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當期目錄

    2015年 第48卷 第2期 刊出日期:2015-01-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    黃淮麥區部分小麥種質脂肪氧化酶活性分析及等位基因檢測
    吳培培,宋雙,張福彥,陳鋒,崔黨群
    中國農業科學. 2015, 48(2):  207-214.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.01
    摘要 ( 396 )   HTML ( 1 )   PDF (482KB) ( 634 )   收藏
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    【目的】小麥中的脂肪氧化酶(LOX)是影響小麥面粉顏色和其儲藏特性的主要因素之一,對中國黃淮麥區的306份小麥種質資源進行脂肪氧化酶活性分析及等位基因檢測,為小麥品質育種提供理論參考。【方法】利用紫外分光光度計和酶標儀測定參試樣品的脂肪氧化酶(LOX)活性,并利用控制脂肪氧化酶活性的位于1AL上的QLpx.caas-1AL位點緊密連鎖的分子標記Xwmc312以及位于4BS上的TaLOX-B1位點的功能標記LOX16LOX18,采用特異引物的PCR擴增技術以及瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術進行參試材料的LOX基因型鑒定。【結果】表型測定結果表明,參試的黃淮麥區小麥品種(系)中脂肪氧化酶活性的平均值為65.73 AU·min-1·g-1,標準差為13.54,變幅為27.09—99.55 AU·min-1·g-1,變異系數為20.6%。參試材料中小于40 AU·min-1·g-1和大于90 AU·min-1·g-1的小麥品種(系)分別為7個和8個,可作為對當前主栽小麥品種進行脂肪氧化酶活性改良的重要資源材料。基因型鑒定結果表明,參試材料的QLpx.caas-1AL位點存在3種等位變異類型,Xwmc312227Xwmc312235Xwmc312247所占比例分別為30.4%、18.9%和50.6%。參試材料的TaLOX-B1位點存在TaLOX-B1aTaLOX-B1b兩種變異類型,所占比例分別為 28.7%和71.2%。分析其基因型組合發現,參試材料中共有6種基因型組合類型,依次為TaLOX-B1a/Xwmc312227TaLOX-B1a/Xwmc312235TaLOX-B1a/Xwmc312247TaLOX-B1b/Xwmc312227TaLOX-B1b/Xwmc312235TaLOX-B1b/Xwmc312247,所占比例分別為7.2%、9.5%、12.1%、23.2%、9.5%和38.6%。分析不同LOX基因型與脂肪氧化酶活性的關系表明,1AL位點上擁有Xwmc312235基因型的小麥品種脂肪氧化酶活性顯著高于其他兩種基因型(P<0.05),4BS位點擁有TaLOX-B1a基因型的小麥品種脂肪氧化酶活性顯著高于擁有TaLOX-B1b基因型的小麥品種(P<0.05)。進一步分析不同LOX基因型組合與脂肪氧化酶活性的關系表明,擁有TaLOX-B1a/Xwmc312235基因型組合的小麥品種脂肪氧化酶活性(76.80 AU·min-1·g-1)顯著高于其他5種基因型組合,而擁有TaLOX-B1b/Xwmc312227基因型組合的小麥品種脂肪氧化酶活性顯著低于其他5種基因型組合,僅為62.44 AU·min-1·g-1。【結論】中國黃淮麥區的小麥品種脂肪氧化酶活性絕大多數處于中間類型,擁有極低(小于40 AU·min-1·g-1)或極高(大于90 AU·min-1·g-1)脂肪氧化酶活性類型的小麥品種所占比例較低。黃淮麥區所發現的6種不同LOX基因型組合中,擁有TaLOX-B1a/Xwmc312235基因型組合的小麥品種脂肪氧化酶活性相對較高(P<0.05),而擁有TaLOX-B1b/Xwmc312227基因型組合的小麥品種脂肪氧化酶活性相對較低(P<0.05)。
    兼抗蟲、除草劑、干旱轉基因玉米的獲得和鑒定
    孫越,劉秀霞,李麗莉,官赟赟,張舉仁
    中國農業科學. 2015, 48(2):  215-228.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.02
    摘要 ( 315 )   HTML ( 3 )   PDF (8695KB) ( 512 )   收藏
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    【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的轉基因復合性狀玉米種質。【方法】通過農桿菌介導的玉米莖尖遺傳轉化法,把重組到同一植物表達載體的cry1AcMepspsGATZmPIS轉入玉米骨干自交系9801和齊319(Q319),獲得轉基因植株。通過逐代除草劑篩選、分子檢測和抗蟲性鑒定,從大量轉基因株系中優選出6個優良玉米株系。在此基礎上,以非轉基因自交系9801、Q319為對照,在嚴格控制條件下對6個轉基因株系進行抗蟲、抗除草劑和抗旱性檢測。由于不同生長時期植株對玉米螟危害的敏感程度有差異,在抗蟲性檢測試驗中,對不同生長階段的轉基因玉米的抗蟲性,分別進行了田間和室內玉米螟接種試驗,并以灌漿期玉米的籽粒和苞葉飼喂玉米螟幼蟲檢測其殺蟲性。在草甘膦抗性鑒定試驗中,對6葉期田間玉米植株噴灑大田除草用量的草甘膦溶液評估其應用價值;采用3倍應用劑量的草甘膦溶液噴施3葉期玉米植株測試其草甘膦耐受力。在抗旱性鑒定試驗中,對10葉期玉米植株進行干旱脅迫處理,觀測轉基因植株的表型變化并測定光合作用和葉綠素熒光等參數。【結果】選擇出6個遺傳穩定的兼抗亞洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的轉基因玉米株系,其中株系L1—L3來自自交系9801,Q1—Q3來自自交系Q319。通過RT-PCR檢測4個轉基因的轉錄強度,證明它們在轉基因植株中有效表達;利用Western blot方法檢測cry1Ac蛋白的表達水平,確定其在玉米植株中穩定表達。植株抗蟲性鑒定結果顯示這6個株系在玉米營養生長期和灌漿期的抗蟲能力均顯著高于未轉基因自交系。在草甘膦抗性測試中,轉基因植株表現出明顯高于未轉基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期間,轉基因植株能維持較強的光合能力和光系統Ⅱ活性,對干旱脅迫的抗性顯著高于對照植株。【結論】將cry1AcMepspsGATZmPIS一同轉入玉米,賦予了植株抗玉米螟、抗除草劑草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,達到生產中應用標準。培育出具有優良復合性狀的轉基因玉米新材料。
    木質素與生物燃料生產:降低含量或解除束縛?
    王曉娟,楊陽,張曉強,姜少俊,宋瑜,周海辰,金樑
    中國農業科學. 2015, 48(2):  229-240.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.03
    摘要 ( 281 )   HTML ( 1 )   PDF (1270KB) ( 852 )   收藏
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    生物質能源作為可再生性替代能源之一,其開發利用可為解決當前全球變暖、化石能源成本飛漲和環境污染等重大問題提供新的途徑。木質纖維素是植物細胞壁的主要組成成分,也是地球上最豐富的可再生資源之一,可轉化為生物酒精等液體生物燃料。木質纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質素,三者之間由酯鍵、醚鍵和糖苷鍵等化學鍵連接,形成的木質素-糖類復合體是一種共價鍵聚合物,這些細胞壁成分的組成及其互作會影響多糖的水解作用,進而影響木質纖維素的轉化利用效率,其中,木質素被認為是阻礙纖維素酶分解的主要物理障礙。當前,提高能源作物生物質的田間種植、生產效率及其工廠化降解、轉化效率是生物質能源發展的熱點和難點問題。由于木質素是木質纖維素生物量中除多糖之外含量最高的成分之一,提高木質素利用效率成為影響整個木質纖維素生物冶煉產能的關鍵。為此,文中從降低木質素含量和解除木質素束縛的角度出發,系統回顧了木質素在植物細胞壁中的發育沉積特征及其遺傳改造研究進展,探究從植物細胞壁結構組成角度優化木質纖維素性狀提高生物燃料產率的可能性,重點論述了降低能源植物木質素含量的遺傳選育和基因改良策略,以及木質纖維素生物冶煉的預處理和分離技術。一方面,通過常規育種程序培育低木質素含量的生物能源作物品種,或是通過基因工程技術下調木質素的生物合成,對于提高木質纖維素利用效率和降低生物燃料生產成本均具有積極的作用。另一方面,以解除木質素束縛為目的的生物冶煉預處理技術是提高木質纖維素生物燃料工廠化生產效率的重要環節,主要包括酸預處理法、堿預處理法和有機溶劑預處理法,高效的預處理技術能夠顯著提高纖維素酶水解效率,增加生物酒精產量。文中最后對木質素與生物燃料生產的研究與應用前景進行了展望。
    耕作栽培·生理生化
    外源四價硒條件下硫對小麥硒吸收的影響機制
    劉新偉,段碧輝,趙小虎,郭再華,胡承孝,趙竹青
    中國農業科學. 2015, 48(2):  241-250.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.04
    摘要 ( 265 )   HTML ( 1 )   PDF (490KB) ( 563 )   收藏
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    【目的】研究硫肥對外源四價硒條件下土壤硒賦存形態和價態變化的影響,旨在揭示硫調控小麥硒吸收的作用機制。【方法】以鄭麥9023為試驗材料,通過苗期土培和水培進行,土培試驗設3個硫水平,分別為0、150和300 mg·kg-1,硫源為硫磺,2個硒水平,分別為0和5 mg·kg-1,硒源為亞硒酸鈉,生長至70 d收獲并取土樣;水培試驗先將幼苗在1/5 Hogland-Arnon營養液中培養2周,然后開始進行處理,設3個硫水平,分別為0、1和2 mmol·L-1,硫源為硫酸鎂,硒水平為10 µmol·L-1,2種硒源,分別為亞硒酸鈉和硒酸鈉,培養24 h后收獲,土培和水培試驗均為完全交互設計,重復4次,采用HG-AFS-8220型雙道原子熒光光度計對小麥地上部和根以及土壤中硒含量進行測定,根據與植物硒吸收的相關性,將土壤總硒分成不同賦存形態和價態。【結果】施用適量硒和硫對小麥生長均有一定的促進作用;150 mg·kg-1硫可以顯著降低小麥地上部和根中硒含量和硒累積量,降幅分別可達61.7 %、34.4%和55.7%、24.7%,但是這種降低不會隨施硫量的增加而顯著變化;施硫可以顯著降低土壤pH值,最高可降低0.50個單位,并增加了土壤有機質含量,最高可增加0.78 g·kg-1。施硫可以顯著降低土壤中水溶態硒含量,并顯著增加鐵錳氧化物結合態硒含量,也增加了有機結合態和殘渣態硒含量,而對交換態硒含量無顯著影響,表明施硫促使了硒在土壤中的鈍化。施硫可以顯著降低水溶態中各種價態硒含量,其降幅基本一致,施硫可以增加交換態中四價硒含量而顯著減少六價硒含量,表明施硫抑制了硒在土壤中向高效價態的轉化。小麥對四價硒和六價硒的吸收差異與是否施硫密切相關,無硫時,六價硒處理下小麥地上部和根中硒含量分別為四價硒處理的44.7和22.4倍,而硫濃度為1 mmol·L-1時,其硒含量迅速降為四價硒處理的2.8倍和51.8%,表明硫可以顯著縮小小麥對四價和六價硒的吸收能力差異。【結論】施用適量硫肥在改善小麥生長的同時,可以通過降低土壤pH和提高有機質含量,促使水溶態硒在土壤中向鐵錳氧化物結合態、有機結合態及殘渣態的鈍化,并抑制交換態中四價硒向六價態的轉化,從而降低小麥對硒的吸收。因此,可以通過在高硒缺硫地區增施硫肥以及缺硒高硫地區減施硫肥來有效調控作物體內的硒含量
    海島棉和陸地棉葉片光合特性、冠層結構及物質生產的差異
    姚賀盛,張亞黎,易小平,薛軍,羅毅,羅宏海,張旺鋒
    中國農業科學. 2015, 48(2):  251-261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.05
    摘要 ( 241 )   HTML ( 2 )   PDF (856KB) ( 547 )   收藏
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    【目的】探討海島棉和陸地棉兩個棉花栽培種群體物質生產存在差異的原因,揭示海島棉和陸地棉產量形成的機理,為選育高光效棉花品種和高產高效栽培提供理論依據。【方法】在新疆氣候生態條件下,選用能適應北疆棉區的海島棉品種(系)(新海22號、H858)和陸地棉主栽品種(新陸早13號、新陸早33號)為試驗材料,分別測定不同棉花品種(系)葉片的葉綠素含量、葉面積指數、冠層開度、葉片向日性運動、群體光合速率和生物量等指標,探討海島棉和陸地棉兩個栽培種間群體冠層結構、葉片光合組分和光合生產特性等的差異。【結果】陸地棉品種冠層上部葉片數量多,葉面積指數大,冠層開度小,上部葉片光截獲量占冠層光截獲總量的比例大,冠層中下部光截獲量少;海島棉品種冠層上部葉片少,葉面積指數小,冠層開度大,截獲的光占冠層光截獲總量的比例小;海島棉品種群體光合速率均比陸地棉高;兩個棉花栽培種光合物質生產能力存在顯著差異,海島棉光合產物總量多,但生殖器官占總光合產物的比例顯著低于陸地棉;海島棉和陸地棉產量構成因子及皮棉產量差異顯著,陸地棉單位面積總鈴數約為1.30×106個/hm2,皮棉產量為3 000—3 500 kg·hm-2,海島棉雖然單位面積鈴數顯著大于陸地棉,達到1.54×106個/hm2左右,但單鈴重遠低于陸地棉,皮棉產量僅1 500 kg·hm-2左右;在棉鈴空間分布上,海島棉棉鈴主要分布在冠層中下部,而陸地棉棉鈴在冠層中上部的分布比例大。【結論】與海島棉相比,陸地棉總光合產物低,但經濟系數高,籽棉產量高,通過改善陸地棉冠層結構,延長群體光合功能期,提高光合產物累積量,有利于陸地棉產量的進一步提高;與陸地棉相比,海島棉冠層光能利用率高,群體光合速率高,光合物質生產潛力大,但單鈴重低,總鈴庫較小,且鈴庫與光合源比例失衡,光合產物轉運效率低,經濟系數小,產量較低。選育大鈴、早熟性好的海島棉品種,并適當增大種植密度,可能是海島棉增產的技術途徑。
    加工型馬鈴薯品種微型薯種薯貯藏期內源激素含量、閾值和休眠期相關性分析
    劉悅善,李成,王東霞,徐剛,王玉萍,程李香,張俊蓮,王蒂,張峰
    中國農業科學. 2015, 48(2):  262-269.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.06
    摘要 ( 254 )   HTML ( 1 )   PDF (414KB) ( 487 )   收藏
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    【目的】加工型馬鈴薯微型薯作為生產高質量脫毒原種用種薯,其休眠持續時間和發芽時間有著重要的經濟意義。探究加工型馬鈴薯微型薯種薯在不同貯藏溫度下,隨著貯藏時間延長,微型薯中內源激素含量與其休眠期的關系,可為加工型馬鈴薯微型薯種薯的高質量貯藏提供理論依據。【方法】采用高效液相色譜(HPLC)法,測定微型薯在3種不同貯藏溫度(4℃、10℃、20℃)下連續貯藏150 d,其內源赤霉素(GA3)、吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)的含量,分析不同貯藏時間和溫度下內源激素含量變化對微型薯休眠解除程度影響,并根據內源激素水平動態變化進行激素與休眠的相關性推導。【結果】在整個貯藏期(150 d)間,隨著貯藏溫度提高,兩個品種夏波蒂和大西洋休眠解除時間顯著縮短,在4℃貯藏150 d后,兩個品種休眠均未完全解除,在10℃和20℃貯藏條件下,大西洋比夏波蒂休眠解除早15 d左右。在整個貯藏期(150 d)間,隨著貯藏時間延長和貯藏溫度提高,GA3含量顯著上升,在10℃貯藏150 d時,大西洋和夏波蒂中GA3含量分別是4℃貯藏條件下的1.7和1.9倍,在20℃貯藏150 d時,大西洋和夏波蒂中GA3含量分別是4℃貯藏條件下的1.9和2.0倍。IAA含量在貯藏后期(90—150 d)顯著上升,在10℃貯藏150 d時,大西洋和夏波蒂中IAA含量分別是4℃貯藏條件下的1.5和1.2倍,在20℃貯藏150 d時,大西洋和夏波蒂中IAA含量分別是4℃貯藏條件下的1.9和1.5倍。ABA含量顯著下降,在4℃貯藏150 d時,大西洋和夏波蒂中ABA含量是10℃貯藏條件下的7.2和6.4倍。在整個貯藏期(150 d)間,(GA3+IAA)/ABA比值顯著提高。對(GA3+IAA)/ABA比值與種薯發芽率相關性分析表明,(GA3+IAA)/ABA比值與種薯發芽率呈極顯著線性正相關。根據(GA3+IAA)/ABA比值與種薯發芽率之間的線性關系推斷出夏波蒂和大西洋休眠解除時,(GA3+IAA)/ABA臨界閾值分別為52.02和48.49。當(GA3+IAA)/ABA比值超過臨界閾值后,微型薯種薯的發芽率超過50%,休眠解除。【結論】微型薯中內源激素GA3、IAA和ABA含量動態平衡變化以及發芽率明顯受貯藏時間和貯藏溫度影響。通過對塊莖內源激素比值和發芽率的相關性分析獲得(GA3+IAA)/ABA臨界閾值計算方法和范圍,為加工型馬鈴薯種薯貯藏精準控制提供了理論依據和技術參數。
    植物保護
    PVYNTN-NW榆林分離物的全基因組序列測定與分析
    高芳鑾,常飛,沈建國,謝聯輝,詹家綏
    中國農業科學. 2015, 48(2):  270-279.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.07
    摘要 ( 384 )   HTML ( 1 )   PDF (1224KB) ( 543 )   收藏
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    【目的】馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是馬鈴薯病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)代表成員,是馬鈴薯和煙草生產中分布最為廣泛并造成嚴重經濟損失的病毒之一。研究旨在揭示PVY榆林分離物ShX14的全基因組特征,并準確判斷其株系分子類型。【方法】根據已經報道的PVY不同基因保守區設計11對簡并引物,采用片段重疊法從感染 PVY的馬鈴薯病葉中擴增、克隆獲得榆林分離物ShX14的全長序列,并對其序列特征、重組位點、系統發育關系等進行分析。同時,應用系統發育與性狀關聯分析(phylogeny-trait association analysis)評估PVY分離物與株系的關聯性。【結果】測序獲得的ShX14分離物核苷酸序列全長為9 724 nt(不含3′端的多聚腺苷酸尾)。該病毒基因組含有一個9 186 nt的開放閱讀框,編碼3 061個氨基酸的多聚蛋白(polyprotein)。在P3順反子中+2相位上也發現由移碼(reading frame shift)產生的PIPO蛋白。全基因組序列比較分析顯示,ShX14分離物與HN2、SYR-NB-16分離物(PVYNTN-NW株系SYR-I型)的核苷酸、氨基酸序列的一致性分別為98%—99%和98%—100%。該分離物的P1、HC-Pro/P3和CP基因的5′端均檢測到顯著的重組信號,重組位點分別位于2 318、5 674 和8 385 nt,與PVYNTN-NW株系(SYR-I型)的重組位點相似。系統發育分析結果顯示該分離物與HN2、SYR-NB-16分離物相聚成簇,表明其在系統發育關系上,與PVYNTN-NW株系(SYR-I 型)的親緣關系最近。系統發育分析與性狀關聯分析結果顯示該分離物與PVYNTN-NW株系(SYR-I 型)的關聯系數(association index, AI)、簡約分值(parsimony score, PS)和最大單系分支(maximum monophyletic clade, MC)3個統計檢驗均顯著,表明其與PVYNTN-NW株系(SYR-I型)存在顯著的關聯性。同時,應用多重RT-PCR成功擴增出約為1 000、600和400 bp的3個特異性片段,與PVYNTN-NW株系(SYR-I型)的特異條帶大小相一致。這些結果也進一步確定該分離物屬于 PVYNTN-NW株系(SYR-I型)。【結論】ShX14 分離物為N×O重組分離物,屬于PVYNTN-NW株系(SYR-I型),為后續深入開展該分離物的生物學等研究奠定了基礎。
    正交設計和均勻設計在優化噻蟲胺懸浮劑物理穩定性上的應用
    李北興,王偉昌,張大俠,王凱,管磊,劉峰
    中國農業科學. 2015, 48(2):  280-292.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.08
    摘要 ( 291 )   HTML ( 1 )   PDF (1215KB) ( 651 )   收藏
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    【目的】比較正交和均勻設計兩種多因素試驗方法在水懸浮劑配方中應用的優缺點,為該方法在農藥制劑學領域的應用提供參考。【方法】在采用流點法初篩得到潤濕性能良好的潤濕分散劑之后,分別采用正交設計和均勻設計制備30%噻蟲胺懸浮劑。綜合考察潤濕分散劑和黏度調節劑對制劑熱貯析水率、離心沉淀率、黏度、流動性、分散性、熱貯前后樣品的粒度分布(D10、D50和D90)和懸浮率的影響。通過主效應圖分析正交試驗結果,采用逐步回歸和偏最小二乘法(PLS)分析均勻試驗結果,最后檢驗優化配方的各項性能。【結果】正交試驗和均勻試驗的所有樣品黏度均在144.50—317.84 mPa·s,均具有良好(良級或優級)的流動性和分散性。由于奧氏熟化作用,樣品經熱貯后,粒子的粒徑輕微增大,D10、D50和D90分別由0.56—1.00、0.88—1.53和1.77—2.68 μm變為0.76—1.02、1.12—1.56和2.07—3.25 μm。所有樣品貯前懸浮率均在91.88%—96.39%,經熱貯后樣品的懸浮率變化不大,分別在91.91%—96.13%,符合懸浮劑質量控制的一般要求,故本研究主要優化了熱貯析水率和離心沉淀率兩個指標。正交試驗分析結果表明,T2700、黃原膠和硅酸鎂鋁的用量對熱貯析水率和離心沉淀率均有顯著影響,且均隨用量增加而降低,而NR1601的用量對兩個因變量的影響不顯著。采用正交設計優化的配方,樣品黏度為229.6 mPa·s,流動性和分散性良好,熱貯前后懸浮率分別為(94.76±0.70)%和(93.50±0.20)%,熱貯析水率為(4.23±0.19)%,離心沉淀率也低于10%。均勻設計中,PLS平方項模型對熱貯析水率有良好的預測性,熱貯析水率為(2.55±0.03)%,離心沉淀率也僅為(4.36±0.21)%,優化樣品的黏度為324.16 mPa·s,流動性和分散性良好,熱貯前后懸浮率分別為(93.19±0.09)%和(92.77±0.22)%,粒子的粒徑小且分布較窄。PLS線性模型對離心沉淀率表現出良好的預測性,優化配方的離心沉淀率為(7.75±0.14)%,熱貯析水率為(5.24±0.19)%。逐步回歸模型對因變量的預測性均較差,優化配方也并非最優配方,熱貯析水率為(9.51±0.20)%,離心沉淀率也高達(16.63±0.19)%。采用雙重篩選逐步回歸和PLS可以同時優化熱貯析水率和離心沉淀率兩個因變量,其中前者優化的模型擬合性比后者好,但其優化配方也并非最優配方。【結論】正交設計試驗次數較多,但數據分析方法簡單易掌握,采用主效應圖結合方差分析即可有效地優化30%噻蟲胺懸浮劑配方。均勻設計的穩健性差于正交設計,但其試驗次數少,可有效降低試驗成本,若能掌握其復雜的統計及分析方法,也可以獲得理想的優化配方。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    秸稈還田對長期連作棉田土壤腐殖質組分含量的影響
    劉軍,景峰,李同花,黃金花,談建鑫,曹晶晶,劉建國
    中國農業科學. 2015, 48(2):  293-302.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.09
    摘要 ( 349 )   HTML ( 1 )   PDF (507KB) ( 853 )   收藏
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    【目的】以棉花長期連作定位試驗田為研究對象,分析秸稈還田條件下長期連作棉田土壤腐殖質組分含量變化特征,為衡量和評價秸稈還田對長期連作棉田土壤質量和肥力的影響提供科學的理論依據。【方法】試驗在石河子大學農學院試驗站棉花長期連作定位試驗田進行。設秸稈還田模式下5、10、15、20、25和30 a棉田連作小區,無秸稈還田模式下1、5、10和15 a連作小區,共計10個處理,每個處理3次重復,小區土壤初始背景值相近。棉花種植品種為“新陸早46號”,按“30+60+30寬窄行距配置,種植密度為每公頃19.8萬株/hm2。全生育期滴灌11次,滴灌總量5 400 m3·hm-2,采用膜下滴灌。共施純氮495 kg·hm-2,30%基施,其余隨水滴施,其他管理措施同一般大田管理。【結果】秸稈還田可以顯著提高3個土層土壤胡敏酸含量,隨著連作年限增加, 胡敏酸含量逐漸升高,20—40 cm土層土壤胡敏酸積累幅度最大,連作30 a棉田土壤胡敏酸含量比連作5、10、15、20和25 a分別增加139.90%、86.68%、93.33%、58.60%和22.86%;秸稈還田長期連作棉田0—20、20—40和40—60 cm土層土壤富里酸含量隨著連作年限的增加而保持穩定不變, 分別維持在(2.79±0.19)、(2.56±0.10)和(1.77±0.15)g·kg-1的水平上,而且0—20 cm和20—40 cm土層富里酸含量明顯大于40—60 cm土層。秸稈還田能夠顯著地增加長期連作棉田各個土層胡敏素含量,胡敏素含量0—20>20—40>40—60 cm土層。秸稈還田不同連作年限CHA/CFA值均大于1,PQ值均大于0.5,且隨著年限增加而增大,連作5 a最小,連作30 a最大,0—20、20—40和40—60cm土層連作30年CHA/CFA比連作5 a分別增加120.04%、116.39%和112.91%,PQ值連作30 a比連作5 a分別增加37.15%、36.44%和36.81%。【結論】秸稈還田能夠提高長期連作棉田土壤胡敏酸和胡敏素的含量,增加富里酸含量并使之處于穩定水平上,還能夠顯著地提高 CHA/CFA和PQ值,使土壤腐殖質品質朝好的方向轉化。
    沙漠綠洲灌區甜瓜氮磷鉀用量優化模式研究
    薛亮,馬忠明,杜少平
    中國農業科學. 2015, 48(2):  303-313.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.10
    摘要 ( 257 )   HTML ( 1 )   PDF (1985KB) ( 444 )   收藏
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    【目的】為優質甜瓜生產提供科學施肥依據,以挖掘產量潛能,降低生產成本,防止過量施肥造成的環境污染。【方法】連續兩年田間試驗按氮、磷、鉀3因子5水平312-D飽和最優設計方法進行,建立以甜瓜收獲后產量、可溶性固形物含量(SSC)和經濟效益為目標的肥料效應方程,解析肥料的獨立效應與交互效應,確定甜瓜氮磷鉀施用量閾值。【結果】相對于不施肥處理(N0P0K0),施肥后甜瓜產量提高了16.42%—65.98%,SSC提高了6.71(2012年)和6.62(2013年)個百分點;在其他兩個施肥因子一致時,施氮量由0增加到360 kg·hm-2,產量分別提高31.23%(2012年)和31.47%(2013年),SSC增加2.89(2012年)和2.46(2013年)個百分點;施磷量由0增加到180 kg·hm-2,產量提高5.77%(2012年)和7.53%(2013年),SSC提高0.55(2012年)和1.09(2013年)個百分點;施鉀量由0增加到90 kg·hm-2時,產量提高5.51%(2012年)和5.09%(2013年),SSC提高1.37(2012年)和1.69(2013年)個百分點。甜瓜產量、SSC和經濟效益隨著氮、磷、鉀用量的增加而先增加、后降低。對甜瓜產量、SSC和經濟效益影響順序為氮>鉀>磷。氮磷、氮鉀互作對產量、SSC和經濟效益影響較為明顯,而磷鉀互作的影響均不顯著;氮磷互作對產量和經濟效益為正效應,對SSC不顯著;氮鉀互作對產量和經濟效益為負效應;磷、鉀肥含量較低時,增施氮肥對產量、SSC形成抑制作用,較高時氮肥有明顯的增效作用。【結論】綜合考慮氮磷鉀肥對產量、品質和經濟效益的影響,綠洲灌區大田甜瓜高產優質高效益的施肥方案為:施氮量260.22—263.64 kg·hm-2,施磷量133.03—134.08 kg·hm-2,施鉀量87.53—88.52 kg·hm-2,產量為44 356 kg·hm-2,SSC 13.61 %,經濟效益68 445 yuan/hm2
    園藝
    水肥耦合對溫室袋培番茄品質、產量及水分利用效率的影響
    王鵬勃,李建明,丁娟娟,劉國英,潘銅華,杜清潔,常毅博
    中國農業科學. 2015, 48(2):  314-323.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.11
    摘要 ( 373 )   HTML ( 4 )   PDF (1137KB) ( 645 )   收藏
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    【目的】探討水分和肥料與溫室袋培番茄品質、產量及水分利用效率關系,為溫室袋培番茄的高效生產提供科學依據。【方法】在溫室條件下,以番茄品種‘金棚1號’為試材,研究水肥耦合對溫室袋培番茄品質、產量和水分利用效率的影響,同時基于主成分分析方法對番茄品質做多目標綜合評價,最后分析不同處理番茄生產的成本和經濟收益。【結果】單株施肥量、灌水量以及水肥交互作用對番茄各品質指標影響不同。在相同水分條件下,番茄果實中硝酸鹽和可溶性蛋白含量隨著肥料濃度的升高而增加,而Vc、番茄紅素以及可溶性糖含量卻呈現先增加后減少的趨勢;在相同肥料濃度下,隨著基質含水量的增加番茄果實中硝酸鹽、Vc、可溶性蛋白、以及可溶性糖等含量逐漸降低,表現為“稀釋效應”,番茄紅素的含量則在中水處理下較高;在單株施肥量一定的條件下,其產量隨著灌水量的增加呈現先增加后降低的趨勢,而在單株灌水量一定的條件下,產量隨著施肥量的增加同樣呈現拋物線趨勢,施肥量、灌水量以及水肥交互作用對番茄產量的影響都達到了極顯著水平,其影響大小順序為水分作用>肥料作用>水肥交互作用;在同一施肥水平下,袋式栽培番茄灌溉水分利用效率隨著單株灌水量的升高而降低,在同一灌水量水平下,灌溉水分利用效率隨著施肥量的增加呈拋物線趨勢,施肥量和灌水量作為單一因子對灌溉水分利用效率的影響極顯著,且水分作用>肥料作用,而水肥交互作用對水分利用效率的影響不顯著;高肥高水處理的凈收益最高,為4.98 元/株,與中肥中水處理(4.86 元/株)、高肥中水(4.84 元/株)以及中肥高水(4.80 元/株)之間無顯著性差異;而低肥低水處理的凈收益為3.33 元/株,顯著低于其他處理。【結論】綜合考慮品質、產量、水分利用效率、資源節約以及可持續生產等因素,在不顯著降低番茄品質和凈收益的情況下,選擇中肥(5 1470 mg)中水(120 L)處理作為最優水肥組合。
    弱光下菊花‘清露’的激素水平及相關基因表達
    韓霜,陳素梅,蔣甲福,房偉民,管志勇,陳發棣
    中國農業科學. 2015, 48(2):  324-333.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.12
    摘要 ( 294 )   HTML ( 1 )   PDF (1356KB) ( 497 )   收藏
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    【目的】測量菊花在弱光條件下,出現庇蔭癥狀過程中乙烯生成速率、赤霉素和生長素含量的變化及相關基因表達變化,從激素和基因水平探究庇蔭機理。【方法】以菊花‘清露’為試驗材料,設置55%光照(對照)和15%光照(弱光處理)。利用氣相色譜儀Agilent 6890N GC在0、2、4、6和8 d測量乙烯生成速率,利用高效液相色譜儀Agilent HPLC-110在0、2、4、6和8 d測量赤霉素(GA3)和生長素(IAA)含量,以GAPDH為內參基因用熒光定量PCR方法測量0、2、4、6和8 d時PHYACOP1PIF4GAIIAA1的相對表達量。設置0.5、1.0、2.0和4.0 mmol·L-1 4個GA3濃度,用適量乙醇溶解,使乙醇終濃度為1%,0 d、4 d時各處理1次,采用地上部噴施;設10、20、50和100 μmol·L-1 4個多效唑(paclobutrazol,PAC)濃度,用適量乙醇溶解,使乙醇終濃度是1%,0 d和4 d時各處理1次,根據結果以2.0 mmol·L-1 GA3,50 μmol·L-1 PAC對植物生長影響顯著,分別作為處理濃度。0 d、7 d各噴1次,14 d時取樣進行基因表達分析。【結果】15%光照條件下,第2天和第4天時乙烯生成速率顯著增加,第4天最顯著,比對照增加了2.04倍,第6天以后對照和處理的植株乙烯生成速率差異不顯著,15%弱光處理條件下植株地上部乙烯生成速率比55%光照條件增加顯著;15%光照條件下,第2、4和6天時葉片赤霉素含量與對照相比顯著增加,第6天時出現峰值,達到4 700.56 ng·g-1,比對照高出2.57倍,隨后又迅速下降,第8天降到與對照相同的水平;15%光照條件下生長素水平與對照組相比顯著下降,隨著處理時間的延長,對照組生長素含量呈增加趨勢,弱光處理組生長素含量呈下降趨勢,第8天時處理組生長素含量為223.95 ng·g-1 FW,對照為489.77 ng·g-1 FW,對照比處理的生長素含量高出1.12倍。弱光處理第2天時PHYA表達量迅速增加,2—6 d以略小的速度增加,6—8 d保持不變,對照組從第2天開始下降,4—8 d時處理組PHYA變化量都高于對照組;對照和處理的PIF4表達量變化在0—4天趨勢相同,不同的是處理組在4—8 d高于對照,尤其是第6天比對照高出1.85倍。對照組COP1呈緩慢降低趨勢,處理組先增加后下降,峰值出現在第2天,第8天降到對照組含量以下。整個處理過程中,處理組的GAI一直增加,對照組0—4 d小幅增加,后以較快的速度下降。處理組和對照組IAA1在0—2 d均小幅上升,對照組在2—4 d又以較快速度下降,2 d后處理組IAA1表達量變化不大。外源赤霉素使COP1PIF4的表達量上升,使GAIIAA1表達量下降;PAC處理抑制COP1PIF4、GAIIAA1的表達。【結論】PHYACOP1IAA1PIF4都受光的誘導,弱光引起GA含量升高和GAI轉錄水平上調,赤霉素和乙烯參與菊花庇蔭調節過程。
    貯藏·保鮮·加工
    大蒜蔗糖﹕蔗糖1-果糖基轉移酶(1-SST)的酶學特征
    文明,卜利偉,羅紫韻,王佳偉,董芬,黃雪松
    中國農業科學. 2015, 48(2):  334-342.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.13
    摘要 ( 381 )   HTML ( 7 )   PDF (755KB) ( 423 )   收藏
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    【目的】研究大蒜(Allium sativum L.)中蔗糖﹕蔗糖1-果糖基轉移酶(1-SST)的酶學特征,為大蒜保鮮、加工和品質改良提供依據。【方法】采用飽和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的硫酸銨分級沉淀1-SST,以確定其所在的硫酸銨部位。分別取1-SST活力最高的硫酸銨部分與底物蔗糖反應,研究其在不同的溫度、pH、離子強度、底物質量濃度等條件下合成高果聚糖的能力,即采用高效液相色譜-蒸發光散射(HPLC-ELSD),測定1-SST反應前后的1-蔗果三糖的含量,進而計算出1-SST活力大小并總結出其在不同的溫度、pH、離子強度、底物質量濃度等條件下合成高果聚糖反應的規律;采用的色譜柱為Prevail Carbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),色譜柱柱溫箱溫度為40℃,流動相最大限壓20 MP,流動相為乙腈和水,其流速為1.0 mL·min-1,ELSD撞擊器關閉狀態,漂移管溫度90℃,載氣流量2.5 L·min-1(空氣)。其梯度洗脫方式為:0 min,75%乙腈﹕25%水;15 min,65%乙腈﹕35%水;30 min,50%乙腈﹕50%水;35 min,75%乙腈﹕25%水;40 min,75%乙腈﹕25%水。【結果】在上述測定條件下,果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6種糖完全分離,出峰時間僅為20 min,測定方法可靠、靈敏度高,滿足了測定1-SST活性的要求。以50%(w/w)蔗糖為底物時,僅產生1-蔗果三糖,無其它高果聚糖的產生,證實了在所試條件下,大蒜中1-SST反應具有專一性。大蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸銨飽和度部分,其中0—30%,40%—70%有輕微活力,未發現70%—100%硫酸銨組分有1-SST的活力。取30%—40%的硫酸銨飽和度部分作為樣品研究1-SST酶學特征發現其最適反應溫度為35℃,當溫度到達40℃以上時,酶的活力下降的很快,說明1-SST具有熱不穩定性,因此在研究大蒜1-SST時,要盡量避免高溫,以免影響后續研究;其最適反應pH為5.0,與大麥(Hordeum vulgare)、菊苣(Cichorium intybus L.)、菊芋(Helianthus tuberosus Colombia )、黑麥草(Lolium rigidum)、龍舌蘭(Agave americana L.)的1-SST最適pH大致相同,顯示不同植物1-SST活力中心部位的結構可能基本一致;在蔗糖濃度為100—600 mg·mL-1內,酶活力隨著底物質量濃度的增加而提高,而當底物濃度超過500 mg·mL-1時,酶活力增加的幅度減少而趨于平緩,這完全符合米氏方程(Michaelis-menten)的酶動力學性質;對于Na+、Cl-來說,離子強度越低,1-SST活力越強,1-SST在35℃下的米氏常數Km為104 mmol·L-1。【結論】大蒜1-SST隨溫度、pH、離子強度、底物質量濃度等變化,不僅影響大蒜貯藏過程中的果聚糖代謝,也影響大蒜加工產品,尤其是大蒜提取物中糖的種類和含量。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、組織表達與印記狀況分析
    蘇魯方,彭學強,蔣曹德
    中國農業科學. 2015, 48(2):  343-351.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.14
    摘要 ( 273 )   HTML ( 1 )   PDF (2293KB) ( 683 )   收藏
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    【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2(pleckstrin homology-like domain, family A, member 2)基因序列,分析其組織表達特征、印記狀況以及與胎盤性狀的關系,為深入研究該基因在山羊胎盤中的功能積累數據。【方法】根據人、牛和豬PHLDA2的保守區域設計引物以RT-PCR方法擴增大足黑山羊該基因部分cDNA序列,進一步利用5′-和3′-RACE技術獲得全長cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在線工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、腎、大腦、肌肉、脂肪、舌和胎盤等10個組織的表達差異;尋找大足黑山羊和波爾山羊PHLDA2基因序列SNP位點,基于表達SNP的方法分析該基因在F1代組織中的印記狀況;采用線性回歸的方法分析PHLDA2表達量與胎盤性狀的關系。【結果】克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的cDNA全長序列,其中5′-UTR、3′-UTR和編碼序列分別為62 bp、450 bp和420 bp,其編碼140個氨基酸。預測的山羊PHLDA2蛋白分子量大小為15 638.7 Da,等電點為9.18,二級結構由α-螺旋(37.14%)、β-轉角(9.29%)、延伸鏈(23.57%)和無規卷曲(30%)組成, 并且包含保守的PH(pleckstrin homology)結構域。③BLAST分析發現,山羊PHLDA2定位于29號染色體,其與牛、豬、獼猴、馬和人同源基因核苷酸序列的相似性分別達到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上與牛的親緣關系最近。④熒光定量PCR結果顯示PHLDA2在山羊胎盤中表達量最高(P < 0.01),在心、肝、肺、腎、肌肉、脂肪、舌和大腦組織中表達量很低且差異不顯著(P > 0.05), 在脾中未檢測到表達。⑤印記分析表明,PHLDA2初生山羊胎盤、心臟和肝臟組織表達母源等位基因,但在肺、大腦和肌肉組織為雙等位基因表達。PHLDA2表達水平與山羊胎盤重回歸關系顯著(n = 15,R2=0.855,P <0.01)。【結論】山羊PHLDA2基因序列和結構特征具有物種間的保守性,但是其印記狀況具有組織特異性; PHLDA2為山羊胎盤的生長和功能調控的重要基因。
    豬傳染性胃腸炎病毒非結構蛋白3a和3b融合表達及對細胞周期的影響
    梁亞冰,張琪,常嶸,童德文,許信剛
    中國農業科學. 2015, 48(2):  352-361.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.15
    摘要 ( 257 )   HTML ( 1 )   PDF (1921KB) ( 467 )   收藏
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    【目的】克隆及真核表達豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus ,TGEV)陜西分離株的3a和3b基因,研究表達蛋白在細胞中的分布及其對細胞周期的影響。【方法】利用軟件Primer 5.0參照Genbank公布的序列設計兩對分別針對TGEV非結構蛋白基因3a和3b的特異性引物。采用RT-PCR方法TGEV 陜西分離株克隆3a和3b基因,再將其與真核表達載體pEGFP-N1連接,構建真核表達質粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂質體轉染法將重組質粒轉染豬小腸黏膜上皮細胞(intestinal epithelial cells,IEC),采用激光共聚焦顯微鏡檢測轉染細胞內融合蛋白的表達分布情況。通過RT-PCR檢測細胞中目的基因的轉錄情況,Western blotting檢測細胞中融合蛋白的表達情況。利用流式細胞儀檢測表達蛋白對細胞周期的影響,采用實時熒光定量PCR檢測融合蛋白的表達對內質網應激蛋白標志性分子GRP78和細胞周期蛋白Cyclin A的表達的影響,通過Western blotting試驗檢測細胞中蛋白表達后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表達量的變化情況。【結果】成功克隆出完整的TGEV陜西分離株的3a及3b基因,經過測序鑒定,3a基因的大小為213bp,3b基因的大小為732bp;經過與不同來源的TGEV毒株進行對比分析,3a基因的核苷酸序列與其他毒株同源性為97.4%—100%,氨基酸同源性為98.6%—100%;3b基因的核苷酸序列與其他毒株同源性為98.3%—99.9%,氨基酸同源性為100%。重組表達載體轉染IEC細胞后,經Western blotting分析IEC分別表達出分子質量約為35kD的3a-GFP和54kD的3b-GFP的融合蛋白,與預期結果相一致。激光共聚焦顯微鏡觀察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC細胞的細胞核和細胞質中均有表達,流式細胞儀分析TGEV非結構蛋白3b的表達能夠使G2/M期的細胞增多,實時熒光定量PCR分析顯示細胞周期蛋白Cyclin A的mRNA水平高于對照組細胞(IEC和IEC-GFP),同時Western blotting分析結果顯示表達3b蛋白的細胞中Cyclin A 蛋白水平表達量高于對照組,并且Cyclin B1的表達量低于對照組細胞,差異顯著;TGEV非結構蛋白3a對細胞周期沒有影響。實時熒光定量PCR分析結果顯示,表達TGEV非結構蛋白3a的細胞中GRP78的mRNA水平高于對照組, Western blotting分析GRP78的蛋白水平高于對照組,差異顯著,說明非結構蛋白3a可以使GRP78表達水平的上調;TGEV非結構蛋白3b對GRP78的表達沒有影響。【結論】TGEV陜西株的非結構蛋白3a和3b在IEC細胞中成功表達,3a蛋白可以引起細胞內質網應激反應,3b蛋白通過使細胞周期蛋白Cyclin A表達上調并且使Cyclin B1表達下調引起細胞周期阻滯于G2/M期。
    基于1H NMR技術的乳熱奶牛血清代謝組學分析
    孫雨航,許楚楚,李昌盛,夏成,徐闖,吳凌,張洪友
    中國農業科學. 2015, 48(2):  362-369.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.16
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    【目的】應用1H譜核磁共振(1H NMR)技術篩選乳熱奶牛血清內差異表現的小分子代謝物,從小分子水平和物質、能量代謝的角度探究奶牛發生乳熱時其體內的代謝變化。【方法】選取年齡、胎次、體況和泌乳量相近的分娩當天的荷斯坦高產奶牛共32頭,根據其血清中鈣離子濃度及其有無臨床癥狀分為兩組。其中,24頭奶牛為健康對照組(Group1, 血鈣濃度 > 2.5 mmol·L-1,無其他任何癥狀)和8頭乳熱組(Group2, 血鈣濃度 < 1.4 mmol·L-1,伴有明顯乳熱臨床癥狀)。32頭奶牛分別于清晨飼喂和榨乳前從頸靜脈采集血液10 mL,置于離心管中,4℃下以1 500 × g 離心20 min,將離心得到的血清裝入1.5 mL的EP管中,置于-80℃下待測。待樣品解凍后,分別從每個EP管中抽取400 μL血清,加入200 μL緩沖鹽溶液,充分混合、離心后,提取550 μL上清液置于5 mm核磁管中,在500 MHz的核磁共振波譜儀下采集信號。然后利用Topspin和MestReNova等軟件將采集到的信號進行傅里葉轉換,同時進行調零、校正基線和相位等預處理,去除水峰和尿素峰信號,將一維圖譜進行積分分段,并將圖譜信息轉換為TXT格式文件,以便于后續數據分析,然后使用Chenomx軟件進行化合物指認。最后應用SIMCA-P軟件對得到的圖譜數據進行多元統計分析,包括主成分分析(PCA)和正交修正-偏最小二乘法-判別分析(OSC-PLS-DA), 同時結合SPSS軟件對核磁數據進行單因素方差分析得到的P值以及Loading圖,最終篩選出表現差異的小分子代謝物。【結果】本試驗成功得到了乳熱組和健康對照組奶牛的血清代謝圖譜及差異表達代謝物的Loading圖;PCA結果顯示每組樣品均在95%置信區間內,無需剔除,主成分貢獻率較低,其中PC1=26.2%,PC2=16.7%,組間差異變量不能被選擇;OSC-PLS- DA結果顯示經過5次正交信號修正,與分組無關的變量被去除,組間差異達到最大化;與健康對照組相比,共篩選出9種血清差異表達代謝物,其中4種表達上調,分別為 β-羥基丁酸、丙酮、丙酮酸和賴氨酸,5種表達下調,分別為葡萄糖、丙氨酸、丙三醇(甘油)、磷酸肌酸和氨基丁酸;9種差異代謝產物多為糖和氨基酸,相互之間形成了一個能量轉化網絡圖,通過多種代謝途徑參與了機體能量代謝過程,其中較為特殊的差異代謝產物,如磷酸肌酸可直接為機體提供能量,其表現降低可能與病牛肌無力和癱瘓有關。此外,本試驗中乳熱組奶牛氨基丁酸降低,臨床表現為精神沉郁、甚至昏迷,這與人類抑郁癥患者的氨基丁酸表現相吻合,有關氨基丁酸下降與奶牛乳熱精神的關系有待研究者進一步證實。【結論】1H NMR技術能夠被應用于篩選奶牛血清表現差異的小分子代謝物,代謝物差異顯著;本試驗中乳熱奶牛血清差異代謝產物表現出能量負平衡及脂肪動員的病理學特征,提示乳熱與能量代謝障礙有關。
    小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表達分析
    秦加敏,羅術東,廖秀麗,黃家興,和紹禹,吳杰
    中國農業科學. 2015, 48(2):  370-380.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.17
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    【目的】克隆小峰熊蜂(Bombus hypocrita)可溶型海藻糖酶基因(soluble trehalase,Tre-1)全長cDNA序列,預測該基因及其編碼蛋白的理化性質,明確該基因在小峰熊蜂不同組織及不同發育時期的表達特性,為研究該基因在小峰熊蜂生長發育中的生物學功能奠定基礎。【方法】根據地熊蜂(B. terrestris)和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1編碼蛋白的保守區序列,利用Primer Premier 5.0設計簡并引物擴增得到小峰熊蜂保守區片段;隨后根據該片段設計基因特異性引物,用RACE方法獲得5'端和3'端片段。在此基礎上,根據RACE擴增所得片段和保守序列,預測開放閱讀框(ORF)序列,分別在起始密碼子近5'端和終止密碼子的近3'端設計ORF區特異性引物擴增得到ORF,最后采用BioEdit軟件比對、拼接獲得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全長序列。運用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等軟件對該基因進行生物信息學分析,并利用實時熒光定量PCR技術,采用2-ΔΔCt方法檢測不同組織及不同發育時期可溶型海藻糖酶基因的相對表達量。【結果】克隆所得基因cDNA全長為3 129 bp,命名為BhTre-1(GenBank登錄號:KJ025078),其中包含5'441 bp非編碼區和3'端945 bp非編碼區,ORF為1 743 bp,共編碼580個氨基酸。其編碼的蛋白預測分子質量為67.16 kD,等電點為5.95;有1個信號肽結構(1—21位),1個甘氨酸富集區(GGGGEY),2個特色“標簽序列”(PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP),6個Asn-Xaa-Ser/Thr(N-X-S/T)序列,無跨膜區序列分析發現BhTre-1氨基酸序列與地熊蜂BtTre-1B. impatiens BiTre-1一致性很高,分別為99%和98%,與西方蜜蜂(Apis mellifera)和云南小蜜蜂(A. florea)的Tre-1一致性也達到78%;系統發育分析也表明BhTre-1BtTre-1BiTre-1的親緣關系最近,AmTre-1AfTre-1之間的親緣關系次之。基因定量分析結果顯示BhTre-1在成蟲被檢測的各組織中均有表達,在中腸的表達量最高,其次是馬氏管,其他各組織表達量較低。成年工蜂的BhTre-1表達量高于幼蟲和蛹,工蜂出房后隨著齡期的增加表達量呈現先升高后降低的規律,在第15天表達量最高。【結論】克隆得到了BhTre-1全長cDNA序列,其分子生物學特性與其他昆蟲Tre-1相似,該基因在小峰熊蜂中腸表達量最高,此外,幼蟲和蛹的表達量低于成年工蜂,工蜂出房后表達量呈現先升高后降低的趨勢,為進一步研究該基因在小峰熊蜂體內的生物學功能奠定了基礎
    研究簡報
    多花黑麥草DUS測定中SSR標記品種鑒定比較分析
    黃婷,馬嘯,張新全,張新躍,張瑞珍,符開欣
    中國農業科學. 2015, 48(2):  381-389.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.18
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    【目的】多花黑麥草是具世界栽培意義的牧草,但因異花授粉特性,育種材料的頻繁交流導致品種間的遺傳差異越來越小,傳統農藝性狀進行品種鑒定變得越來越困難。高效、快速有效地鑒定品種對實現育種目標具有重要作用,可為輔助多花黑麥草品種DUS測試和品種鑒定、知識產權保護等提供科學依據。【方法】基于SSR標記具有穩定性強、多態性高和共顯性特點,對6個國審骨干多花黑麥草品種采用30株混合取樣策略,每個品種以不同單株構成的30株混合樣本量進行3次重復試驗,以重復試驗中至少出現2次的頻率高的強帶進行統計,從165對多花黑麥草SSR引物中,篩選出20對引物用于多花黑麥草品種鑒定。并采用30株單株樣本擴增與30株混合樣本擴增相結合的方法,加之擴增結果的比對,進行品種的鑒定分析。【結果】利用13-07A、01-06D和15-08C引物對6個多花黑麥草品種進行30株單株和30株混合取樣對比性分析表明,混合株的某些條帶相對于單株條帶更為明顯,且條帶數更多,但也易出現一些彌散帶,單株擴增中出現頻率在40%及以上的條帶則會在混合樣本中出現;3組混合取樣結果表明,20對SSR引物共擴增出143條清晰可辨條帶,其中多態性條帶127條,多態性條帶的比率為88.81%,每對引物擴增的條帶數為5—11,平均為7.15條,平均多態性條帶為6.35條,平均多態性信息含量(PIC)為0.571,有的引物雖多態性信息含量較低,但穩定性好,3組混合樣本擴增結果幾乎一致;6個多花黑麥草品種的遺傳相似系數范圍為0.4755—0.7552,遺傳相似系數最大的為邦德和阿德納,遺傳相似系數最小的為長江2號和特高。在平均遺傳相似系數為0.615時可以將6個多花黑麥草品種劃分為三大類:第Ⅰ類包括安格斯1號、邦德、阿德納、達伯瑞;第Ⅱ類是長江2號;第Ⅲ類是特高。20對引物中有9對引物可以直接進行6個品種的鑒定,而其余的引物只能鑒別其中的3個或4個,則可通過不同引物的組合提高鑒別能力。【結論】對于異花授粉植物,多態性并非衡量引物有效性的唯一標準,引物穩定性也是衡量引物有效性的重要指標;相對于單株取樣法,采用混合取樣法進行品種鑒定更為有效;篩選出的20對SSR引物可以明確區分供試材料,采用SSR分子標記對多花黑麥草進行品種鑒定分析具有可行性。
    基于gpd基因的大蒜黑腐病菌實時熒光定量PCR鑒定技術
    王英超,甘琴華,厲艷,紀瑛,吳興海,邵秀玲
    中國農業科學. 2015, 48(2):  390-397.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.19
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    【目的】大蒜黑腐病菌(Embellisia allii (Campanile) Simmons)的檢疫鑒定主要采用形態鑒定方法。不僅耗時長,而且大蒜黑腐病菌與本屬其他種以及其他屬的分生孢子非常相似,極難分辨,需要建立快速、有效的分子診斷方法。研究旨在建立實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)體系以準確、靈敏地鑒定大蒜黑腐病菌。【方法】從NCBI的GenBank數據庫中,選取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似種的3-磷酸甘油脫氫酶(gpd)基因核酸序列數據15種,應用引物設計軟件Primer express,根據探針設計原則從理論上選出1條探針和3對引物。根據試驗結果對上述引物進行篩選,篩選出能夠鑒定出大蒜黑腐病菌的特異性引物對和TaqMan探針。同時對反應體系中復性-延伸溫度的反應參數進行優化,設計56、58、60℃ 3個溫度梯度;將大蒜黑腐病菌基因組DNA在紫外核酸分析儀上進行定量后進行10倍的梯度稀釋,對探針靈敏性進行測試,從而建立大蒜黑腐病菌TaqMan水解探針法qPCR檢測體系。【結果】從基于GenBank上的15種gpd基因核酸序列設計的引物和探針中,篩選出能夠鑒定大蒜黑腐病菌的特異性引物對Emb21/Emb32和TaqMan探針Emb。在供試的6種菌株中,只有靶標菌大蒜黑腐病菌利用該引物對和探針能夠被特異性的檢測到陽性,空白對照和其他參試菌均沒有熒光信號的增加,檢測為陰性。復性-延伸溫度反應參數優化中,△Rn熒光信號增加值在58℃時達最大,56、60℃熒光信號增加值降低,經過多次重復試驗,確定最佳的復性-延伸溫度為58℃。靈敏度測試中,大蒜黑腐病菌DNA濃度稀釋到140 pg時,所得的圖形較好;當體系中模板濃度稀釋到14 pg時,所得的圖形較差。最終DNA檢測靈敏度為140 pg。應用該引物和探針建立的qPCR檢測方法能夠從供試的菌株中特異性地檢出大蒜黑腐病菌。【結論】建立了大蒜黑腐病菌TaqMan探針法qPCR檢測體系,該檢測技術能夠從供試的6種病原菌中特異性檢測出大蒜黑腐病菌,檢測靈敏度可達140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌qPCR方法具有高度的特異性和靈敏度,適合口岸大蒜黑腐病菌的快速檢測。
    基于基因組原位雜交快速構建黃瓜變種間核型
    張云霞,婁群峰,李子昂,王筠竹,張振濤,李季,陳勁楓
    中國農業科學. 2015, 48(2):  398-406.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.20
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    【目的】利用基因組熒光原位雜交(genomic in situ hybridization,GISH)技術,對黃瓜(Cucumis sativus L.,2n=2x=14)種內兩個變種(栽培黃瓜C. sativus var. sativus和野生黃瓜C. sativus var hardwickii)進行中期染色體分析,建立黃瓜變種染色體核型的快速分析方法,為黃瓜細胞分子遺傳學研究提供基礎。【方法】以栽培黃瓜‘9930’和野生黃瓜C. sativus var. hardwickii為材料,利用CTAB法提取栽培黃瓜‘9930’的基因組總DNA,采用缺刻平移法,將栽培黃瓜‘9930’基因組DNA和45S rDNA分別利用地高辛和生物素標記為探針,與栽培黃瓜‘9930’和野生變種C.sativus var. hardwickii的中期染色體進行熒光原位雜交,根據雜交結果顯示的栽培黃瓜與野生變種每條染色體GISH熒光帶型的不同,結合45S rDNA位點信號特征,區分栽培黃瓜與野生變種的每條染色體,并進行核型分析。【結果】熒光原位雜交結果顯示,GISH信號并非平均分布于所有染色體上,而是在不同染色體的特定部位產生獨特的信號,且兩個變種間中期染色體的GISH信號模式差異顯著。在栽培黃瓜‘9930’有絲分裂中期染色體上,除了6號染色體僅在短臂末端和近著絲粒處產生GISH信號外,其他染色體上的GISH信號集中分布于染色體的兩端和近著絲粒的一側或兩側,且每條染色體的信號特征差異明顯;45S rDNA信號主要分布于‘9930’的第1、2、3、4和7號染色體的近著絲粒處,有3對強信號和2對弱信號。在野生黃瓜C. sativus var. hardwickii有絲分裂中期染色體上,雜交信號的位置及強弱與栽培黃瓜‘9930’表現明顯不同,近著絲粒處均有GISH信號,但僅在第1、2、4和5號染色體的一端產生GISH信號,45S rDNA信號僅出現在第1、2和3號染色體上,表現為第1號染色體上信號極強,第2和3號染色體上信號極微弱。這些結果顯示,以栽培黃瓜基因組DNA為探針的熒光原位雜交能反應出兩個變種中期染色體獨特的信號分布模式,通過信號的分布模式和強弱,結合45S rDNA位點信號的特異分布,可對每條染色體進行清晰地鑒別,并據此建立了兩個變種的核型模式。比較前人發表的黃瓜已有重復序列的分布圖,發現GISH揭示的信號分布主要位于黃瓜染色體串聯重復序列區域。【結論】黃瓜基因組原位雜交能一次性快速顯示基因組串聯重復序列的分布圖,能有效地用于不同黃瓜變種的快速核型分析;同時發現染色體上串聯重復序列的分布及強弱在黃瓜變種間表現出明顯的分化。
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