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當期目錄

    2015年 第48卷 第9期 刊出日期:2015-05-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    CRISPR/Cas9系統在植物基因組定點編輯中的研究進展
    解莉楠,宋鳳艷,張旸
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1669-1677.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.01
    摘要 ( 629 )   HTML ( 5 )   PDF (1085KB) ( 3297 )   收藏
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    當外源DNA通過轉基因技術導入植物細胞后,會以同源重組或非同源重組兩種不同的方式整合到基因組中,進而獲得相應的目標性狀。外源DNA與受體細胞序列相同或相近的位點發生重新組合,從而整合到受體細胞的染色體上稱之為同源重組;當發生了DNA雙鏈斷裂的細胞為了避免DNA或染色體斷裂而造成DNA降解或對生命力的影響,而強行將2個DNA斷端彼此連接在一起時則為非同源重組。發生非同源重組的細胞其基因組常出現核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突變等多種情況,使得研究者無法得到精確控制的突變結果;而發生同源重組的細胞基因組序列通常不變,通過加入同源重組的供體DNA,可以實現對基因組的精確修飾和改造。由于在植物中產生自發同源重組的概率很低,對植物基因組進行精確修飾和改造非常困難,位點特異性核酸酶的出現和應用,大大提升了同源重組的效率,使基因組編輯變得更加高效和精確,從而使得對包括植物在內的任何物種進行基因組編輯都將成為可能。鋅指核酸酶(ZFN)和TALE核酸酶(TALENs)是能夠使DNA的靶位點產生DNA雙鏈斷裂進而實現基因組定點編輯的常用系統,但在具體應用中發現這兩種系統存在著許多缺陷和不足,如脫靶效應、與基因組進行特異結合與染色體位置及鄰近序列有關等,另外技術難度大、構建組裝時間長也限制了其應用。CRISPR/Cas系統廣泛存在于細菌及古生菌中, 是機體長期進化形成的RNA指導的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應性免疫系統。Ⅱ型CRISPR/Cas系統經過密碼子優化等改造后已成為繼鋅指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定點編輯的新技術,具有突變效率高、制作簡單、易操作及成本低的特點。目前,該技術成功應用于人類細胞、斑馬魚、小鼠以及細菌的基因組精確編輯,編輯的類型包括基因的定點插入、小片段的缺失、多個位點同時突變、基因定點的indel突變等。目前,CRISPR/Cas系統在植物中的應用還比較有限,但該技術為植物基因工程的發展呈現了美好的前景。文中首先簡要介紹了CRISPR/Cas系統的組成和基本原理,進而詳細綜述了該技術在植物內源基因和外源基因定點編輯中的應用,主要列舉了自CRISPR/Cas系統改造成功以來利用該系統對單子葉和雙子葉植物進行基因組定點編輯的案例,最后對基因組編輯技術在農業和植物基因工程上的應用進行了展望,希望能夠為開展該領域研究的科研工作者提供參考。
    黃萎病菌毒素聯合法鑒定棉花對黃萎病的抗性
    王銘,臧麗麗,范凱,李鳳,袁淑娜,申浩,王學德
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1678-1688.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.02
    摘要 ( 357 )   HTML ( 1 )   PDF (828KB) ( 396 )   收藏
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    【目的】黃萎病菌是危害棉花最嚴重的病菌,又屬于被檢疫的病菌,田間接菌鑒定棉花抗病性受到檢疫的限制,通過比較多種鑒定棉花抗黃萎病的方法,提出一種使用黃萎病菌毒素進行聯合鑒定的方法,以替代傳統病圃鑒定法。【方法】將待測棉花品系種植于人工氣候室內,以常規管理模式培養棉苗,在21 d后將所種植棉苗的根部放入黃萎病菌毒素中浸泡,浸泡72 h時統計病情指數;在待測棉花品系的盛花期取棉株倒數第三片葉片,用打孔器在葉片上取10—20個直徑約1.5 cm的葉圓盤,將所取葉圓盤浸泡于黃萎病菌的毒素當中,經過24 h后觀察所浸泡的葉圓盤黃化程度,并進行統計分析;綜合上述兩種方法的鑒定結果,對待測棉花品系的黃萎病抗性作出評價。【結果】通過對多種鑒定方法的比較,毒素蘸根法、無底塑缽菌液澆根法和菌液蘸根法所需的鑒定時間較長,而毒素浸根法和毒素浸泡葉圓盤法所需鑒定時間較短;在應用毒素浸根法進行鑒定時,最適毒素濃度為15 μg·mL-1,在此濃度下,毒素浸根法的鑒定結果與田間病圃法鑒定結果的相關系數為0.94(P<0.01);在使用毒素浸泡葉圓盤法進行鑒定時,浸泡葉圓盤的最適毒素濃度為18 μg·mL-1;在應用毒素浸泡葉圓盤法鑒定時,應于盛花期選取待測棉花的倒三葉的葉圓盤進行鑒定,其鑒定結果與常規病圃法鑒定結果的相關系數為0.92(P<0.01);2013年和2014年兩年的試驗結果證明聯用毒素浸根法和毒素浸泡葉圓盤法的鑒定結果與常規病圃法的鑒定結果相關系數較高。2013年其與常規病圃法的鑒定結果相關系數為0.94(P<0.01),2014年為0.95(P<0.01)。【結論】通過聯用毒素浸根法和毒素浸泡葉圓盤法可以準確、環保、便捷地鑒定棉花抗黃萎病性,可以在一定程度上代替傳統的病圃鑒定法,其結果比用單一鑒定方法更為準確可靠。
    越冬紫花苜蓿根系性狀與秋眠性的關系及其抗寒效應
    劉志英,李西良,李峰,陶雅,劉磊,王宗禮,孫啟忠
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1689-1701.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.03
    摘要 ( 366 )   HTML ( 1 )   PDF (535KB) ( 462 )   收藏
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    【目的】秋眠是紫花苜蓿Medicago sativa對晚秋生長環境變化的一種適應性反應,根系是紫花苜蓿越冬的主要功能器官,秋眠性與其越冬具重要關聯,但對于如何通過根系性狀的越冬特征來實現抗寒效應,仍不清楚。文章中從根系性狀越冬反應的角度,探究秋眠性對紫花苜蓿抗寒性的作用過程。【方法】采用11個標準秋眠級紫花苜蓿品種為材料,以紫花苜蓿在中國適宜分布區中較為寒冷的中溫帶地區為例,通過標準主軸分析(standardized major axis,SMA)等方法,研究不同秋眠級紫花苜蓿各根系性狀在越冬過程的差異化響應及其異速生長關系,進一步采用偏最小二乘回歸(partial least squares regression,PLSR)等方法,研究不同秋眠型紫花苜蓿通過根系策略來實現其抗寒效應的關鍵作用因子。【結果】(1)隨著秋眠性的減弱(即秋眠級提高),越冬紫花苜蓿根頸直徑和側根數顯著減小(P<0.05),秋眠性較強的紫花苜蓿具有增強儲藏的表型特征,而主根直徑、側根直徑等則隨著秋眠性的減弱而顯著趨于增大(P<0.05),側根數量與側根的其他特性表現一定的權衡關系(P<0.05);(2)受秋眠級的影響,根系性狀之間表現顯著的異速生長關系,主要表現在根頸入土深度、側根位置、側根數等性狀之間,其異速生長斜率與1存在顯著差異(P<0.05),不同根系性狀在越冬期間對秋眠級具有不同的響應策略;(3)紫花苜蓿越冬率與秋眠級具有顯著的負相關關系,但并非線性響應,而是呈現邏輯斯蒂曲線變化特征,1—5秋眠級趨于穩定在高越冬率水平(>95%),中間級別5—8級的越冬率逐漸急劇減小(50%—70%),9—11級在中高緯度難以越冬(<5%);(4)影響紫花苜蓿越冬率的正向貢獻因子是根頸直徑、側根數(P<0.05),而主根直徑、側根直徑等因子的提高反而降低了紫花苜蓿的抗寒性(P<0.05),根系直徑等性狀并非決定抗寒能力的主導因子。【結論】不同秋眠級紫花苜蓿的根系性狀表現出對越冬低溫脅迫的差異化響應特征,不同性狀具有異速生長關系;紫花苜蓿主要通過增加根頸直徑和側根數來提高其抗寒性,并不取決于根系其他表型性狀的絕對大小;越冬期間,不同秋眠型紫花苜蓿根系策略的適應性變化,是實現其抗寒效應的重要途徑。
    耕作栽培·生理生化
    再生稻產量形成特點與關鍵調控技術研究進展
    徐富賢,熊洪,張林,朱永川,蔣鵬,郭曉藝,劉茂
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1702-1717.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.04
    摘要 ( 538 )   HTML ( 2 )   PDF (530KB) ( 768 )   收藏
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    發展再生稻是充分利用秋季光熱資源,提高稻田產出效益的一條重要途經。根據已報道資料,結合筆者20余年的研究結果,綜述了再生稻產量形成特點及關鍵調控技術研究進展。主要內容包括:(1)頭季稻中上部節的再生穗抽穗期比下部抽穗早、著生葉片數少、出葉速度快、生育期短、穗子小、成穗率和結實率較高。頭季稻抽穗后光合物質主要供給穗部籽粒灌漿結實,分配給再生芽生長利用的光合物質極少,是齊穗后大量再生芽開始死亡的機理所在;改善頭季稻抽穗期間植株行間的光照條件對再生芽生長的促進作用,必須在一定光合物質供給基礎上才能顯現。頭季稻齊穗后品種間再生力取決于頭季稻的葉粒比,強再生力品種頭季稻單位穎花的綠葉面積占有量較大,其光合產物滿足頭季稻高產之后剩余量較多,對再生稻高產提供了重要的物質基礎,雜交組合間再生力與穗粒數呈極顯著負相關關系。(2)水稻品種再生力可分為4級,頭季稻及再生稻兩季高產品種的庫源特征:穗粒數160—190粒、葉粒重比0.0737—0.0827 cm2·mg-1、有效穗232.12—249.40萬/hm2、結實率81.54%—85.74%、千粒重28.58—30.07 g、單穗重4.13—4.43 g。(3)促芽肥提高再生力的作用,是通過施氮延緩了頭季稻生長后期綠葉衰老速度,提高母莖葉片全氮含量及其凈光合速率,增加葉片當時的光合產物向頭季稻穗部輸入比例,減少先期貯藏于母莖鞘中光合產物向穗部輸入量,相對地提高了母莖鞘干物重而增強再生力。促芽肥對再生稻的作用效果在品種間的表現不盡相同,頭季稻穗粒數較多的大穗型品種要提早施用促芽肥并增加施用量,才能獲得較高的再生稻產量。利用雜交中稻齊穗期劍葉葉綠素計讀數(SPAD值)可預測再生稻促芽肥高效施用量;通過防治紋枯病保護頭季稻基部葉片和適度烤田提高根系活力,是再生稻高產的重要保證;頭季稻收獲期的成熟度與再生力呈極顯著正相關,以頭季稻完熟期再生芽開始破鞘現青時收割頭季稻為宜,留樁高度以保留倒2節并高出5—7 cm處割苗即可。(4)針對目前再生稻生產上存在的主要制約因素,即再生稻開花期的低溫危害、再生稻大面積產量不平衡和機械收獲頭季稻對再生稻生產的不利影響,提出了相應的對策與解決途經。(5)提出再生稻理論與技術的研究重點,包括“生態與農藝措施對頭季稻后期冠層性狀與再生芽生長的多因素互作機制”、“頭季稻收割后再生芽停滯于母莖鞘中的原因及其調控途徑”、“提高再生稻氮肥利用效率的技術途徑”和“適應機械插秧與機械收割的雜交水稻-再生稻配套技術”4個方面。
    超高效液相色譜法分析稻米酚酸化合物組分及其含量
    張娜,王國祥,Abacar Jose Daniel,劉正輝,丁承強,唐設,李剛華,王紹華,丁艷鋒
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1718-1726.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.05
    摘要 ( 381 )   HTML ( 1 )   PDF (1074KB) ( 513 )   收藏
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    【目的】稻米酚酸化合物是天然抗氧化物的重要來源,本研究建立糙米和精米中酚酸化合物的超高效液相色譜的定性定量方法,并分析其在籽粒中的分布特征。【方法】以沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸、2-羥基肉桂酸和反式肉桂酸14種酚酸化合物標準品,對糙米和精米中酚酸進行定性和定量分析。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm-Micron),流動相為0.1%乙酸水溶液(A)/乙腈(B),柱溫30℃,流速為0.5 mL·min-1,采用梯度洗脫,洗脫程序為0—1 min,8%—10%B;1—2.5 min,10%—13%B;2.5—5.5 min,13%B;5.5—6 min,13%—21%B ;6—6.5 min,21%—27%B;6.5—7.5 min,27%—50%B;7.5—9 min,50%—100%B;9—12 min,100%B;12—12.5 min,100%—8%B。檢測波長為280和325 nm。【結果】14種酚酸在8 min內完全分離,經質譜鑒定,精米及糙米中檢測出的物質共有11種,分別是沒食子酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸和反式肉桂酸。可進行定量分析的酚酸共8種,分別是對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸和反式肉桂酸,線性范圍為5—220 μg·mL-1 (R2=0.9994—0.9999),檢出限為0.002—0.03 μg·mL-1,定量限為0.004—0.08 μg·mL-1,回收率為84.11%—114.43%。對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸和反式肉桂酸在精米和糙米中的含量差異顯著,其中對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸和反式肉桂酸集中存在于胚乳外層中,精米/糙米含量百分比變幅為4.52%—16.73%。而異阿魏酸在稻米籽粒中分布較均勻,其精米/糙米含量百分比達到45.86%。【結論】該方法簡便、快速、準確、可靠,不僅適合稻米中酚酸化合物的含量測定,而且對于其他谷物中酚酸化合物含量的測定也具有一定參考價值。
    氮素對灌漿期夏玉米葉片蛋白質表達的調控
    王祥宇,魏珊珊,董樹亭,劉鵬,張吉旺,趙斌
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1727-1736.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.06
    摘要 ( 325 )   HTML ( 6 )   PDF (810KB) ( 584 )   收藏
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    【目的】在大田生產條件下研究氮素對灌漿期玉米葉片蛋白質表達的調控。【方法】在大田生產條件下,以緊湊耐密型玉米雜交種登海618為試驗材料,研究施氮對玉米穗位葉花后凈光合速率、硝酸還原酶(NR)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量和可溶性蛋白含量的影響。采用TCA-丙酮沉淀法提取灌漿期(花后20 d)兩個施氮處理下玉米穗位葉總蛋白質,并用雙向凝膠電泳技術(2-DE)分離獲得蛋白質圖譜。采用ImageMaster-2D Elite 7.0圖像分析軟件對蛋白質圖譜進行比較,確定玉米葉片應答灌漿期施氮處理的差異蛋白點。通過MALDI-TOF/TOF MS質譜分析及NCBInr數據庫搜索,對差異表達蛋白質進行鑒定并分析其涉及的生物學功能。【結果】開花后,隨生育進程的推進,玉米穗位葉凈光合速率、葉綠素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均呈下降趨勢,而MDA含量則呈上升趨勢。相對于不施氮處理,施氮處理下葉片葉綠素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均顯著提高,而MDA含量則顯著下降。對灌漿期玉米葉片進行雙向電泳及圖譜分析,分別在施氮和不施氮條件下檢測出1 086和1 170個蛋白點。通過圖像分析軟件進行成對匹配分析,共得到29個顯著差異蛋白點。經質譜鑒定分析,29個顯著差異蛋白點中有25個被成功鑒定,鑒定成功的蛋白中除未知蛋白(蛋白點55)和30s核糖體蛋白(蛋白點1089)外,其余蛋白表達量均在施氮條件下上調。通過搜索NCBInr數據庫,差異表達的蛋白主要分為8類,包括13個能量相關蛋白,2個防御相關蛋白,2個蛋白合成相關蛋白,2個蛋白目的和儲存相關蛋白,1個細胞生長相關蛋白,1個次級代謝相關蛋白,1個轉運相關蛋白和3個未知蛋白。【結論】施氮對灌漿期玉米葉片光合能力、碳代謝能力、防御能力、蛋白合成能力、蛋白目的和儲存能力、以及次級代謝能力等均有顯著提升作用。
    植物保護
    苦豆子生物堿對番茄生長及果實品質的影響
    熊鑫,郭樹奇,李琳,馬志卿,張興
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1737-1746.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.07
    摘要 ( 384 )   HTML ( 4 )   PDF (601KB) ( 385 )   收藏
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    目的】通過測定植物源農藥苦豆子生物堿對番茄生長發育及果實品質的影響,探討苦豆子生物堿對番茄形態及發育的調控效應,全面了解苦豆子生物堿的生物學效應,為其科學合理使用提供依據。【方法】以番茄為供試植物,阿維菌素為對照藥劑,測定苦豆子生物堿不同濃度(333.0、166.5和111.0 mg·L-1)處理對番茄植株形態、果實產量及品質指標的影響。采用盆栽試驗測定苦豆子生物堿對番茄幼苗株高、莖粗、葉片總數、最大葉長和寬及葉綠素含量的影響;采用田間小區試驗測定苦豆子生物堿對番茄產量、可溶性糖含量、可滴定酸含量、維生素C含量和硝酸鹽含量的影響。【結果】苦豆子生物堿對番茄植株生長及果實品質具有明顯的調控作用。盆栽試驗結果表明,166.5 mg·L-1處理對番茄幼苗的刺激生長作用最為明顯,與空白對照(清水處理)相比,每次施藥后第7天,番茄的株高相對生長速率分別增加55.07%、103.03%和60.60%,莖粗凈增長量分別增加31.54%、225.80%和185.45%,但葉片形態無明顯變化;在333.0和166.5 mg·L-1濃度下,與空白對照相比,苦豆子生物堿處理后可使葉片葉綠素含量分別升高6.16%—13.79%和6.89%—17.12%,而111.0 mg·L-1濃度處理的番茄葉綠素含量較空白對照卻下降0.60%—9.40%。田間小區產量測定結果表明,333.0、166.5和111.0 mg·L-1的苦豆子生物堿處理后,與空白對照相比,番茄第一穗果實平均單果重分別增加13.07%、20.92%和9.15%,第二穗果實平均單果重與空白對照均無顯著差異,第三穗果實平均單果重分別增加12.23%、20.86%和17.27%;且166.5 mg?L-1濃度下,番茄前期產量較對照增加16.48%,而333.0和111.0 mg·L-1處理下,產量無顯著增加。田間小區試驗果實品質測定結果表明,在濃度為333.0和111.0 mg·L-1的苦豆子生物堿處理下,與空白對照相比,可溶性糖含量平均值明顯下降,而166.5 mg·L-1處理下可溶性糖含量與對照無顯著差異;在333.0、166.5和111.0 mg·L-1濃度下,可滴定酸含量平均值分別較空白對照增加37.01%、23.88%和27.16%;333.0、166.5 mg·L-1濃度的苦豆子生物堿處理后,與空白對照相比,番茄第一穗果實的維生素C含量分別下降28.06%和21.91%,第二穗分別下降27.37%和26.34%,而第三穗分別增加7.28%和7.69%,呈先降低后升高的趨勢,而111.0 mg·L-1濃度下,第一、二穗果實維生素C含量較空白對照顯著下降,第三穗果實維生素C含量與空白對照無顯著差異;苦豆子生物堿處理后番茄果實中硝酸鹽的含量與空白對照相比顯著增加,且濃度越高,硝酸鹽積累越多,但仍遠遠低于中國蔬菜硝酸鹽允許量。【結論】在田間常用濃度(166.5 mg·L-1) 下,苦豆子生物堿能夠在番茄營養期促進生長,生殖期促進果實增產,對果實品質無不利影響,作為一類新型、安全的植物源農藥,具有較好的開發應用前景。
    短時高溫暴露對褐飛虱存活和生殖特性的影響
    李干金,徐顯浩,張海亮,朱敏,崔旭紅
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1747-1755.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.08
    摘要 ( 225 )   HTML ( 1 )   PDF (424KB) ( 416 )   收藏
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    【目的】明確短時高溫暴露對褐飛虱成蟲存活和生殖特性的影響,為褐飛虱種群發生預測及防治提供理論依據。【方法】采集初羽化24 h內的褐飛虱成蟲,辨別雌、雄后放入平底玻璃管內,每管5對,置于水浴循環儀中進行高溫暴露處理,設置6個靶標溫度,分別為33、35、37、39、39.5和40℃,誤差范圍0.02℃。高溫處理時以25℃為起點溫度,然后以0.1℃/min的速度上升至靶標溫度,待靶標溫度恒定后,在靶標溫度下處理2 h。處理結束后,將褐飛虱轉移到25℃的人工培養箱中,1 h后觀察記錄其存活情況,以未經過高溫處理的褐飛虱成蟲為對照。隨后研究其存活率、產卵量及后代存活能力是否發生變化。【結果】33—37℃對褐飛虱雌、雄蟲的存活率均無顯著影響;而39—40℃下暴露2 h,雌、雄蟲的存活率顯著下降,其中39.5℃下暴露2 h,雌、雄蟲存活率均低于50%,40℃下暴露2 h,雌、雄蟲存活率僅為4.5%—6.7%,且成蟲存活時間不足24 h;不同高溫暴露2 h后,褐飛虱雄成蟲逐日存活率曲線坡度較雌成蟲陡;在35—39.5℃范圍內暴露2 h,褐飛虱的產卵前期有所延長,尤其在39.5℃下暴露2 h,每頭褐飛虱雌蟲的平均產卵前期達6.3 d,與對照(25℃)的產卵前期3.5 d達到極顯著差異水平(P<0.01);在35和39℃暴露2 h,產卵前期顯著延長,分別達到4.4和4.4 d(P<0.05);高溫暴露對褐飛虱雌成蟲產卵量也有明顯的影響,33、35、37、39及39.5℃分別暴露2 h,每雌產卵量顯著從25℃的365.5粒下降至165.4、194.6、146.7、301.6和234.7粒(P<0.05);高溫暴露對褐飛虱后代孵化率和性比均無顯著影響,但對其后代總存活率有著顯著的影響,隨著溫度上升,F1代若蟲總存活率由對照(25℃)的80.4%下降至61.8%—75.5%;褐飛虱成蟲在33—39.5℃高溫下暴露2 h,其F1代若蟲總存活率比對照均下降,而除35℃(75.5%)外,其他溫度暴露后,均與對照存在顯著差異(P<0.05),40℃下褐飛虱停止產卵活動。此外,高溫暴露還能使褐飛虱的產卵節律和孵化節律發生變化,經39.5℃高溫暴露2 h后,較33、35、37和39℃高溫處理及對照的產卵高峰期和后代的孵化高峰期推遲。【結論】在39—40℃高溫暴露下,褐飛虱成蟲存活及產卵量和后代總存活能力顯著下降,39℃及以上高溫對褐飛虱存活與生殖具有一定的威脅。
    呋蟲胺在有機溶劑和水中的手性穩定性
    陳增龍,陳秀,董豐收,劉新剛,徐軍,鄭永權
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1756-1763.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.09
    摘要 ( 396 )   HTML ( 1 )   PDF (466KB) ( 479 )   收藏
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    【目的】在人工氙燈光照、室內自然光照和避光培養條件下,探究呋蟲胺外消旋體(Rac-呋蟲胺)及其對映體(S-呋蟲胺和R-呋蟲胺)在甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、超純水以及β-環糊精水溶液中的手性穩定性,為大宗用量的手性新煙堿類殺蟲劑呋蟲胺的準確檢測分析、藥效和環境安全的正確評價提供依據。【方法】培養周期內分段取樣,以直鏈淀粉-三(3, 5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為手性固定相,正己烷/甲醇/乙醇(85/10/5, v/v/v)為流動相,柱溫為30℃,流速為1.0 mL?min-1,紫外檢測波長為270 nm,進樣量為20 µL,高效液相色譜/二極管陣列檢測器(HPLC/DAD)進行分離分析,S-呋蟲胺和R-呋蟲胺的保留時間分別為8.3和9.7 min。外標法定量。【結果】人工氙燈光照、室內自然光照和避光培養條件下,S-呋蟲胺和R-呋蟲胺在甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、超純水以及β-環糊精水溶液中均不存在相互轉化現象;配對樣品t-test分析Rac-呋蟲胺在每種溶劑中兩個對映體的降解殘留量,證實無對映體選擇性降解。對映體濃度比值(EF值)為0.4746—0.5116。但在人工氙燈光照下,Rac-呋蟲胺、S-呋蟲胺和R-呋蟲胺迅速降解,順序為二氯甲烷>乙腈>乙酸乙酯≈異丙醇≈乙醇>甲醇>超純水>β-環糊精水溶液。相比水溶液,呋蟲胺在有機溶劑中更容易降解,半衰期分別為3.3—3.6 h和1.2—2.3 h。光解動態符合一級動力學模型,相關系數為0.9550—0.9959。室內自然光照與避光培養條件下,Rac-呋蟲胺、S-呋蟲胺和R-呋蟲胺在二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇、乙醇、甲醇、超純水和β-環糊精水溶液中無明顯降解,實測濃度和相對標準偏差分別為9.5—10.4 mg?L-1,1.0%—3.2%和9.5—10.5 mg?L-1,1.4%—2.8%。【結論】在(25±2)℃人工氙燈光照、室內自然光照和避光條件下,呋蟲胺在甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、超純水以及β-環糊精水溶液中手性構型穩定,在此條件下進行定性定量分析、藥效和環境安全評價是準確的。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    耕作措施對東北黑土微生物呼吸的影響
    賈淑霞,孫冰潔,梁愛珍,陳學文,張士秀,魏守才,劉四義,陳升龍,張曉平
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1764-1773.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.10
    摘要 ( 306 )   HTML ( 1 )   PDF (467KB) ( 485 )   收藏
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    【目的】利用東北黑土13年保護性耕作定位試驗,研究耕作措施(免耕和秋翻處理)對土壤微生物的影響,從土壤微生物角度分析免耕是否有利于土壤有機碳(SOC)的固定,為合理評價農田黑土碳“源”與“匯”功能提供科學依據。【方法】以連作玉米為研究對象,采用單因素隨機區組設計,耕作處理包括免耕和秋翻。免耕除播種外不擾動土壤,秸稈覆蓋地表。秋翻處理的田間管理包括人工除草、中耕起壟和秋翻,秋翻時將秸稈翻于地表之下。土壤微生物呼吸速率通過PVC環在野外采用動態氣室法(Li-Cor8100)直接測定(去除植物根系),定期監測土壤微生物呼吸速率的季節變化,并在土壤微生物呼吸速率最高的季節取樣分析不同處理土壤微生物量碳和數量特征。【結果】生長季節內免耕和秋翻處理下土壤微生物呼吸速率分別為0.42—3.35和0.48—3.24 μmolCO2·m-2·s-1,兩處理平均值差異不顯著(8.8%),但土壤累積CO2-C釋放量免耕比秋翻高10.0%(2012)和4.3%(2013)(P<0.05)。免耕顯著地增加0—5 cm表層土壤細菌、真菌和放線菌的數量,分別比秋翻高125.7%、112.4%和53.3%;還顯著地增加了其他土層的真菌數量,分別為105.3%(5—10 cm),159.4%(10—20 cm)和114.7%(20—30 cm)。耕作處理影響土壤溫度,主要體現在春季,秋翻(0—5 cm,5—10 cm)春季(6月)土壤溫度比免耕分別高2.8%和5.8%。土壤微生物呼吸速率表現出顯著的季節變化規律,與土壤溫度具有相似的動態變化,夏季(7、8月份)最高,秋季較低。盡管耕作處理沒有明顯地影響土壤微生物呼吸速率的季節動態格局,但秋翻的土壤微生物呼吸最高值比免耕晚半個月。土壤微生物呼吸速率隨土壤溫度(5 cm和10 cm)呈指數型增長,10 cm處的回歸模型明顯好于5 cm。耕作處理只改變了5 cm的Q10值,免耕比秋翻高10.8%。土壤微生物呼吸速率與土壤溫度、水分混合回歸模型能更好地反應其變化規律,解釋土壤微生物呼吸速率變異的65%(秋翻)和81%(免耕)。【結論】免耕增加了表層(0—5 cm)的SOC含量,從而使得該土層的土壤微生物量碳和活性增加,但是由于免耕處理增加0—30 cm 土層SOC含量的加權平均值,因此相對于傳統的耕作措施(秋翻),免耕有利于SOC含量的增加。
    填閑種植對棚室菜田累積氮素消減及黃瓜生長的影響
    彭亞靜,郝曉然,吉艷芝,王琳,任翠蓮,巨曉棠,張麗娟
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1774-1784.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.11
    摘要 ( 252 )   HTML ( 1 )   PDF (464KB) ( 292 )   收藏
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    【目的】在中國集約化蔬菜種植區,傳統的高水肥投入導致土壤氮素大量累積,致使氮素淋洗到土壤深層或進入地下水,造成地下水硝酸鹽污染。種植填閑作物可控制和減少土壤深層硝態氮的累積,因此,本研究探討不同填閑作物種類對消減土壤剖面累積硝態氮及下季作物生長的影響,篩選出適宜的填閑作物種類。【方法】以華北平原傳統棚室黃瓜菜田為對象,在蔬菜休閑期通過種植深根型填閑作物,利用其根系發達、生長迅速、吸氮量大的特點,促使土層中硝態氮大量消耗,以消減土壤剖面根層NO3--N累積和降低土壤剖面NO3--N淋失。以此為目標,設置甜玉米、莧菜、甜高粱及休閑田間小區試驗,采集測定土壤、植株及根系樣品,分析不同填閑作物的消減效果。【結果】在這3種填閑作物中,甜玉米的生物量和吸氮量最大,整體根長密度大于其它填閑種類。從對土壤剖面NO3--N的消減能力來說,甜玉米的消減能力最高。2008、2009及2010年,甜玉米對0—200 cm土層土壤NO3--N的消減量分別為153.8、605.7和56.3 kg·hm-2。3年休閑期后,第一季前茬休閑處理的黃瓜產量、生物量及吸氮量均最高,在產量、吸氮量上與其他處理差異顯著;第二季、第三季,前茬休閑的產量、生物量和吸氮量與其他處理差異不顯著;填閑作物的種植并沒有對黃瓜產量造成影響,并且黃瓜收獲后土壤NO3--N含量明顯降低。氮素表觀平衡中0—200 cm土層,甜玉米-黃瓜的氮素虧缺量較大,說明甜玉米能顯著降低土壤NO3--N的殘留。種植填閑作物能夠達到經濟效益和生態效益的雙贏,甜玉米、莧菜與甜高粱可分別為農民帶來39 467、497和16 522元/hm2的凈收入。【結論】棚室菜田夏季種植填閑作物不僅可以消減土壤剖面根層NO3--N累積,而且對下茬黃瓜產量未造成顯著影響,黃瓜收獲后土壤NO3--N含量也會明顯降低;在設施蔬菜輪作體系中引入填閑作物具有可行性,甜玉米為較佳的填閑作物。
    園藝
    中國主栽葡萄柚果肉酚類物質組成及其抗氧化活性
    張桂偉,張秋云,江東,席萬鵬,周志欽
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1785-1794.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.12
    摘要 ( 398 )   HTML ( 1 )   PDF (1031KB) ( 1050 )   收藏
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    【目的】對不同品種葡萄柚(Citrus paradis Macfad.)的酚類物質組成及其抗氧化能力進行比較研究,為柑橘育種及葡萄柚資源的利用提供科學依據。【方法】以中國主栽的9個葡萄柚品種為材料,使用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法檢測分析各品種果肉酚類物質的組成、含量與分布情況,用自由基清除(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals, DPPH)、鐵離子還原(ferricreducing antioxidant power, FRAP)和自由基抗氧化(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid, ABTS)3種方法對各品種果肉提取物的總抗氧化活性進行評價,并使用相關系數法分析抗氧化能力與多酚含量的相關性。【結果】結果表明,供試葡萄柚總酚含量變異范圍為6.93—21.18 mg·g-1 DW,‘四倍體馬敘’葡萄柚的總酚含量最高;總黃酮含量變異范圍為5.56—23.24 mg·g-1 DW,‘四倍體馬敘’的總黃酮含量最高。葡萄柚中的黃烷酮以柚皮苷和新橙皮苷為主,柚皮苷含量變異范圍為1 180.58—3 065.33 μg·g-1 DW,‘火焰’葡萄柚的柚皮苷含量最高,新橙皮苷含量變異范圍為94.05—637.24 μg·g-1 DW,‘雞尾’葡萄柚的新橙皮苷含量最高。多甲氧基黃酮以橘皮素為主,其變異范圍在0.56—4.66 μg·g-1 DW之間,‘奧羅勃朗卡’的橘皮素含量最高。酚酸以沒食子酸為主,其變異范圍為60.42—385.53 μg·g-1 DW,‘四倍體馬敘’沒食子酸含量最高。‘雞尾’含有豐富的圣草次苷(111.23 μg·g-1 DW),‘馬敘’含有豐富的橙皮苷(130.90 μg·g-1 DW),‘火焰’‘瑞紅’‘四倍體馬敘’和‘紅馬敘’含有豐富的沒食子酸(>300 μg·g-1 DW),‘雞尾’含有豐富的綠原酸、咖啡酸和阿魏酸。供試葡萄柚的綜合抗氧化指數(an overall antioxidant potency composite index, APCI)變異范圍大,在36.70—97.50之間,除‘奧羅勃朗卡’和‘雞尾’外,其他葡萄柚的APCI都比較高(>80)。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素、橘皮素和綠原酸與果實抗氧化能力呈顯著的正相關關系。【結論】中國主栽的9個葡萄柚品種多酚含量豐富,變異范圍大,具有明顯的組成和含量特點。柚皮苷、橘皮素和沒食子酸是中國主栽葡萄柚的主要多酚類物質,各品種間多酚類物質的含量差異較大,抗氧化能力也有明顯差異。‘火焰’‘瑞紅’‘四倍體馬敘’和‘紅馬敘’是沒食子酸的良好來源,而‘雞尾’是綠原酸、咖啡酸和阿魏酸的良好來源。總體上,在這些供試葡萄柚品種中,‘粉紅湯姆遜’‘馬敘’‘火焰’‘瑞紅’‘四倍體馬敘’和‘紅馬敘’不僅多酚含量極其豐富,而且抗氧化能力也高,是具有良好開發前景的天然抗氧化劑和保健食品及生物藥品基料。
    基于SRAP標記的國蘭種質資源遺傳多樣性分析及分子身份證構建
    唐源江,曹雯靜,吳坤林
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1795-1806.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.13
    摘要 ( 385 )   HTML ( 1 )   PDF (6043KB) ( 672 )   收藏
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    【目的】探究國蘭種質資源遺傳多樣性水平,并構建分子指紋圖譜及分子身份證,為在分子水平上鑒定國蘭種質提供技術支撐,也為國蘭種質資源開發、保存利用及種質創新奠定基礎。【方法】以收集于華南及鄰近地區的139份國蘭栽培品種和野生種質為材料,采用改良的CTAB法提取基因組DNA,由13條正向引物和16條反向引物隨機組成208對SRAP引物,每對引物用品種‘宋梅’和‘大勛’擴增產物進行篩選;PCR擴增產物應用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳膠圖進行人工讀帶,并計算多態性引物的總擴增條帶數、多態性條帶數和多態性條帶比率。按照Botstein公式計算多態信息含量;用POPGENE32軟件計算觀測等位基因數、有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數、Shannon’s信息指數,并進行遺傳多樣性分析。用NTSYS-pc2.10e軟件UPGMA方法進行聚類分析,并計算遺傳相似性系數。采用引物對組合的方法,構建139份國蘭種質資源數字指紋圖譜。【結果】從208對SRAP引物中共篩選出17對多態性好且重復性高的引物,對供試材料進行PCR擴增,共擴增出DNA條帶489條,其中多態性譜帶484條,多態性比率(PPB)為98.89%,觀測等位基因數平均值為2.00,多態性信息含量平均值為0.94,每個位點的有效等位基因數平均值為1.49,Nei’s基因多樣多樣性指數平均值為0.30,Shannon信息指數平均值為0.45。UPGMA聚類分析表明,139份國蘭種質資源的遺傳相似系數變化范圍為0.51—0.91。在相似系數為0.70時,可劃分為6個類群。用SRAP多種引物組合方法可有效區分所有材料,并構建出139份國蘭種質資源特異性分子身份證,置信概率達到99.99%。根據聚類結果可以將國蘭種質分為4組:一為春蘭組,由春蘭種質單獨構成;二為建墨蘭組,主要由建蘭和墨蘭種質組成;三為寒蕙蘭組,主要由寒蘭、蕙蘭和雜交系組成;四為劍蓮蘭組,由春劍和蓮瓣蘭種質組成。而四組之間劍蓮蘭組與寒蕙蘭組親緣關系最近,與建墨蘭組次之,與春蘭組親緣關系較遠。【結論】所試國蘭種質具有較豐富的遺傳多樣性水平,基于17對SRAP引物組合所構建的139份國蘭種質的分子身份識別體系具有唯一性和高效性,SRAP標記是在分子水平鑒定國蘭種質的有效方法之一。
    貯藏·保鮮·加工
    大米小包裝儲藏過程中脂類及微觀結構的變化
    王立峰,陳超,楊精華,陳靜宜,汪海峰,鞠興榮
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1807-1817.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.14
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    【目的】由于胚乳失去保護,大米在儲藏過程中易發生陳化、霉變等問題,致使其品質劣變甚至喪失食用價值。通過測定儲藏過程中大米游離脂肪酸、總酸含量、脂肪酸組成和含量,觀察大米橫斷面胚乳細胞、淀粉顆粒微觀結構,探討大米品質劣變原因,為大米儲藏技術提供參考。【方法】以粳稻99號大米為對象,進行人工模擬儲藏試驗:采用編織袋、自然密閉缺氧、抽真空3種包裝方式,置于溫度為15、25和30℃(60%濕度)的人工氣候箱中儲藏180 d,每個月進行一次品質指標測定;測定大米儲藏過程中脂肪酸值、總酸值的變化,利用氣相色譜分析脂肪酸組成及含量變化,利用掃描電鏡觀察大米橫斷面胚乳細胞形態,探索脂類及橫斷面胚乳結構導致大米品質陳化的機理及品質劣變后淀粉顆粒微觀形態的變化規律。【結果】①儲藏過程中,編織袋及自然密閉缺氧包裝的大米游離脂肪酸及總酸含量皆呈現急劇上升趨勢,當品質劣變嚴重時兩者含量反而下降;抽真空包裝的大米游離脂肪酸及總酸含量均保持在較穩定的水平,且儲藏溫度對其含量影響不顯著;②脂肪酸組成中含量最多的是亞油酸、油酸和棕櫚酸,這3種脂肪酸含量占總脂肪90%以上。包裝方式及儲藏溫度對各脂肪酸組成影響不同。除了花生酸(C20:0)及二十二烯酸(C22:1)外,其余脂肪酸受包裝方式影響較大;而儲藏溫度僅與豆蔻酸(C14:0)和山崳酸(C22:0)有顯著性關系,對其余脂肪酸影響不大。脂肪酸變化規律符合:高不飽和脂肪酸含量隨溫度升高而降低,多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸間呈現顯著負相關,具體表現為硬脂酸(C18:0)與亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3);油酸(C18:1)與亞油酸、亞麻酸皆呈現明顯的“此消彼長”現象。③新鮮大米淀粉粒以復粒形式存在,形狀較大,表面有較厚的膜,排列整齊有序,兩側以片狀的細胞間斷面居多,放射狀結構清晰可見。陳化加劇的大米胚乳細胞橫斷面結構松散無序,細胞內斷面多于細胞間斷面,橫斷面上可觀測到“小孔”及一些分散在淀粉體周圍的蛋白體和脂肪滴;細胞壁的完整性受到破壞致使復粒崩解并可見大量單粒細胞,一部分單淀粉粒形狀近圓型,棱角較鈍;細胞間的棱角模糊,放射狀結構變得模糊甚至消失。【結論】編織袋及自然密閉缺氧包裝的大米陳化劣變較為嚴重,儲藏過程中其脂肪酸值、總酸值急劇上升后下降,胚乳表面光滑度變差、小孔數量及表面蛋白質膜的翹起變多,輻射狀趨勢漸漸消失。抽真空包裝可以有效延緩大米品質劣變進程。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    POMC在不同毛色綿羊皮膚中的表達與定位
    馬淑慧,李亞楠,赫曉燕,王海東,楊磊,董常生
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1818-1824.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.15
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    【目的】對不同毛色綿羊皮膚中的阿黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)進行定位和表達差異分析,確定POMC與毛色形成的關系,進一步豐富有關哺乳動物毛色形成機制的理論知識。【方法】選取年齡相近的雄性黑色和白色成年綿羊各3只,用取皮器分別在臀部采集皮膚組織3塊,對其中一塊制作石蠟切片后采用免疫組織化學法確定POMC在不同綿羊皮膚中的定位,另兩塊置于液氮中凍存后分別提取皮膚總RNA和總蛋白,總RNA經反轉錄成cDNA后,經NCBI分析比對后設計POMC特異性PCR引物,采用QRT-PCR方法檢測POMC基因在mRNA水平的表達差異;總蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳后,采用Western blotting方法加入POMC多克隆抗體檢測POMC在蛋白水平的表達差異,得出的數據用SPSS19.0軟件進行差異顯著性分析,探討POMC對毛色形成機制的調控作用。【結果】免疫組織化學結果顯示POMC在黑色和白色綿羊皮膚中均有表達,且表達部位都位于毛囊根鞘周圍和表皮的皮膚角質形成層細胞內;QRT-PCR結果顯示POMC在黑色綿羊皮膚中mRNA的相對表達量為2.5004±0.2577**,而在白色綿羊皮膚中POMC的mRNA的相對表達量為1.0032±0.0350,黑色綿羊皮膚中POMC的mRNA的相對表達量為白色綿羊皮膚的2.5倍,二者表達差異極顯著(P<0.01);Western boltting結果顯示黑色綿羊皮膚POMC蛋白水平相對表達量為1.5253±0.0426*,而白色皮膚中POMC蛋白水平相對表達量為1.0005±0.0180,黑色皮膚POMC蛋白表達量是白色皮膚的1.55倍(P<0.05),兩者差異顯著。【結論】試驗表明POMC可在黑色和白色綿羊皮膚中正常表達,且其表達位置一致,但POMC在不同毛色綿羊皮膚組織中mRNA和蛋白的表達水平存在一定的差異,表明POMC的表達量變化會在一定程度上影響毛色的生成。
    鋅對5—15周齡鵝免疫、抗氧化功能、金屬硫蛋白-Ⅰ基因表達量的影響及變量相關性分析
    王寶維,陳苗璐,王秉翰,張名愛,葛文華,程凡升,岳斌
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1825-1835.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.16
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    【目的】研究不同水平鋅對5—15周齡鵝免疫抗氧化功能與金屬硫蛋白-MT-I )mRNA表達量的影響及相互關系,以科學地確定鵝飼糧中鋅的需要量。【方法】試驗隨機選用29日齡體重相近的青農灰鵝360只(P<0.05),設計6個處理,每處理6次重復,每重復10只(公母各半);各處理飼糧中鋅水平分別為:27.46(Ⅰ組)、77.46(Ⅱ組)、127.46(Ⅲ組)、177.46(Ⅳ組)、227.46(Ⅴ組)、277.46 (Ⅵ組)mg·kg-1(基礎飼糧中含鋅),試驗進行11周。【結果】(1)胸腺指數、脾臟指數和法氏囊指數受飼糧中鋅水平的影響,隨鋅水平的升高呈現先升高后降低趨勢;當鋅水平為127.46 mg·kg-1時,胸腺指數最高(P<0.05);當鋅水平為77.46 mg·kg-1時,脾臟指數、法氏囊指數最高(P<0.05)。(2)飼糧鋅水平為177.46 mg·kg-1時,鵝副黏病毒疫苗免疫后7日的抗體滴度最高(P<0.05);飼糧鋅水平為157.41 mg·kg-1時,鵝副黏病毒疫苗免疫后14日的抗體滴度最高(P<0.05)。(3)當飼糧鋅水平為153.84 mg·kg-1時,鵝血清和肝臟總抗氧化能力(T-AOC)活性最高(P<0.01);當飼糧中含鋅127.46 mg·kg-1時,血清和肝臟過氧化氫酶(CAT)活性最高(P<0.01);當飼糧鋅水平為148.33 mg·kg-1時,鵝血清和肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性最高(P<0.05);當飼糧中含鋅148.33 mg·kg-1時,血清和肝臟銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性最高(P<0.01);當飼糧中鋅水平為177.46 mg·kg-1時,血清和肝臟中丙二醛(MDA)最低(P<0.05)。(4)飼糧中鋅能顯著提高MT-I mRNA表達量(P<0.05),當飼糧中鋅水平為177.46 mg·kg-1時,肝臟MT-I mRNA表達量最高(P<0.01)。(5)肝臟中MT-I mRNA表達量與肝臟中T-AOC(r= 0.94)、CuZn-SOD(r= 0.97)活性指標呈極顯著性正相關(P<0.01),與CAT(r= 0.85)、GSH-Px(r= 0.89)活性呈顯著正相關(P<0.05),與MDA呈負相關(r= -0.70, P>0.05);肝臟中MT-I mRNA表達量與血清中T-AOC (r= 0.99)、CAT(r= 0.92)和CuZn-SOD(r= 0.94)活性均呈極顯著正相關(P<0.01),與GSH-Px呈正相關(r= 0.81, P>0.05),與MDA呈負相關(r= -0.39, P>0.05)。【結論】(1)飼糧中適宜水平鋅能夠促進鵝免疫器官發育,增強T-AOC、CAT、GSH-Px、CuZn-SOD抗氧化酶活性,降低MDA水平。(2)飼糧中鋅能夠干預肝臟MT-I mRNA表達量,從而調節機體抗氧化能力。(3)鵝飼糧中鋅水平在77—150 mg·kg-1范圍內機體處于高位免疫和抗氧化狀態。
    禽呼腸孤病毒σ3基因在煙草中的表達與鑒定
    王盛,謝芝勛,黃莉,謝麗基,鄧顯文,謝志勤,劉加波,羅思思,曾婷婷
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1836-1844.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.17
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    【目的】研究禽呼腸孤病毒S1基因編碼的σ3基因在煙草中的表達及其表達產物的反應原性。【方法】根據GenBank中公布的禽呼腸孤毒株S1133的基因序列,設計特異引物擴增σ3基因,構建重組植物表達載體pBI121-σ3,熱激法轉化農桿菌EHA105感受態細胞,篩選含有重組質粒的pBI121-σ3的陽性工程菌株EHA105。采用農桿菌介導的葉盤法轉化野生型煙草,卡那霉素篩選獲得抗性植株。隨后通過σ3基因的特異引物,PCR方法初步篩選獲得轉σ3基因的煙草植株。進一步對陽性植株通過實時熒光定量PCR方法檢測σ3基因在轉基因煙草中的拷貝數,以煙草自身單拷貝的內源基因核糖核酸還原酶-RNR2作為內參基因,通過梯度稀釋分別構建RNR2及σ3基因的起始模板量和對應CT值的標準曲線,通過檢測樣品中σ3基因和RNR2基因模板量對數值的比值估算出σ3基因在轉基因煙草中的拷貝數。并通過Western-blotting方法對轉基因煙草中表達的σ3融合蛋白的反應原性進行分析。【結果】①通過雙酶切和測序驗證表明σ3基因插入位置、大小和讀碼框均正確,表明σ3基因已經成功的構建于植物表達載體pBI121的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子的下游,以NOS為終止子,含有卡那霉素抗性標記(NPT II)。其表達的蛋白與下游的綠色熒光蛋白形成融合蛋白,其大小約為61.6 ku;②在轉化篩選抗性植株的過程中采用350 mg·L-1的頭孢霉素可以很好地抑制農桿菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素篩選壓力能夠很好地抑制非轉化細胞的生長;③隨機選取10株轉化煙草進行PCR檢測發現8株轉化煙草可以擴增到清晰的目的條帶約994 bp;④內參基因RNR2的標準曲線為y=-3.5352x+15.143,σ3基因的標準曲線為y=-3.5366x+1.8265,兩個標準曲線的相關系數均接近于1。在檢測的5株轉化煙草中σ3基因的拷貝數均為4,陰性對照沒有擴增。⑤Western-blotting顯示σ3融合蛋白在轉化煙草中可以正確表達,目的條帶大小約為61.6 kD,與預計大小一致;σ3融合蛋白能夠與禽呼腸孤病毒的陽性血清發生特異反應,表明該融合蛋白具有良好的反應原性。【結論】成功地構建了植物表達載體pBI121-σ3,篩選獲得低拷貝的轉σ3基因的煙草,σ3融合蛋白能夠在煙草中表達且具有相應的反應原性,為進一步研究σ3基因的功能和利用植物作為生物反應器生產σ3蛋白口服疫苗的研發奠定了基礎。
    蠶用益生芽孢桿菌SWL-19的篩選鑒定及其對腸道菌群多樣性的影響
    李冠楠,夏雪娟,SENDEGEYA Parfait,何石寶,郭東東,朱勇
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1845-1853.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.18
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    目的篩選對家蠶(Bombyx mori)具有益生作用的芽孢桿菌,改善家蠶腸道微環境,促進蠶業生產的發展。【方法】采用高溫選育法對家蠶腸道內的芽孢桿菌進行初篩;以產胞外消化酶(蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶)及能在腸道定殖為基礎,結合溶血試驗、抗生素藥敏試驗和產消化酶能力大小等對芽孢桿菌進行復篩。通過形態、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定菌種,再利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術檢測其在家蠶腸道內定殖情況及其對腸道內微生物菌群多樣性的影響。【結果】共從57株細菌中篩選出兩株能同時產蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶且不產生溶血現象的芽孢桿菌SWL-17和SWL-19。14種抗生素藥敏紙片檢測結果表明,二者對絕大多數抗生素敏感,且敏感程度基本相同。除SWL-19不能利用蔗糖發酵外,兩個株菌的革蘭氏染色、芽孢染色、產酸產氣、檸檬酸利用、葡萄糖發酵、硝酸鹽還原和V-P等生理生化特性均相同。二者生長速度相同,但菌落形態特征差異較大。SWL-17的菌落形態為淡黃色,圓形隆起,表面光滑濕潤,邊緣整齊,而SWL-19的菌落形態為乳白色不透明,表面扁平干燥,邊緣不整齊。SWL-17產蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶的能力分別為(1.62±0.04)、(2.12±0.11)、(1.87±0.03)和(1.43±0.03),SWL-19的產酶能力分別為(2.91±0.05)、(2.43±0.04)、(3.24±0.12)和(3.48±0.10)。因此SWL-19具有較高的產消化酶能力,且除脂肪酶外,其產蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶的能力均顯著性高于SWL-17(P<0.05)。細菌16S rDNA序列比對和系統發育分析表明SWL-17和SWL-19分別為芽孢桿菌(Bacillus sp.)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis),且SWL-19具有更清楚的遺傳背景,適于進行后續試驗。進一步DGGE試驗結果表明,自然條件下家蠶腸道內的優勢菌群為腸球菌屬(Enterococcus)細菌,而外源性添加菌株SWL-19后能使家蠶腸道內的芽孢桿菌屬和腸桿菌屬細菌成為優勢菌群,說明芽孢桿菌SWL-19能在家蠶腸道內定殖,并且能改變家蠶腸道內微生物菌群的結構和多樣性。【結論】家蠶益生芽孢桿菌的篩選為研發蠶用復合微生態制劑提供菌株資源,在蠶業生產上具有重要的應用價值。
    研究簡報
    基于順序GISH-FISH花生栽培種的染色體分析
    杜培,劉華,李麗娜,秦利,張忠信,黃冰艷,董文召,湯豐收,亓增軍,張新友
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1854-1863.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.19
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    【目的】針對花生染色體較小,染色體細胞學標記少,細胞遺傳研究相對滯后,染色體分類識別困難的問題,建立能夠準確區分栽培花生(Arachis hypogaea L.,2n=4x=40,AABB)A、B染色體組的新核型,提高染色體識別準確率,以揭示栽培花生和野生供體親本的染色體對應關系,鑒定栽培種花生染色體結構變異體。【方法】以花生栽培種(Arachis hypogaea L.,2n=4x=40,AABB)的2個可能供體親本即花生野生種Arachis duranensis(2n=2x=20,BB)和Arachis ipaënsis(2n=2x=20,AA)全基因組DNA及5S rDNA和45S rDNA為探針,利用順序基因組熒光原位雜交(GISH)和多色熒光原位雜交(McFISH)技術(簡稱順序GISH-FISH)結合DAPI染色,在準確區分花生栽培種A、B染色體組的基礎上,對花生栽培品種Z5163及其供體親本染色體進行分析,建立花生栽培種新核型,并利用該核型對其他栽培品種的染色體進行分析,以探討該核型的應用潛力和栽培花生染色體組成特點。【結果】以A. ipaënsisA.duranensis全基因組DNA為探針的GISH分析表明,以A. ipaënsis為探針在花生栽培種20條B組染色體上能夠產生清晰穩定的雜交信號,在A組染色體上沒有信號,而以A.duranensis為探針,只在18條A組染色體能產生信號,但1對A組的小染色體“A染色體”不易被區分,因此,以A. ipaënsis為探針可以準確區分花生栽培種A、B染色體組;綜合5S rDNA和45S rDNA Mc-FISH和DAPI染色分析,發現花生栽培種A、B染色體組DAPI帶紋、5S rDNA和45S rDNA的分布分別與A.duranensisA. ipaënsis一致,此結果支持A.duranensisA.ipaënsis是花生栽培種的供體親本。DAPI染色結果顯示,A. ipaënsis及花生栽培種B組染色體均有14條染色體顯示著絲粒帶紋,明顯多于前人報道,表明僅利用DAPI染色來區分花生栽培種A、B組染色體的方法具有局限性。綜合DAPI染色、rDNA、A.duranensisA. ipaënsis基因組探針進行順序GISH-FISH分析,建立了可以準確識別花生栽培種A、B染色體組新核型。然后利用該核型對3個栽培種品種的染色體組成進行了分析,首次發現一個自發的花生染色體代換系MS B1(A1),揭示了栽培花生染色體B1與A1之間存在部分同源關系。【結論】野生花生A. duranensisA. ipaënsis分別與栽培花生A和B基因組染色體間具有很好的對應關系;研究建立的基于GISH-FISH和DAPI染色的栽培花生新核型,不但可以準確區分大部分A、B組染色體,而且還能識別栽培花生在多倍體化和人工進化過程中可能存在的自發的染色體變異,揭示A、B組染色體間的部分同源性。
    不同抗倒性甜蕎莖稈木質素合成關鍵酶基因的表達分析
    胡丹,劉星貝,汪燦,楊浩,李鶴鑫,阮仁武,袁曉輝,易澤林
    中國農業科學. 2015, 48(9):  1864-1872.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.20
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    【目的】測定不同抗倒伏能力甜蕎品種在不同時期的莖稈木質素含量及其相關合成酶基因表達量,探討甜蕎莖稈木質素合成積累的關鍵時期及其關鍵酶基因,為甜蕎抗倒伏育種提供理論依據。【方法】用簡并引物擴增得到基因CADCCRF5HCOMTCCOAOMT的部分CDS序列,在NCBI數據庫中進行比對分析;用紫外分光光度法測定4個不同抗倒性甜蕎品種在分枝期、盛花期和乳熟期莖稈基部第2節間木質素含量;用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法分析木質素合成途徑中9個相關基因PAL4CLC4HC3HCADCCRF5HCOMTCCOAOMT的表達,用2-△△CT法計算其相對表達量。用Microsoft Excel 2003整理數據和作圖,用SPSS 19軟件進行方差分析和相關性分析。【結果】擴增得到CADCCRF5HCOMTCCOAOMT的CDS序列可用于設計后續熒光定量引物。甜蕎莖稈木質素含量從分枝期到乳熟期逐漸增加,不同抗倒性品種間,高抗倒伏品種木質素含量在各個時期均顯著高于易倒伏品種。基因PAL4CLC4HCCR表達量在品種間和時期間均差異顯著或極顯著,CCOAOMT在品種間不顯著,時期間顯著,F5H在品種間差異顯著,時期間不顯著,C3HCADCOMT在品種和時期間差異均不顯著。從分枝期到乳熟期,各品種的PAL4CLC4HCADCCOAOMTF5HCCR表達量均先增后減,在盛花期達最大值,高抗倒伏品種表達量顯著高于易倒伏品種;從分枝期到盛花期COMT表達量逐漸下降,易倒伏品種表達量顯著高于高抗倒伏品種,乳熟期高抗倒伏品種顯著高于易倒伏品種;從分枝期到乳熟期C3H表達量無明顯變化規律。木質素含量與PAL4CLC4HCCOAOMTCADCCR基因表達量呈顯著正相關,與C3H呈負相關,與COMT在分枝期和盛花期呈負相關,乳熟期呈正相關,與F5H呈正相關。【結論】木質素含量與甜蕎莖稈倒伏密切相關,抗倒伏能力強的甜蕎品種其莖稈木質素含量高;盛花期是甜蕎莖稈木質素合成積累的關鍵時期;PAL4CLC4HCADCCOAOMTCCR是甜蕎莖稈木質素合成的關鍵酶基因。
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