和F129L為最主要的點突變;SDHIs作用于電子傳遞鏈的復合物II,抗性主要與SdhB、SdhC或SdhD的點突變有關,大部分病原真菌對SDHIs的抗性與SdhB點突變有關,SdhB點突變發生位置比較單一,在多種病原菌中突變均發生在相同的組氨酸上即H272, 而SdhC和SdhD突變位點比較多。
    基于微流控芯片電泳的番茄黃化曲葉病毒快速檢測
    余明芬1;2;曾洪梅2;鐘潤濤3;趙小明3;邱德文1;2
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3405-3413.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.008
    摘要 ( 246 )   HTML ( 1 )   PDF (656KB) ( 546 )   收藏
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    【目的】探索微流控芯片電泳方法在PCR產物檢測方面的效果,并建立針對番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的微流控芯片電泳檢測方法,彌補瓊脂糖凝膠電泳方法在試劑消耗、所用時間、安全性方面的缺陷。【方法】通過對TYLCV的基因組進行分析后,在該基因組中相對穩定的位置設計引物,同時兼顧引用已被研究者研究過的引物,對這些選擇的引物進行特異性、穩定性、靈敏度等方面的驗證,篩選出用于后續試驗的引物。選擇DNA標準物φX174/BsuR I(Hae Ⅲ) marker,分別進行瓊脂糖凝膠電泳和微流控芯片電泳,對二者在耗材、耗時和靈敏度方面進行比較,確定微流控芯片電泳在核酸檢測方面的應用價值。利用篩選出的其中1對引物對番茄葉片的實際樣品進行PCR擴增,隨后通過微流控芯片電泳對其進行檢測,以此探討微流控芯片電泳在病毒檢測方面的檢測效果。【結果】共篩選出14對TYLCV備用引物,其中2對引自文獻,12對為本文設計,每對引物均可滿足微流控芯片檢測要求。選擇其中1對引物TYLCV-T作為隨后的研究對象。利用瓊脂糖凝膠電泳和微流控芯片電泳對DNA標準物檢測,結果表明微流控芯片電泳在耗時方面不足瓊脂糖凝膠電泳的1/10,約為13 min,試劑消耗為瓊脂糖凝膠電泳的1/8,檢測靈敏度方面至少比瓊脂糖凝膠電泳高103倍,根據DNA標準物原液濃度計算可知,微流控芯片電泳至少可準確檢測到濃度為5×10-6 μg?μL-1的核酸樣品。利用微流控芯片電泳對TYLCV-T擴增的TYLCV PCR產物進行檢測,將檢測峰值圖與DNA標準物的峰值圖時間比較,就可判斷出產物峰的大小范圍。【結論】篩選出的關于TYLCV的備用引物可作為進一步研究微流控芯片技術在該病毒檢測方面的基礎;通過將瓊脂糖凝膠電泳和微流控芯片電泳進行比較,確立了后者在核酸檢測方面的應用價值;通過微流控芯片電泳對TYLCV PCR產物的檢測,建立了基于微流控芯片電泳的TYLCV快速檢測方法,為TYLCV的快速檢測提供新的技術支持。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    中國水稻產量和氮素吸收量對高效氮肥響應的整合分析
    苑俊麗,梁新強,李亮,葉玉適,傅朝棟,宋清川
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3414-3423.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.009
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    【目的】運用整合分析方法(meta-analysis),首次在大尺度范圍定量研究高效氮肥施用對中國水稻產量和氮素吸收量的影響,以評估高效氮肥施用的經濟效益并為高效氮肥在中國推廣使用提供科學依據。【方法】通過搜集整理國內外48篇文獻的大田試驗數據資料,建立水稻產量和氮素吸收量數據庫,進而應用整合分析方法,比較分析高效氮肥施用對中國水稻產量和氮素吸收量的整體影響及高效氮肥的有利施用條件。【結果】與施用常規化肥相比,高效氮肥施用使中國水稻產量和氮素吸收量分別增加了7.5%(95%置信區間:6.7%—8.4%)和10.5%(95%置信區間:9.5%—11.4%)。分析其影響因素,發現在堿性土壤(pH≥7.5)施用高效氮肥使水稻產量和氮素吸收量分別提高了約10.5%和18.8%,其效果好于在酸性(pH≤6.5)和中性(pH 6.5—7.5)土壤上施用;包膜緩/控釋氮肥較穩定性氮肥有效,尤其在氮素吸收量方面,硝化抑制劑與常規氮肥相比沒有影響,而包膜緩/控釋氮肥則使氮素吸收量提高17.9%;高效氮肥僅作為基肥一次性施入土壤使水稻產量和氮素吸收量較分次施入土壤分別提高了4.2%和7.5%,同時可以考慮將高效氮肥與常規肥料混合施用,既節省費用,又可以取得同樣的增產效果;當施氮總量為120—180 kg•hm-2時,高效氮肥的增效作用最為明顯,分別使水稻產量和氮素吸收量提高6.5%和12.1%;就地域分布而言,在中國北方施用高效氮肥可以取得更好的效果,使水稻產量和氮素吸收量較南方施用高效氮肥分別提高了3.4%和3.0%。【結論】在中國稻田中(尤其是堿性土壤)施用高效氮肥,尤其是包膜緩/控釋氮肥(作為基肥一次性施入土壤),且控制施氮總量在120—180 kg•hm-2時,對提高水稻產量和氮素吸收量效果較好。在中國稻田中,硝化抑制劑,尤其是3,4-二甲基吡唑磷酸鹽對提高水稻氮素吸收量效果不佳;高效氮肥在中國稻田中的施用受水稻種植方式(直播或移栽)以及高效氮肥施肥方式(僅施高效氮肥或者與常規肥料混合施用)的影響較小;在中國北方施用高效氮肥效果可能更佳。
    長期施肥對植煙土壤養分及微生物群落結構的影響
    陳丹梅1;段玉琪2;楊宇虹2;晉艷2;黃建國1;袁玲1
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3424-3433.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.010
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    【目的】了解施肥與土壤培肥和作物真菌病害的關系,為烤煙科學施肥、保持農業生產的長期可持續發展積累資料。【方法】利用云南省煙草農業科學研究院的長期肥料定位試驗,設置長期不施肥(CK)、純施化肥(CF)和有機無機肥配施(MCF)等處理,采用常規分析方法測定磷脂脂肪酸(PLFAs)和454高通量測序技術,分別就施肥對植煙土壤有機質、養分和微生物群落結構的影響進行分析。【結果】經16年長期施肥后,MCF使土壤有機質提高19.63%,有效磷增加;CF降低土壤有機質20.56%,堿解氮和有效鉀減少。施肥顯著增加微生物標記性磷脂脂肪酸(PLFAs)的種類和總量,尤以MCF最為顯著,說明施肥尤其是MCF顯著提高了土壤中微生物種群和數量。但是,在CF處理的土壤中,異養性微生物??真菌的PLFAs占微生物總量的比例是MCF的2.52倍,真菌種群數(OTUs)比MCF提高25.91%,真菌群落的多樣性、均勻度和優勢度指數也顯著高于CK和MCF,說明施用化肥改變了土壤生態環境,有益于真菌生長繁殖,使真菌種群增加,密度增大,優勢種群突出,導致土壤真菌化。土壤真菌群落由子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、壺菌門和尚待鑒定的真菌等構成,子囊菌門占絕大多數。前20種優勢菌株的豐富度高達33.01%—49.28%,其中CK和MCF有15種相同,CK和CF僅6種一致。【結論】長期持續施用化肥可提高作物真菌病害的發生幾率,降低土壤有機質;土壤特性是影響真菌種群的重要因素之一,MCF對土壤優勢真菌的影響較小,而CF顯著改變了土壤真菌的種群結構。
    基于水稻根伸長的不同土壤中鎘(Cd)毒性閾值(ECx)及預測模型
    宋文恩,陳世寶
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3434-3443.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.011
    摘要 ( 277 )   HTML ( 1 )   PDF (565KB) ( 541 )   收藏
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    【目的】雖然土壤中鎘(Cd)污染對水稻的生態風險受關注已久,然而大量研究集中在基于稻米中Cd限量標準的健康風險研究,而針對土壤中Cd污染的生態風險閾值研究較少。研究通過ISO11269-1根伸長毒性測試方法,測定不同性質土壤中Cd對水稻的毒性閾值(ECx,x=10,50)及其預測模型,以期為基于生態毒理效應的中國土壤Cd污染基準值的修訂提供參考。【方法】采用中國8種不同性質農田土壤和3種不同Cd敏感性差異的水稻品種(T優167,T167;陸兩優28,L28;湘早45,X45)為試材,每種土壤添加7個Cd濃度,通過ISO11269-1根伸長測試方法,測量水稻根的相對伸長量,并結合Log-Logistic分布函數模型測定不同土壤中水稻Cd毒性的劑量-效應關系、毒性閾值(ECx, x=10, 50)及其預測模型。【結果】隨著土壤Cd濃度的增加,不同土壤中水稻的相對根長(%)逐漸減小,基于根伸長的Cd對水稻毒性的10%抑制濃度的毒性閾值(EC10)和半抑制濃度(EC50)值在不同土壤和不同Cd敏感性水稻品種間有較大差異。總體而言,在3種不同Cd敏感性(T167>L28>X45)水稻品種中,同一土壤中Cd的水稻毒性ECx(x=10,50)隨著水稻對Cd脅迫的敏感性增強而降低;就單一品種水稻而言,不同土壤的Cd水稻毒性閾值ECx間有顯著差異。其中,以Cd敏感性水稻品種T167測試的不同土壤EC10變化為1.40—5.25 mg•kg-1,最大相差275.0%,EC50變化為17.83—46.93 mg•kg-1,最大相差163.2%;以Cd非敏感性水稻品種X45測試的不同土壤EC10變化為1.72—8.22 mg•kg-1,最大相差377.9%,EC50變化為26.96—68.16 mg•kg-1,最大相差152.8%。通過水稻Cd毒性閾值ECx與土壤性質間的多元回歸分析表明,土壤pH、有機碳(OC)、陽離子交換量(CEC)與水稻Cd毒性閾值間呈正相關關系,基于土壤主要性質的水稻Cd毒性預測模型表明,EC50實測值均在預測值2倍誤差(±S.D)范圍內。【結論】基于ISO11269-1根伸長毒性測試結果表明,不同土壤中Cd的水稻毒性閾值間有顯著差異,土壤pH、OC及CEC與水稻Cd的毒性閾值間呈顯著正相關關系(P<0.05),基于上述土壤性質的預測模型可以很好預測不同土壤中Cd對水稻的毒性;不同Cd敏感性品種對測定土壤中水稻Cd毒性閾值有明顯差異,因此,在制訂土壤中Cd的生態基準時應充分考慮不同物種的敏感性差異特征。
    園藝
    果梅PmKNAT2基因全長cDNA克隆及表達分析
    孫海龍,宋娟,高志紅,倪照君,章鎮
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3444-3452.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.012
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    【目的】從‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并對其結構特征及表達模式進行分析,為研究果梅雌蕊敗育的分子機理和分子育種奠定基礎。【方法】在NCBI中查找與果梅相似性很高的桃KNOPE2(KNAT2的同源基因)序列(EF093491),根據桃的KNOPE2序列設計特異引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽總RNA;通過RT-PCR和RACE技術獲得基因cDNA序列全長;使用DNAMAN軟件進行序列拼接;利用NCBI數據庫中的BLASTn和BLASTp程序進行相似性分析;通過生物信息學方法分析結構特征;用DNAMAN軟件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0軟件進行系統進化樹的構建;利用Bioxm2.6推測分析蛋白分子量和等電點;根據NCBI中Conserved Domains程序進行蛋白質保守域結構預測;用ExPaSy提供的在線SOPMA程序進行蛋白質二級結構預測;構建PJIT166-PmKNAT2-GFP的融合亞細胞定位表達載體,采用基因槍法轉化洋蔥表皮細胞,經暗培養后在激光共聚焦顯微鏡下觀察;利用實時熒光定量RT-PCR研究其表達模式,分析其在‘大嵌蒂’花芽發育不同時期、不同器官中的表達特性。【結果】在‘大嵌蒂’果梅中獲得一個KNAT2的同源基因,命名為PmKNAT2,其cDNA全長為1 402 bp,5'UTR 47 bp,3'UTR 293 bp,編碼區全長為1 062 bp,編碼353個氨基酸,預測蛋白質分子量為40.41 kD,理論等電點為4.85。蛋白結構分析表明該基因編碼的氨基酸具有2個結構域,MEINOX結構域(KNOXⅠ和KNOXⅡ 2個亞結構域)和HD(homomeodomain)結構域,屬于KNOX蛋白;相似性分析發現該基因與GenBank中其它來源的KNOX蛋白序列的相似性為50%—100%;系統進化樹分析顯示果梅PmKNAT2與桃KNOX聚為一類,表明與其親緣關系最近。二級結構預測結果表明PmKNAT2所編碼蛋白由47.14%的α-螺旋(Alpha helix)、3.43%的β-轉角(Beta turn)、3.14的β-折疊(Extended strand )和46.29%的隨機卷曲(Random coil)組成。亞細胞定位結果顯示該基因編碼的蛋白定位于細胞核和細胞膜中。實時熒光定量RT-PCR分析表明,在‘大嵌蒂’果梅不同時期花芽中PmKNAT2的表達量存在一定差異,PmKNAT2在11月份的表達量最高,9月、10月和11月的表達量差異不明顯,但與12月和1月花芽中的表達量差異明顯;生長素在1月份含量最高,9、10、11月份差異不明顯,其含量變化趨勢與PmKNAT2表達趨勢相反。對該基因表達量最高的11月份的花芽進行實時熒光定量分析發現:PmKNAT2在各種花芽中均有表達,在不完全花(雌蕊褐色、雌蕊畸形和無雌蕊)中的表達量高于完全花(雌蕊正常)。進一步分析PmKNAT2在完全花與不完全花的不同花器官中的表達量,結果表明PmKNAT2在完全花與不完全花的各部位的表達量趨勢相似均為:萼片>雄蕊>花瓣,在完全花雌蕊中的表達量最低。【結論】推測PmKNAT2在雌蕊發育階段的異常表達可能與‘大嵌蒂’果梅雌蕊敗育有關。
    獼猴桃果實發育過程中淀粉積累差異及其糖代謝特性
    張慧琴1;2;謝鳴2;張琛2;楊魯瓊2;章鎮1;肖金平2;周利秋2
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3453-3464.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.013
    摘要 ( 275 )   HTML ( 1 )   PDF (591KB) ( 791 )   收藏
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    【目的】探討高、低淀粉積累型獼猴桃果實發育過程中淀粉積累差異、糖代謝特性及與相關酶活性的關系,為提高獼猴桃果實糖含量和風味等關鍵品質提供理論依據。【方法】以高淀粉積累型品種‘紅陽’和低淀粉積累型品種‘華特’為試材,測定果實發育過程中的相對生長速率、碳水化合物(淀粉、葡萄糖、果糖和蔗糖)含量、干物質含量以及碳水化合物代謝相關酶活性的變化。【結果】果實碳水化合物含量與果實生長速率呈負相關,其含量隨淀粉積累而不斷增加;淀粉含量與果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖含量及干物質含量均呈正相關,當達峰值時,其在‘華特’和‘紅陽’果實碳水化合物含量中所占比例分別為87.1%和84.1%。‘紅陽’果實淀粉積累增速快、峰值高、時間長,其淀粉積累平均速率為0.685 mg•g-1FW•d-1,淀粉積累峰值為70.78 mg•g-1FW,分別是‘華特’的1.34倍和1.69倍,且其淀粉積累時間比‘華特’長21 d。‘華特’果實淀粉在采前已急劇下降,至采收時幾乎都轉化為可溶性糖;而‘紅陽’果實淀粉含量仍直線增長,并在采前維持在一個較高水平。‘華特’果實的中性轉化酶(NI)和酸性轉化酶(AI)活性始終顯著高于‘紅陽’,而后者的蔗糖磷酸合成酶(SPS)和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性一直明顯強于前者。‘紅陽’和‘華特’的果實淀粉含量與AGPase和SPS活性的相關性最強,而與NI和AI活性呈較強負相關。NI活性與AI活性呈顯著正相關,而與AGPase、SPS、蔗糖合成酶(SS)、果糖激酶(FK)、葡萄糖激酶(GK)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)等酶活性均呈負相關;‘紅陽’果實中的AGPase活性與SPS、SS、FK、GK、UGPase等酶活性均呈顯著正相關。【結論】獼猴桃果實碳水化合物積累以淀粉為主,AGPase是影響淀粉積累的關鍵酶,NI、AI和SPS活性的差異可能是造成果實淀粉積累高低、干物質多少、可溶性糖組分及含量不同的重要原因。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    液體飼料pH值對荷斯坦公犢血氣指標的調控
    屠焰1;邱國梁2;周懌3;云強1;齊東1;王家杰4;刁其玉1
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3465-3474.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.014
    摘要 ( 230 )   HTML ( 3 )   PDF (643KB) ( 604 )   收藏
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    【目的】哺乳期犢牛胃腸道功能尚未健全,對日糧的消化能力不足,易導致腹瀉等營養性疾病的發生,降低成活率。實施早期斷奶的哺乳期犢牛日糧以液體的代乳品為主,其酸度對犢牛健康有著比成年牛更加重要的影響,但目前犢牛血氣指標變化的規律、正常值范圍等數據仍不成體系,無法判別日糧酸度是否適宜。本研究以48頭新生荷斯坦公犢牛研究液體飼料pH值對哺乳期犢牛血氣指標的影響,探索犢牛血氣指標的變化規律。【方法】采用2×4因子設計,2種代乳品,其植物蛋白占總蛋白比例分別為50%和80%,代乳品乳液pH值分別調整為6.2、5.5、5.0、4.5,共計8個處理組。將48頭新生荷斯坦公犢隨機分配到上述8個組中,分別飼喂上述代乳品乳液。試驗期63 d,其中預試期21d,正試期42 d。每兩周測定犢牛體重,每日記錄代乳品和顆粒料的采食量;在21、49 d抽取全血檢測血液pH值、二氧化碳分壓(pCO2)、氧氣分壓(pO2)、氧飽和度(SO2)、[HCO3-]濃度(HCO3-)、實際剩余堿量(ABE)、總二氧化碳量(TCO2)、標準碳酸氫鹽濃度(SBC)和標準剩余堿(SBE)。采用SAS軟件GLM或MIXED模型對生長性能或血氣指標進行統計分析,以REG模型建立血氣指標與代乳品乳液pH值之間的相關關系式,以正態分布檢驗血氣指標的變化。【結果】降低代乳品乳液pH值可提高犢牛平均日增重(P<0.05);代乳品乳液pH值對犢牛血液pO2、SO2、HCO3-、ABE、TCO2、SBC和SBE皆有極顯著的影響(P<0.01),對血液pH值、pCO2也具有影響趨勢;隨著代乳品乳液pH值的降低,犢牛血液pH值、pCO2、pO2、SO2、HCO3-、TCO2呈現出二次曲線變化規律(P<0.05),R2分別達到0.9201、0.8481、0.8600、0.9445、0.8631、0.8141,ABE、SBC和SBE則呈現出直線型改變(P<0.05),R2分別為0.9060、0.8126、0.8298。血液pH值和pCO2隨日齡變化有顯著改變(P<0.05);除HCO3-、ABE、SBE外,其他血氣指標符合正態分布規律(P>0.05)。代乳品中植物蛋白占總蛋白的比例由50%提高到80%時,犢牛平均日增重和干物質采食量降低,但血氣指標并未受到影響(P>0.05)。 【結論】隨代乳品乳液pH值的降低,21—63 d犢牛血液HCO3-、ABE、TCO2、SBC、SBE顯著降低,可作為評價日糧酸度效果的敏感指標。
    HSPA2在牦牛不同組織器官中的表達差異
    溫澤星,余四九,翟羽佳,楊琨,劉鵬剛,何俊峰,崔燕
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3475-3482.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.015
    摘要 ( 256 )   HTML ( 1 )   PDF (878KB) ( 659 )   收藏
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    【目的】探索熱休克蛋白70-2(heat shock 70kD protein-2, HSPA2)在牦牛不同組織器官中的表達差異。【方法】選取 3 頭 1 歲齡的健康青海高原雄性牦牛為研究對象,在正常生理條件下,于 2013 年 9 月中旬采集不同組織器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦和睪丸)樣本。(1)從牦牛不同組織器官中提取 RNA,將 RNA 反轉錄成第一鏈 cDNA,參照牦牛 HSPA2 和β-actin 基因序列(登錄號為 KC790105.1和 DQ838049.1)設計特異性引物,首先采用 RT-PCR 來驗證實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)是否能應用于牦牛不同組織器官中 HSPA2表達差異的測定;然后采用 RT-qPCR 測定牦牛不同組織器官中 HSPA2相對表達量的差異。(2)將牦牛不同組織器官樣本 4%多聚甲醛固定,制成石蠟切片,免疫組織化學法測定 HSPA2 在不同組織器官中的分布。采用 Image-Pro Plus 6.0 軟件進行免疫組化圖像分析,測定 HSPA2 陽性反應物的積分光密度,進行吸光度分析;通過 SPSS 19.0 統計軟件,用單因素方差分析進行差異顯著性測定。【結果】(1) RT-PCR 結果表明 RT-qPCR 法可用于牦牛不同組織器官中 HSPA2表達差異的測定。實時熒光定量 PCR 結果表明,HSPA2在睪丸中的相對表達量,分別是在腦、腎臟、心臟、脾臟、肺臟和肝臟中的 83.33、97.09、111.11、133.33、222.22和 285.71倍。(2)免疫組織化學結果顯示,牦牛睪丸、腎臟、腦、心臟、肺臟、肝臟和脾臟中均有 HSPA2 的陽性表達。其中,在牦牛腎臟皮質腎小管、髓質腎小管,大腦皮質海馬CA1區、小腦皮質,心肌細胞,肺泡上皮細胞,肝細胞,脾臟邊緣區和紅髓中有 HSPA2 陽性反應,著色深淺不等,大部分陽性反應位于細胞質,細胞核陽性反應極少;而在睪丸曲精小管中生精細胞細胞質和細胞核中均有 HSPA2 陽性反應,著色深淺不等;陰性對照組未觀察到陽性反應。根據積分光密度值比較得出,HSPA2 蛋白的陽性表達量在睪丸中最高,腦、腎臟、心臟、肺臟和肝臟次之,脾臟最少。【結論】通過基因水平和蛋白水平兩個層面的研究,發現 HSPA2 在牦牛各組織器官中存在表達差異;睪丸中 HSPA2 基因和蛋白表達量均高于腦、腎臟、心臟、脾臟、肺臟和肝臟,提示 HSPA2 可能與睪丸的生殖功能密切相關。
    沙門氏菌和聚肌胞處理條件下雞免疫相關候選基因mRNA表達特性
    孫艷,李建超,李鵬,鄭麥青,劉冉冉,李慶賀,文杰,趙桂蘋
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3483-3491.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.016
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    【目的】利用高密度SNP芯片完成了對北京油雞血清免疫球蛋白Y含量等9個免疫性狀的關聯分析,篩選得到了與性狀顯著關聯位點和候選基因。基于該研究結果,以集中分布在16號染色體的候選基因CD1b、 BMA1(B locus M alpha chain 1)、TRIM27(tripartite motif-containing 27)和ZNF692(zinc finger protein 692)作為研究對象,以北京油雞為實驗材料,在聚肌胞(Polyinosinic acid-polycytidylic acid, Poly I:C)和細菌的處理下進一步對候選基因表達特性進行分析和鑒定。【方法】隨機選取80只12日齡北京油雞分為3組:空白對照組、聚肌胞處理組和腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis, SE)處理組,分別飼養在獨立的隔離器內。兩處理組分別胸肌注射聚肌胞注射液和SE菌液,對照組注射生理鹽水,于處理后12 h、24 h、3 d和6 d(days post infection, DPI)檢測血清炎癥因子的變化水平和候選基因表達規律。【結果】經過聚肌胞和SE處理后,體重在24 h之后顯著低于空白組(P<0.05),體溫24 h以內顯著升高;血清IFN-α、IL-4和IL-6水平先升高后降低,在第24小時或第3天達到峰值,TNF-α水平持續升高,3 d后極顯著高于空白組(P<0.01)。兩種處理條件下CD1b的mRNA表達沒有組織特異性,其他3個基因在胸腺和法氏囊中高表達。在胸腺組織中,CD1b在兩處理間12和24 h的表達量存在顯著差異(P<0.01),在聚肌胞處理組整個感染階段沒有顯著性變化,在SE組是先升高后降低的趨勢,感染后24 h時表達量最高(P<0.01);BMA1在12 h和3 d時兩處理組間差異顯著,聚肌胞處理組在12 h時表達量低于SE處理組,而在3 d時顯著高于SE處理組(P<0.01);TRIM27在聚肌胞感染6 d時表達量顯著高于空白組(P<0.05),ZNF692的表達量在3組間沒有差異。在法氏囊中,CD1b表達量在兩個處理組中存在差異,在SE組12 h時表達量高;BMA1和TRIM27的表達量在兩組間沒有差異,TRIM27在3 d時表達量最高(P<0.01),ZNF692在SE組感染24 h時相對表達量高于聚肌胞處理組,在兩組中都在3 d時表達最高。【結論】CD1b、BMA1、TRIM27和ZNF692參與了聚肌胞和腸炎沙門氏菌引起的免疫反應過程,是與免疫相關的功能基因;CD1b主要在腸炎沙門氏菌感染的前期發揮作用;BMA1和ZNF692分別參與胸腺和法氏囊的免疫反應。
    研究簡報
    基于PCR技術的谷子分子標記遺傳圖譜構建
    王智蘭,王軍,袁峰,杜曉芬,楊慧卿,郭二虎
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3492-3500.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.017
    摘要 ( 242 )   HTML ( 1 )   PDF (550KB) ( 754 )   收藏
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    【目的】構建一張基于PCR技術的谷子分子標記遺傳圖譜。【方法】以谷子高146A和K103雜交自交F2分離群體為作圖群體,以分布于谷子9條染色體上的81個SSR標記為主要參考標記,采用來自谷子、水稻、珍珠粟和高羊茅的SSR、STS、SNP、SV和ACGM標記共1 733個,在親本間篩選多態性標記,并進一步在F2群體間進行驗證,利用MAPMAKER VERSION 3.0軟件進行連鎖分析,采用MapDraw V2軟件繪制遺傳連鎖圖譜。【結果】構建了一張包含192個不同類型分子標記的谷子遺傳圖譜,新定位標記33個,其中32個來自谷子,另1個來自珍珠粟。遺傳圖譜包含9個連鎖群,覆蓋基因組全長2 082.5 cM,連鎖群長度介于119.5—475.2 cM,平均長度231.39 cM,標記間平均距離10.85 cM,每個連鎖群上的標記數介于10—37個。部分連鎖群上標記存在偏分離現象,在定位的192個標記中,共有36個標記發生偏分離,占圖譜總標記的18.75%,其中,在LG2、LG6和LG7上分別聚集分布了10、15和7個偏分離標記,出現了偏分離熱點區域,而在LG1、LG4、LG5和LG8上僅有零星分布,LG3和LG9上則沒有偏分離標記。對來自不同作物的分子標記在谷子上的可轉移性分析發現,來自谷子的1 235個PCR標記中有205個標記在雙親及其F2群體間有多態性,多態率為16.60%,而來自珍珠粟、高羊茅和水稻的498個PCR標記,在該群體上僅發現1個多態性標記。【結論】利用不同物種中的分子標記構建了一張覆蓋基因組長度為2 082.5 cM的谷子遺傳連鎖圖譜,其分子標記主要來自于谷子。
    擬南芥液泡分揀蛋白AtVPS25調控植物生長素響應的功能分析
    郭萌萌1;2;3;陳明2;劉榮榜2;馬有志2;李連成2;徐兆師2;張小紅1;3
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3501-3512.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.018
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    【目的】鑒定生長素脅迫條件下純合突變體vps25的表型,獲得擬南芥液泡分選蛋白AtVPS25的互作蛋白,并分析AtVPS25和其互作蛋白在生長素響應過程中的功能及其分子機制。【方法】根據“三引物法”鑒定突變體;通過觀察擬南芥vps25突變體在外加生長素的培養基上的表型,鑒定AtVPS25的功能;以AtVPS25為誘餌蛋白,采用泛素分離系統篩選在擬南芥中與其互作的蛋白;利用酵母互作試驗和雙分子熒光互補試驗(BiFC)驗證AtVPS25與AtAIR12(for Auxin-Induced in Root cultures)的互作關系;鑒定AtVPS25和AtAIR12蛋白在植物細胞中的定位情況;采用Real-time PCR方法,分析在生長素處理條件下,部分生長素運輸相關基因在擬南芥vps25突變體中的表達變化。【結果】Real-time PCR結果顯示,10 μmol•L-1 IAA處理條件下,在野生型擬南芥(WT)中,AtVPS25的表達量隨著脅迫時間的增長而增高,并在12 h達到最高,約為0 h的40倍,證明AtVPS25受生長素處理的誘導表達。利用泛素分離系統篩庫獲得AtVPS25的互作蛋白AtAIR12、AtVPS25與AtAIR12全長蛋白序列的酵母雙雜交試驗證明AtVPS25與AtAIR12互作。亞細胞定位試驗證明AtVPS25定位在細胞膜和細胞質中,AtAIR12定位在細胞膜及葉綠體膜上。BiFC(雙分子熒光互補)試驗結果顯示,AtVPS25蛋白與AtAIR12蛋白互作,并且互作位點在細胞膜和細胞質中。突變體鑒定獲得純合突變體vps25。vps25在0.1 mg•L-1 IAA條件下生長,表現為主根伸長受到抑制,并且相對同一條件下的WT的主根長度差異極顯著(P<0.01),而同時側根數無明顯差異,這與已報道的air12-1突變體在生長素處理條件下的表型相似。10 μmol•L-1 IAA處理時,在WT背景條件下,AtAIR12的表達量對IAA響應明顯,并且隨著脅迫時間的增長而增高,在12 h時達到最高,約為0 h的80倍,證明10 μmol•L-1 IAA處理條件下,WT中AtAIR12表達量的變化趨勢與AtVPS25完全相同。同時在vps25突變體背景條件下,AtAIR12的表達相對于WT受到抑制,在0-24 h表達量無明顯變化。此外,在vps25突變體背景條件下,生長素輸出載體基因AtPIN2相對于WT中表達量降低,生長素輸入載體基因AtLAX2相對于WT中表達量提高。【結論】擬南芥液泡分揀蛋白基因AtVPS25受IAA誘導表達,參與調控植物主根的發育,AtVPS25可以與生長素響應蛋白AtAIR12在細胞質和細胞膜上互作,AtVPS25調控部分生長素相關基因的表達,AtVPS25通過調控這些下游基因的表達影響生長素在根部的響應。AtVPS25與AtAIR12的調控機制需要進一步深入研究。
    黃瓜倍性材料創制及染色體組成的FISH鑒定
    管葦,張云霞,楊樹瓊,陳勁楓,婁群峰
    中國農業科學. 2014, 47(17):  3513-3522.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.019
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    【目的】黃瓜(Cucumis sativus L.)遺傳基礎狹窄,種質資源多樣性較為有限,遺傳育種研究相對落后。本試驗旨在創制整倍體和非整倍體黃瓜種質材料,建立其準確的染色體組成鑒定方法,為進一步選育黃瓜各種染色體系、目標性狀的染色體定位及遺傳育種研究奠定基礎。【方法】以華北生態型黃瓜‘長春密刺’的高代自交系為材料,0.4%秋水仙素溶液處理萌動種子,誘導染色體數目加倍。為獲得同源三倍體材料,以誘導獲得的同源四倍體為母本,二倍體為父本進行雜交,授粉35—45 d后采收成熟果實進行胚拯救。采用染色體計數,結合形態學、葉片氣孔電鏡觀察,對誘導株及雜交后代的倍性進行鑒定。利用染色體特異的探針進行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH),通過觀察特異探針在染色體上雜交信號的數目、強弱及位置,結合黃瓜的染色體形態參數,對誘導株的染色體組成進行鑒定。【結果】對經秋水仙素處理的‘長春密刺’材料進行有絲分裂中期染色體計數觀察,結果顯示誘導獲得8株四倍體(2n=28),3株非整倍體(2n=16,19,27)材料。將四倍體與二倍體雜交獲得了三倍體材料(2n=21)。經熒光原位雜交分析,根據黃瓜著絲粒探針Type III和核糖體45S rDNA兩類信號在染色體上的信號特征可以看出,與二倍體相比,三倍體與四倍體上雜交信號為倍性變化關系,進一步驗證創制出的整倍性材料為三倍體與四倍體。不同倍性‘長春密刺’植株的形態學特征存在一定差異,四倍體植株的形態指標與二倍體差異顯著;三倍體植株與二倍體在形態學上差異不顯著;非整倍體植株與二倍體在形態學上差異也不顯著,但其長勢較二倍體弱,且花期推遲,雌雄花花期不遇,坐果率明顯低于二倍體。經葉片氣孔電鏡觀察,‘長春密刺’二倍體、三倍體與四倍體植株葉片氣孔的大小與密度均存在差異,隨著倍性提高,氣孔的長度和寬度增加,而氣孔密度則下降,說明形態學篩選和葉片氣孔電鏡觀察可以作為鑒定黃瓜倍性的輔助方法。以上述兩類黃瓜重復序列(Type III和45S rDNA)和染色體特異的單拷貝基因Csa006700為探針,對染色體數目為16的一株非整倍體誘導株進行染色體組成鑒定。重復序列的熒光原位雜交結果顯示,額外的兩條染色體為1號或2號染色體。進一步利用黃瓜2號染色體端部的基因Csa006700探針檢測,發現該基因只在其中一對染色體上有信號,由此明確該材料為附加兩條1號染色體的四體材料(2n=14+2)。研究表明秋水仙素不僅可直接誘導出同源多倍體,同時可誘導各種非整倍體植株。【結論】利用秋水仙素處理黃瓜萌動種子,誘導染色體倍性的變化,結合染色體特異探針的熒光原位雜交鑒定,可快速創制并篩選出各種染色體組成的特異新種質。
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