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當期目錄

    2015年 第48卷 第11期 刊出日期:2015-06-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    水稻長護穎突變體基因的克隆與表達分析
    朱玲,陳曉瓊,杜康兮,韓保林,冉秀華,張紅宇,徐培洲,吳先軍
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2085-2095.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.001
    摘要 ( 325 )   HTML ( 3 )   PDF (3064KB) ( 416 )   收藏
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    【目的】利用EMS對水稻(Oryza sativa L.)保持系品種宜香1B進行誘變,篩選出3份長護穎突變體。通過基因定位和克隆,探明控制該性狀的遺傳基礎以及分子機理,并在不同器官進行表達分析,了解該基因表達特點。【方法】以3份水稻長護穎突變體Oslg-1Oslg-2Oslg-3為材料,進行表型分析、等位性鑒定、基因定位、生物信息學分析,以及qRT-PCR定量表達分析。【結果】Oslg-1突變體小穗在幼穗發育早期與野生型無明顯差異,但在成熟期其護穎的遠軸表皮細胞凸起且粗糙,形成的結節軸向對齊排列,且毛狀物較多,形成垂直相間的橫縱溝,與外稃表皮細胞結構相似。遺傳分析表明,該類突變表型受1對隱性基因控制,OsLG定位于第7染色體短臂SSR標記RM5344和RM20934之間,遺傳距離分別為1.11和0.82 cM,物理距離為246.3 kb。對該區域候選基因分析和測序,發現LOC_Os07g04670基因在編碼區第182位堿基(T→A)改變,導致其編碼氨基酸第61位(Leu→His)的改變。等位性分析表明,Oslg-2Oslg-3Oslg-1屬等位變異,進而對突變體Oslg-2Oslg-3OsLG測序,突變分別發生在第316位(T→A)和119位(T→C)堿基,導致其編碼的氨基酸第106位(Trp→Arg)和第40位(Leu→Pro)突變。對該基因進行同源進化分析和序列比對,表明該基因可能調控水稻護穎伸長。對本突變材料的候選基因和另一控制護穎性狀的PAP2進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析,結果表明,OsLG在水稻的葉片、穗、葉鞘和根中均有表達,且在穗部表達最高,而PAP2在除穗部以外的其他部位幾乎不表達,表明2個控制護穎性狀的基因均具有組織特異性,且PAP2的特異性更強;在長護穎突變體中,2個基因表達量均下調,表明其具有協同表達特點。【結論】3份水稻長護穎突變體OsLG與已報道的G1為同一基因,其功能結構域內氨基酸的突變導致長護穎發育;OsLGPAP2在穗部具有協同表達的特點。
    抗旱轉基因小麥(Triticum aestivum L.) 的雜草性評價
    姜奇彥,李新海,胡正,馬有志,張輝,徐兆師
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2096-2107.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.002
    摘要 ( 308 )   HTML ( 2 )   PDF (4750KB) ( 503 )   收藏
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    【目的】全球轉基因作物商業化迅猛發展,包括雜草化在內的一系列生態風險評估和研究尤為重要。文章中系統評價抗旱轉基因小麥MGX-L大面積推廣種植可能帶來的演化為雜草的生態風險,為轉基因抗旱小麥的環境安全評價標準制定提供科學依據。【方法】通過比較荒地和栽培地上抗旱轉基因小麥、受體小麥和當地常規品種的農藝性狀,評價轉基因小麥的生存競爭能力;并比較荒地上生存的轉基因小麥與受體的繁殖系數,評價轉基因小麥群體在野外的生存能力。比較轉基因小麥和受體品種的自生苗比率、種子落粒性、及深埋和淺埋地下種子萌發情況,評價轉基因小麥的自然延續能力。比較轉基因小麥和受體品種的花粉活力、花粉大小和花粉育性,評價轉基因小麥的自然繁育能力。綜合分析以上各項評價結果,評價抗旱轉基因小麥演變為雜草的可能性。【結果】轉基因小麥在栽培地上種植,其株高、總穗數和穗粒數與受體品種相比,沒有顯著差異,而轉基因小麥的產量、千粒重顯著高于受體品種。但和其他非轉基因當地主栽小麥品種相比,或沒有顯著差異,或低于其他非轉基因小麥品種,因此,轉基因小麥與其非轉基因小麥對照相似,在栽培地種植沒有更強的生存競爭能力。在荒地環境下,轉基因小麥生存競爭能力和受體品種沒有顯著差異。在荒地上種植且成熟的轉基因小麥,單位面積內收獲的總籽粒數少于上一年種下的種子粒數,其繁殖系數低于1。轉基因小麥群體不可能在野外環境中自然維持下去。轉基因小麥種子的落粒性和產生自生苗比率與受體品種相比沒有顯著差異。深埋20 cm以下土層的轉基因小麥和受體品種的種子全部腐爛;淺埋3 cm土層的轉基因小麥和受體品種的種子或者腐爛或者出苗,沒有發現未萌發且保存完好能夠保持活力繼續發芽的種子,二者的種子腐爛或出苗的比率沒有顯著差異,說明轉基因小麥和受體品種種子的延續能力低且無顯著差異。【結論】轉基因抗旱小麥MGX-L與其受體對照品種濟麥22及其他非轉基因當地主栽品種相似,耐旱性狀的引入不會增加小麥的雜草化潛勢。
    普通煙草及其祖先種基因組SSR位點分析
    童治軍,焦芳嬋,肖炳光
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2108-2117.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.003
    摘要 ( 226 )   HTML ( 1 )   PDF (1827KB) ( 419 )   收藏
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    【目的】普通煙草(N. tabacum ,2n=24Ⅱ=48 TTSS)及其2個祖先種-絨毛狀煙草(N. tomentosoformis,2n=12Ⅱ=24 TT)和林煙草(N.sylvestris,2n=12Ⅱ=24 SS)基因組SSR位點信息的統計分析,有助于煙草屬植物的遺傳分析。【方法】從公共數據庫NCBI(National Center for Biotechnology Information)中下載上述3個煙草基因組數據,應用SSRIT和TRF軟件分析其各自SSR位點分布特征,每個基因組隨機合成50對SSR引物擴增多態性。【結果】在絨毛狀煙草基因組、林煙草基因組和普通煙草基因組中分別獲得218 081、263 478和397 432個SSR總位點,其間的平均距離分別為7.52、7.78和9.06 kb。絕大部分的SSR位點分布在內含子和UTR(尤其是5′-UTR)區域;以2核苷酸和3核苷酸類型為主,占基因組內SSR位點總數目的2/3以上,其中,2核苷酸類型豐度最高;含有A(T)n基序結構的頻率及數量最高;除單核苷酸類型外,重復次數多在3—10。150對合成的引物對8個煙草種DNAs進行PCR反應,所有材料均能擴增出清晰穩定的目標片段,其中36對引物顯示多態性。【結論】絨毛狀煙草、林煙草和普通煙草基因組內SSR呈現一定的分布特征,表明SSR位點在親緣關系相對較近的煙草種間具有高度保守性。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    去苞葉對夏玉米籽粒灌漿特性和產量的影響
    秦營營,董樹亭,魏珊珊,張吉旺,劉鵬,趙斌
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2118-2126.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.004
    摘要 ( 282 )   HTML ( 1 )   PDF (383KB) ( 547 )   收藏
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    目的】在大田試驗條件下,設置不同去苞葉處理,研究去苞葉后夏玉米產量、籽粒體積、干重、脫水速率、籽粒灌漿速率以及籽粒黑層出現和乳線消失所需時間的變化,以期明確去苞葉對夏玉米籽粒產量和籽粒灌漿特性的作用。【方法】以先玉335(XY335)、鄭單958(ZD958)和登海661(DH661)為試驗材料,設置不同去苞葉處理:去苞葉1/4(S1)、去苞葉1/2(S2)和苞葉全去(S3)以及對照(CK),研究去苞葉對夏玉米產量、籽粒灌漿特性以及籽粒黑層出現和乳線消失所需時間的影響等。【】去苞葉后夏玉米產量顯著下降,XY335的S1、S2和S3處理的產量較CK分別下降9.45%、13.78%和27.89%,ZD958分別下降10.72%、15.07%和24.75%,DH661分別下降9.31%、16.01%和22.35%,去苞葉數越多,產量下降幅度越大。去苞葉后夏玉米的千粒重和穗粒數等產量構成因素顯著下降,S3處理影響最顯著,XY335的S3處理千粒重和穗粒數分別下降15.30%和14.87%,ZD958分別下降11.22%和15.24%,DH661分別下降15.10% 和8.55%。此外,去苞葉顯著影響夏玉米的籽粒灌漿特性,影響隨去苞葉數的增多而顯著加劇。去苞葉后籽粒到達最大灌漿速率時的天數(Dmax)顯著減少,S3處理影響最顯著,XY335、ZD958和DH661的S3處理的Dmax較CK分別縮短3 d、4 d和3.5 d。去苞葉后灌漿速率最大時的生長量(Wmax)和籽粒灌漿活躍期(P)等也均顯著降低,且去苞葉數目越多,Wmax和P的下降幅度越大,XY335﹑DH661和ZD958的S3處理的Wmax較CK分別下降12.75%、17.78% 和17.12%。XY335﹑DH661和ZD958的S1﹑S2、S3的P較CK分別下降6.22%、9.82%和11.78%,5.39%、8.39%和13.09%,0.17%、2.39%和5.97%。去苞葉后籽粒鮮重和籽粒體積顯著下降,籽粒脫水速率顯著提高,灌漿時間減少,籽粒乳線消失時間和籽粒黑層出現時間較正常發育的籽粒縮短,S3處理影響最顯著,XY335﹑ZD958和 DH661的S3處理的籽粒乳線消失所需時間較CK分別縮短10 d、6 d和4 d,籽粒黑層出現所需時間較CK分別縮短10 d、5 d 和4 d。【結論】去苞葉后灌漿速率最大時的生長量、達最大灌漿速率時的天數和籽粒灌漿活躍期均顯著降低,籽粒脫水速率顯著提高,導致籽粒灌漿時間縮短,籽粒干物質積累量顯著下降,籽粒乳線消失和黑層出現的時間較正常發育籽粒縮短,進而嚴重影響夏玉米籽粒的正常灌漿,最終導致夏玉米產量顯著下降,且其影響程度隨去苞葉數目的增加而加劇。
    生長物質對彩色棉胚珠離體培養纖維發育的影響
    劉松江,龔文芳,孫君靈,龐保印,杜雄明
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2127-2142.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.005
    摘要 ( 267 )   HTML ( 1 )   PDF (5697KB) ( 469 )   收藏
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    【目的】天然彩色棉是理想的綠色、環保、健康紡織原料,建立并優化棕色棉和綠色棉胚珠離體培養體系,研究滲透壓調節劑、植物生長調節劑和類黃酮代謝前體物質等生長物質對彩色棉胚珠培養纖維發育的影響,為彩色棉纖維色澤改良提供一定的理論基礎。【方法】以棕1-61、RT白絮、綠棉CC28為材料,采用常規栽培管理方法種植,在開花當天標記棉鈴,取開花后3 d的棉鈴進行離體培養。所有處理均在BT培養基基礎上添加10.0 μmol·L-1的IAA和5.0 μmol·L-1的GA3,此外分別采用不同濃度的滲透壓調節劑(甘露醇、氯化鈉、氯化鉀、蔗糖)、植物生長調節劑(茉莉酸甲酯、油菜素內酯)和類黃酮代謝前體物質(苯丙氨酸、阿魏酸)進行處理。除了考察油菜素內酯和茉莉酸甲酯交互作用的試驗外,其他均為品種和處理的雙因素試驗。在離體培養30 d后觀察纖維顯色狀況、測量纖維長度并稱取胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重。試驗中每個處理的數據均計算平均數和標準誤,主要采用最小顯著差數法或新復極差法進行多重比較。【結果】離體培養條件下彩色棉纖維在培養后15 d顯色;適合彩色棉胚珠生長和纖維發育的最佳處理為5 g·L-1蔗糖,其中棕1-61纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重比對照分別顯著增加28.35%、20.69%、103.70%和75.84%(P<0.05),綠棉CC28纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重比對照分別顯著增加8.10%、16.07%、63.14%和82.76%(P<0.05);0.05 μmol·L-1MeJA處理時棕1-61纖維長度比對照顯著增加22.90%(P<0.05),CC28纖維長度對照增加4.39%,差異不顯著;0.5 μmol·L-1BR處理使棕1-61、CC28纖維長度分別比對照顯著增加22.46%和11.56%(P<0.05);25 μmol·L-1阿魏酸處理下棕1-61、CC28纖維長度分別比對照顯著增加了8.72%和8.81%(P<0.05);添加適宜濃度的甘露醇(30 g·L-1)、氯化鈉(0.10 mol·L-1)、氯化鉀(0.20 mol·L-1)、蔗糖(10 g·L-1)、茉莉酸甲酯(40 μmol·L-1)或者苯丙氨酸(0.10 mmol·L-1)有利于棕色棉顯色,其中40 μmol·L-1茉莉酸甲酯效果最好;試驗所用的生長物質處理下,綠色棉顯色差異不大。【結論】蔗糖為彩色棉胚珠生長和纖維發育提供了糖源和滲透環境;適宜濃度的茉莉酸甲酯、油菜素內酯或阿魏酸有利于棕色棉和綠色棉纖維伸長發育;油菜素內酯和茉莉酸甲酯存在交叉作用,油菜素內酯主要參與纖維伸長過程中,而茉莉酸甲酯可能參與到棕色棉色素代謝過程中;一定濃度的甘露醇、氯化鈉、氯化鉀、蔗糖、茉莉酸甲酯或苯丙氨酸有利于棕色棉色素合成;滲透壓調節劑、植物生長調節劑和類黃酮前體物質對綠色棉纖維顯色作用不明顯。
    葡萄樹形態結構與生長發育過程數字化表達方法研究
    溫維亮,王勇健,李超,王傳宇,郭新宇
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2143-2151.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.006
    摘要 ( 347 )   HTML ( 1 )   PDF (934KB) ( 13753 )   收藏
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    【目的】用數字化方式描述植物形態結構與生長發育過程,是正確認識和表達植物生長發育規律的有效手段。本文旨在對形態結構較為復雜的葡萄樹進行精確描述與定量分析,對葡萄樹的數字化表達和處理技術進行研發與深化。【方法】針對葡萄樹的形態結構特征和生長發育過程,劃分并定義葡萄樹的基本結構單元,包括葡萄樹主干、多年生蔓、新梢和著生于枝蔓上的器官,其中新梢包括果枝和營養枝;著生于枝蔓上的器官包括芽、花序、果穗、副梢、葉片和卷須等。基于對葡萄樹結構單元的劃分,借鑒國內外結構單元的命名經驗、習慣與演變趨勢并結合田間觀察結果,遵循葡萄樹各結構單元出生的時空順序,系統地提出了以年為單位的葡萄樹地上部各結構單元數字化命名方案,以字母表示結構單元的類型,數字表明出生順序和結構單元編號。命名方案還包含了各結構單元的著生關系和分枝來源等信息,整合了多年生長機制下由新梢到蔓,再到多年生蔓的生長變化過程,并以節間為單位,以有序集的方式描述了新梢的構成。在命名方案基礎上,給出了組合器官與復雜操作表示方法,包括(1)基于結構單元命名的葡萄樹結果母枝與結果枝組的復雜器官表示方法;(2)人工修剪對葡萄樹結構變化的數字化描述;(3)以年為單位的葡萄樹動態生長數字化描述;(4)多年生葡萄樹生長發育過程回溯;(5)基于葡萄樹結構表示的各級結構單元量化統計分析等方法。【結果】以鄭州國家葡萄種質資源圃極短梢修剪的V字形‘赤霞珠’葡萄樹和北京市農林科學院林業果樹研究所試驗溫室的搭架式T字形‘香妃’葡萄樹為例,分別給出兩種樹形的數字化表達,實現了復雜葡萄樹結構的明確表示,包括各器官的唯一性命名、各器官的連接關系等。在結構表示的基礎上,進行了新梢結構單元量化統計、副梢及卷須人工修剪、種植年限增加帶來的葡萄樹結構變化表達等的數字化描述,結果表明方法對不同樹形、不同生長時期葡萄樹形態結構描述的普適性與有效性。【結論】葡萄樹形態結構的數字化表示有助于更加直觀地理解葡萄樹的形態結構與生長發育方式,對葡萄樹功能-結構模型的構建,實現葡萄樹形態結構的精確描述、可視化表達、定量分析,以及對葡萄樹內部各要素的狀態、發展演變過程的定量計算和模擬及進一步的預測和評價具有重要意義。葡萄樹結構單元劃分與命名方案對相似結構的木本植物研究有一定的借鑒與參考作用。
    植物保護
    玉米抗穗腐病研究進展
    段燦星,王曉鳴,宋鳳景,孫素麗,周丹妮,朱振東
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2152-2164.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.007
    摘要 ( 381 )   HTML ( 1 )   PDF (453KB) ( 1042 )   收藏
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    玉米是世界上最重要的農作物之一,中國玉米總產量占全國所有谷物產量的38.12%。穗腐病是玉米生產中的重要病害,在降低玉米產量和品質的同時,產生的毒素也危害人畜安全。抗性品種的選育和利用是控制玉米穗腐病的經濟、安全和有效措施。目前,國內外對玉米穗腐病的致病菌進行了較為詳細的研究,鑒定出40余種病原真菌,其中擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢和黃曲霉引起的穗腐病發生普遍,危害最為嚴重。建立了4種玉米抗穗腐病鑒定的方法,即雙牙簽接種法、花絲噴霧法、花絲通道注射法和針刺果穗注射法,從數千份玉米種質資源中篩選出一批抗擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢或黃曲霉穗腐病的材料。明確了玉米抗穗腐病的物理與生化機制,主要表現為抗侵染和抗擴散兩個方面。對部分材料進行了抗性遺傳分析和抗性基因QTL定位研究,在玉米1—8號染色體上檢測到60余個抗黃曲霉侵染或抑制黃曲霉毒素積累的QTL;定位了55個抗擬輪枝鐮孢穗腐病、29個抗禾谷鐮孢穗腐病、16個抗伏馬毒素和DON毒素的QTL,并通過meta-QTL分析獲得了數個能穩定表達且貢獻率較大的QTL位點。創制了10余份抗穗腐病種質,育成了少數對穗腐病具有較好抗性的玉米新品種。盡管如此,抗性研究和抗病育種成果用于生產實踐的事例仍很少,生產上缺乏抗穗腐病且高產優質的玉米品種。本文從玉米穗腐病病原類型、抗性種質篩選與評價、抗性遺傳及抗性基因的發掘與分子定位、抗性機制、抗病品種的選育等方面對國內外玉米抗穗腐病研究進行了綜述,并對今后的相關研究進行了展望,以期對促進玉米抗穗腐病研究有所裨益。
    大斑剛毛座腔菌高產漆酶條件的響應面優化及酶學特性
    曹可可,劉寧,馬雙新,曹志艷,梁東旭,柴江婷,董金皋
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2165-2175.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.008
    摘要 ( 241 )   HTML ( 2 )   PDF (2744KB) ( 308 )   收藏
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    【目的】優化大斑剛毛座腔菌(Setosphaeria turcica)高產漆酶的最佳發酵條件,確定其酶學性質,為進一步開發應用奠定基礎。【方法】以大斑剛毛座腔菌為出發菌株,首先采用單因素試驗確定影響菌株產漆酶的碳源、氮源及銅離子的種類及范圍,并在單因素試驗的基礎上,以漆酶酶活力為響應值,采用central composite design(CCD)響應面設計試驗,利用Design Expert軟件對響應值進行3因素3水平下的多元二次回歸擬合分析,優化大斑剛毛座腔菌產漆酶的發酵培養基成分;初步分離大斑剛毛座腔菌發酵液中的漆酶,以ABTS為反應底物,設置不同溫度及pH,測定漆酶的最適反應溫度、pH及熱穩定性、pH穩定性,進一步測定其反應動力學常數Km值、Vm值,確定其酶學特性。【結果】建立了以漆酶酶活力為響應值的多元二次回歸模型,模型差異顯著(P=0.0001),可以用該模型來擬合試驗;響應面分析結果表明,各因素對漆酶活力的影響大小依次為Cu2+>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用極顯著;通過擬合求出模型極值點,對應的大斑剛毛座腔菌產漆酶的最佳培養條件為:葡萄糖50.05 g?L-1,KH2PO4 1 g?L-1,尿素1.46 g?L-1,MgSO4 0.5 g?L-1,蛋白胨2 g?L-1,玉米漿0.5 g?L-1,CuSO4 0.07 g?L-1,Tween80 3 mL?L-1,28℃,150 r/min振蕩培養7 d;在此條件下漆酶活力最高達(40.00±1.20)U?mL-1。對大斑剛毛座腔菌漆酶發酵液初步分離,經SDS-PAGE檢測其漆酶相對分子量約為80 kD;以ABTS為底物時,最適反應溫度為50℃,最適pH為4.2,在溫度較高且弱酸性條件下活性較高,并且具有良好的溫度穩定性和pH穩定性,常溫下pH為4.2保持14 h后酶活力基本不變,50℃保溫14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;進一步在常溫、pH為4.2時測定其米氏常數Km值為0.036 mmol?·L-1,最大反應速率Vm為28.63 mmol?L-1?min-1。【結論】利用大斑剛毛座腔菌液體發酵產漆酶并研究其酶學特性,表明作為玉米致病菌的大斑剛毛座腔菌產漆酶具有發酵周期短、活性高、穩定性好等特性,可進一步研究開發應用。
    苯醚甲環唑和氟啶胺的兩種制劑包衣種子對花生土傳真菌病害的防治效果
    管磊,郭貝貝,王曉坤,張大俠,王凱,劉峰
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2176-2186.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.009
    摘要 ( 331 )   HTML ( 3 )   PDF (1357KB) ( 746 )   收藏
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    【目的】中國花生產區普遍發生冠腐病、根腐病和白絹病,嚴重影響花生生產。研究旨在比較并評價苯醚甲環唑與氟啶胺的微囊懸浮劑(microcapsule suspension,CS)和懸浮種衣劑(flowable concentrate for seed treatment,FS)對3種致病菌的毒力、包衣種子對花生的安全性以及對這3種病害的防治效果,以明確不同劑型制劑的安全性、持效期和施藥方法。【方法】分別采用孢子萌發法和菌絲生長速率法比較苯醚甲環唑和氟啶胺的CS和FS對花生冠腐病菌、根腐病菌和白絹病菌的室內毒力,采用種子包衣法評價苯醚甲環唑和氟啶胺的兩種制劑對花生的安全性,并進行田間藥效試驗。【結果】6%苯醚甲環唑FS、15%苯醚甲環唑CS、50%氟啶胺FS和12%氟啶胺CS對花生冠腐病菌孢子萌發的抑制率差異較大,其EC50分別為0.0503、0.4959、5.6141和46.5433 mg?L-1;對花生根腐病菌的EC50分別為0.5386、2.8604、0.3780和28.1665 mg?L-1;對花生白絹病菌的EC50分別為1.1435、3.2615、0.0951和3.8920 mg?L-1,表明微囊化后有效成分釋放速度均顯著減慢。20和25℃恒溫下,與對照相比,苯醚甲環唑FS和CS 50、100、200 g a.i./100 kg 種子、氟啶胺FS和CS 40、80和160 g a.i./100 kg 種子包衣對花生出苗率、出苗時間、根長及鮮重、株高和莖葉鮮重均無明顯影響。田間試驗結果,所有處理的花生出苗時間和出苗率均無差異,6%苯醚甲環唑FS和15%苯醚甲環唑CS 100、200 g a.i./100 kg種子包衣對花生冠腐病、根腐病和白絹病的防效均達68.03%以上,12%氟啶胺CS 160 g a.i./100 kg 種子對3種花生土傳真菌病害的田間防效達74.97%以上,顯著高于相同劑量的50%氟啶胺FS的防效。所有藥劑處理均顯著增加莢果產量,其中15%苯醚甲環唑CS 200 g a.i./100 kg種子處理的增產率最高,達7.22%—11.47%。【結論】6%苯醚甲環唑FS和15%苯醚甲環唑CS均在100、200 g a.i./100 kg種子,12%氟啶胺CS 160 g a.i./100 kg種子劑量下處理種子對花生安全,一次處理可以同時降低花生冠腐病、根腐病和白絹病的危害。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    根層調控對小麥-玉米種植體系氮素利用及土壤硝態氮殘留的影響
    彭亞靜,汪新穎,張麗娟,郝曉然,喬繼杰,王瑋,吉艷芝
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2187-2198.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.010
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    【目的】針對華北平原冬小麥-夏玉米輪作區高產田水肥資源利用效率低、氮素累積嚴重的問題,探索不同根層調控措施對作物氮素利用及土壤NO3--N殘留的影響。【方法】以華北平原高產糧田為對象,設置傳統水氮、水氮調控、調控+土壤調理劑(Agh)、調控+CRU(用含量為43%的緩釋尿素代替氮肥)和調控+植物生長調節劑(GGR)田間小區試驗,采集測定土壤、植株及根系樣品,分析不同根層調控措施對氮素利用的效果。【結果】在控水減氮前提下,調理劑和GGR處理的小麥玉米周年產量、吸氮量均高于傳統水氮。小麥拔節期GGR處理80—100 cm土層根系分布較多,表明GGR能促進中下層根系的發育;玉米大喇叭口期,藁城調理劑和大名GGR處理20—50 cm土層的根長密度均明顯高于傳統水氮。第一個輪作季,藁城和深州GGR的0—200 cm土體各土層硝態氮殘留量均顯著低于傳統水氮,尤其在60—100 cm土層硝態氮的殘留最低;第二個輪作季,藁城調理劑和大名GGR處理各土層硝態氮的殘留量顯著低于傳統水氮。第一個輪作季的調理劑和第二個輪作季的GGR(藁城)的氮素表觀虧缺量較大,說明根層調控促進了作物對土壤累積氮素的利用。根層調控措施能夠達到經濟和生態的雙贏,灌溉水分利用效率(WUE)和氮偏生產力(PFPN)較傳統水氮平均提高了2.47 kg·m-3和18.08 kg·kg-1,平均增收258.43元/667 m2。【結論】在華北平原高產田,不同根層調控措施的小麥、玉米單季及周年的產量較傳統水氮平均分別提高了8.58%、5.99%和7.13%;兩季作物收獲后0—100 cm土層中土壤硝態氮殘留量較傳統水氮平均分別降低了70.73和59.44 kg·hm-2,明顯降低了土壤硝態氮的殘留,減緩了向土體深層的淋溶損失;促進了小麥、玉米關鍵生育期根系的發育。總之,通過在控水減氮的基礎上添加土壤調理劑和植物生長調節劑(GGR)可以顯著提高作物產量,能使其充分挖掘土壤累積氮素,實現節本增效,提高水肥利用效率。
    渭北蘋果園土壤鈣素退化狀態
    魏彬萌,王益權,石宗琳,李鵬,史紅平,梁化學,王加旭
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2199-2207.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.011
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    【目的】針對渭北蘋果主產區出現的隨植果年限增加,果樹過早衰老,蘋果的苦痘病、水心病、痘斑病等生理性病害頻繁發生的問題,對該區蘋果園土壤鈣素退化部位、退化趨勢及退化程度等進行了研究,以期查明制約蘋果品質和果業可持續發展的因素,為果園土壤科學管理提供依據。【方法】在渭北黃土塬區分別選取<10 a、10—20 a、>20 a 3個園齡的蘋果園各4個,并以土壤條件相同的農田作對照,在樹冠層投影范圍內距樹干2/3處逐層采集剖面0—100 cm土壤樣品,研究不同園齡果園土壤碳酸鈣、交換性鈣、水溶性鈣含量及其貯量變化情況。【結果】3個不同園齡蘋果園土壤碳酸鈣在0—100 cm土層的總貯量隨植果園齡的增加而降低,0—50 cm土層碳酸鈣含量及貯量隨園齡增加顯著減少,50—100 cm則隨園齡增大呈現逐漸增加趨勢。10 a以上果園0—50 cm土層的碳酸鈣總貯量顯著低于農田。各果園土壤交換性鈣在0—100 cm土層的總貯量隨植果園齡的增加呈減少趨勢,0—40和60—100 cm土層土壤交換性鈣含量及貯量也隨園齡的增加而減少,而40—60 cm土層則隨園齡的增加而稍有增加。與農田相比,果園土壤的交換性鈣均有所增加。各果園0—50 cm土層水溶性鈣含量及其貯量都高于50—100 cm土層,10 a以上果園10—30 cm土層的水溶性鈣含量最高。與農田土壤相比,3個園齡果園土壤水溶性鈣含量都有所增加【結論】即使在富含石灰質的渭北黃土旱地,因長期植果明顯加速了土壤鈣素退化。隨園齡增大果園土壤鈣素庫容及有效鈣供給減小,已成為該地區土壤化學性質隱性退化的特征之一。在重視果園大量養分管理的同時,警示關注包括鈣素在內的中微量養分的演化趨勢。
    園藝
    蘋果MdMYB9MdMYB11表達及其蛋白互作分析
    安秀紅,張修德,陳可欽,劉肖娟,郝玉金,程存剛
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2208-2216.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.012
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    【目的】克隆蘋果(Malus domestica)中的TT2同源基因MdMYB9MdMYB11,分析它們的序列特征,并對這兩個基因在不同組織器官及光誘導條件下的表達特性及蛋白互作進行分析,為進一步解析這兩個基因的功能奠定基礎。【方法】采用同源克隆的方法分離得到MdMYB9MdMYB11;利用DNAMAN軟件對這兩個蛋白的分子量、等電點等進行預測及對氨基酸序列進行分析,同時利用MEGA4.0軟件構建這兩個蛋白與擬南芥R2R3家族MYB蛋白的系統進化樹;利用定量PCR檢測這兩個基因在不同組織器官、不同發育時期蘋果果皮及種子和光照處理條件下的表達特性;利用酵母雙雜交檢測這兩個MYB蛋白與花青苷合成相關蛋白MdbHLH33之間的互作關系。【結果】序列分析顯示,MdMYB9開放閱讀框長度為873 bp,編碼290個氨基酸殘基,與擬南芥TT2序列同源性為38.13%;MdMYB11開放閱讀框為861 bp,編碼286個氨基酸殘基,與TT2同源性為32.44%;蛋白結構分析顯示,MdMYB9和MdMYB11蛋白的N端都含有保守的R2R3功能域;進化樹分析顯示,這兩個MYB蛋白都與擬南芥原花青苷合成相關蛋白TT2聚在同一個分支;熒光定量結果表明,MdMYB9MdMYB11在蘋果根、莖、葉和花中均有表達,但各器官中表達水平存在差異;同時,這兩個基因在不同發育時期的種子及果皮中都有表達,其中均在發育中期表達水平最高;此外,光照誘導條件下MdMYB9MdMYB11的表達變化無明顯差異。酵母雙雜交結果顯示,MdMYB9和MdMYB11均能夠與花青苷合成相關蛋白MdbHLH33相互作用。【結論】蘋果MdMYB9MdMYB11屬于R2R3類MYB蛋白,在不同組織器官及不同發育時期的果皮和種子中都有表達,并與MdbHLH33蛋白相互作用。
    柑橘砧木對砂糖橘果實糖積累的影響
    劉翔宇,李娟,黃敏,梁春輝,陳杰忠
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2217-2228.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.013
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    【目的】分析不同砧木對砂糖橘果實糖積累、相關酶活性與基因表達水平的影響,以及激素在其中發揮的作用,揭示不同砧木影響砂糖橘果實糖積累的生理與分子機制,為生產上柑橘砧木的使用提供理論依據。【方法】以砂糖橘為接穗,枳殼和紅黎檬為砧木,測定果實成熟過程中糖含量及蔗糖代謝相關酶活性變化,并利用實時熒光定量 PCR對蔗糖代謝相關酶及蔗糖轉運蛋白的基因表達模式進行分析;同時測定果實中脫落酸(ABA)水平和ABA生物合成中的限速酶9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)的基因表達變化。【結果】砂糖橘果皮以積累還原糖為主,而果肉以積累蔗糖為主。在果實成熟期,枳殼砧砂糖橘果皮和果肉中可溶性總糖及蔗糖含量皆顯著高于紅黎檬砧的。枳殼砧砂糖橘果實中蔗糖合成酶(SS)活性更高。熒光定量PCR分析顯示,在成熟期枳殼砧砂糖橘果皮與果肉中蔗糖合成酶基因SS2的表達量顯著高于紅黎檬砧的,而酸性轉化酶基因CWINV1表達明顯低于紅黎檬砧的,且CWINV1表達量與蔗糖積累呈顯著負相關(r=-0.648*)。同時,果皮與果肉中蔗糖轉運蛋白基因SUC3表達隨果實成熟呈上升趨勢,且與可溶性總糖含量呈顯著正相關(r=0.87*),后期都為枳殼砧的顯著高于紅黎檬砧的。此外,隨著果實的成熟兩種砧木砂糖橘果皮中ABA含量逐漸升高,且與SS2、SUC3表達呈顯著正相關,后期枳殼砧的果皮ABA含量顯著高于紅黎檬砧的;果肉中ABA含量變化波動不大,同樣是枳殼砧的ABA水平更高。在果皮中,ABA生物合成中的限速酶NCED的基因NCED1表達趨勢與ABA含量變化相似,呈上升趨勢,后期枳殼砧的表達量明顯高于紅黎檬砧的;果肉中,枳殼砧的NCED1表達在后期明顯上調,其表達量也顯著高于紅黎檬砧的。【結論】不同砧木對砂糖橘果實糖積累產生顯著的影響。柑橘砧木主要通過影響砂糖橘果實蔗糖代謝酶的活性及其相關基因表達如SS2CWINV1等來調節糖的代謝從而調控果實糖的積累;不同砧木也影響砂糖橘果實中內源激素ABA水平及果實糖的轉運,從而影響果實糖積累。
    貯藏·保鮮·加工
    靜態變壓腌制技術對豬肉品質的影響
    郭昕,黃峰,張春江,胡宏海,陳文波,張泓
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2229-2240.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.014
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    【目的】探討靜態變壓腌制的優越性,闡明靜態變壓腌制對豬肉品質的影響,提高腌制肉制品品質。【方法】采用靜態變壓腌制(試驗組)、常壓腌制(對照1)、真空腌制(對照2)和加壓腌制(對照3)4種方式對豬肉進行腌制,分析腌制效果(食鹽含量、腌制吸收率)、pH、食用品質(水分含量、離心損失率、滴水損失率、色澤、剪切力與質構)、鹽溶性蛋白含量、肌纖維束微觀結構及肌原纖維蛋白降解程度的變化及影響。【結果】就腌制吸收率而言,試驗組與對照組之間在前4 h無顯著差異,4 h后試驗組的腌制吸收率較其他三者顯著提高(P<0.05)。就食鹽含量而言,腌制6 h時,試驗組較對照組1提高了31.9%,較對照組2提高了10.20%,而較對照組3提高了7.29%,且與三者差異顯著(P<0.05)。靜態變壓腌制可顯著提高豬肉pH值和食用品質。結果表明:腌制過程中,試驗組的pH值大于對照組,且每時間點差異均達到顯著(P<0.05)。試驗組水分含量和保水性顯著提高(P<0.05),與對照組相比,試驗組的離心損失率顯著小于對照組1(P<0.05);試驗組的滴水損失率顯著低于對照組1、2(P<0.05)。靜態變壓腌制對豬肉的嫩度、TPA和色澤有顯著影響,使剪切力、硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性顯著降低(P<0.05)。試驗組表面的b*值顯著高于對照組(P<0.05),內部的a*值、b*值及色澤相關肌紅蛋白差異不顯著。靜態變壓腌制對豬肉的蛋白和微觀結果也存在顯著影響。腌肉中的鹽溶性蛋白質的含量隨著腌制時間延長,呈上升趨勢。腌制6 h時,試驗組肉中的鹽溶性蛋白含量顯著高于對照組1和對照組3(P<0.05)。腌制液中的鹽溶性蛋白含量隨著腌制時間延長,也呈上升趨勢。在腌制6 h時,試驗組腌制液中的鹽溶性蛋白含量顯著低于對照組(P<0.05)。試驗組與對照組的肌原纖維蛋白降解程度不一致,試驗組1.5—4.5 h沒有明顯的條帶出現或缺失,而6 h時在40 kD出現條帶,但顏色較淺;而對照組1.5—6 h在40 kD均出現條帶,說明試驗組豬肉蛋白質降解程度低于對照組。電鏡結果表明靜態變壓腌制降低了對肌纖維束微觀結構的破壞程度,試驗組與對照組相比,試驗組和對照組1對肌肉微觀結構破壞程度最小,豬肉肌纖維束結構完整,對照組2和對照組3使肌纖維束組織結構完整性遭到一定程度的破壞,肌纖維束縫隙變大,結構疏松。【結論】與常壓腌制、真空腌制和加壓腌制相比,靜態變壓腌制可顯著提高腌制效果、改善肉質,具有更為廣闊的應用前景。
    熱加工方法對伊拉兔冷藏期間肌內磷脂變化的影響
    薛山,賀稚非,肖夏,李洪軍
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2241-2250.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.015
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    【目的】探討不同熱加工處理后伊拉兔肌內磷脂在冷藏期間的動態變化,為伊拉兔肉及其產品的質量控制提供理論依據。【方法】以伊拉兔背部最長肌為原料,用3種不同的熱加工方式(蒸煮、微波和錫箔烘烤)對其進行處理,分析各樣品在0—9 d冷藏期間肌內磷脂的含量,并用氣相色譜法對脂肪酸組成的動態變化進行測定。此外,將主要8個設計因子(原料、3種熱加工方式和4個貯藏時期)作為X變量,以肌內磷脂脂肪酸作為Y變量,用偏最小二乘回歸分析法(PLSR)對伊拉兔的肌內磷脂脂肪酸組成變化進行分析。【結果】在0—9 d冷藏期間,經蒸煮、微波和錫箔烘烤處理后伊拉兔的肌內磷脂含量(干重%)均有顯著下降(P<0.05),尤其是6—9 d冷藏后期,其中,微波處理更能維持伊拉兔肌內磷脂含量在冷藏期間的穩定性。在此期間,伊拉兔肌內磷脂脂肪酸中,飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)的比例均顯著升高(P<0.05),而PUFA的比例在貯藏過程中均顯著降低(P<0.05),其中6—9 d貯藏期間各樣品中多不飽和脂肪酸(PUFA)比例(尤其是長鏈PUFA)下降幅度最大。錫箔烘烤較之另外兩種熱加工方式更能夠抑制冷藏期間肌內磷脂不飽和脂肪酸(UFA),尤其是PUFA的降解。此外,在0—9 d冷藏期間,加工后伊拉兔肉樣品肌內磷脂脂肪酸的n-6/n-3比值呈現顯著增加趨勢(P<0.05),但是仍處于推薦的范圍之內。相比之下,蒸煮處理更能有效地維持伊拉兔肌內磷脂脂肪酸的n-6/n-3比值處于較低的波動范圍。經PLSR分析證實,當采用蒸煮、微波和錫箔烘烤3種熱加工方式時,伊拉兔肌內磷脂的脂肪酸組成受冷藏時間的影響要大于熱加工方式。在冷藏期間,伊拉兔肌內磷脂中絕大多數的脂肪酸都發生了差異性變化,尤其在0—3 d時,MUFA(C17:1)和PUFA(C20:2n-6,C20:4n-6,C20:5n-3,C22:5n-3和C22:6n-3)顯著下降,而SFA(C16:0和C18:0)顯著升高(P<0.05)。比較3種熱加工方式,蒸煮處理更有助于保護伊拉兔肌內磷脂在冷藏期間的脂肪酸組成。【結論】加工方式和貯藏時間都能夠影響伊拉兔肌內磷脂的含量與組成。當采用蒸煮、微波和錫箔烘烤3種熱加工方式時,伊拉兔肌內磷脂組成受冷藏時間的影響要大于熱加工方式。從營養和健康的角度出發,烹調時應盡量選擇溫和的熱加工方式,并縮短加工后的冷藏時間。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    豬miR-192/-215的組織表達譜及其關鍵靶基因分析
    吳正常,殷學梅,孫麗,夏日煒,霍永久,吳圣龍,包文斌
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2251-2261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.016
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    【目的】在前期通過Illumina Solexa高通量測序技術并結合熒光定量驗證篩選出斷奶仔豬E.coli F18菌株感染下表達量極顯著上調的microRNAs—miR-192和miR-215的基礎上,為了解miR-192和miR-215的組織表達情況,進一步篩選確定miR-192和miR-215靶向調控E.coli F18菌株感染的關鍵靶基因,為探討miR-192和miR-215調控斷奶仔豬E.coli F18感染的分子調控機制奠定基礎。【方法】試驗采用Real-time PCR方法檢測miR-192和miR-215在35日齡梅山仔豬各個組織中的分布情況,同時利用MEGA 5.0分析了其保守性,TargetScan預測miR-192和miR-215的靶基因,并對靶基因分別進行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,進一步利用DAVID對靶基因蛋白進行功能分類,最后將預測的靶基因與課題組前期篩選出的斷奶仔豬E.coli F18感染抗性相關的調控基因取交集。【結果】miR-192和miR-215在35日齡梅山仔豬十二指腸和空腸中均高度表達,二者成熟序列在脊椎動物中高度保守。miR-192和miR-215對應的靶基因相同,具有156個靶基因,只在軸突導向通路(axon guidance pathway)顯著富集(P-value < 0.05)以及25個GO功能中顯著富集(P-value < 0.05)。靶基因蛋白按功能分為12類,其中信號轉導功能的磷蛋白(phosphoprotein)和DNA結合蛋白(dna-binding)占主要部分。靶基因與前期篩選的E.coli F18感染抗性相關的調控基因(GEO登錄號:GSE26854)取交集,發現DLG5ALCAMFRMD4BMIPOL1ZFHX3 等5個基因為miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5為維持小腸上皮細胞結構完整性的重要因子。【結論】miR-192與miR-215是參與維持斷奶仔豬腸道正常功能與抗F18大腸桿菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向調控E.coli F18菌株感染中關鍵的靶基因,今后需要進一步驗證其能否作為梅山豬抗F18大腸桿菌的有效遺傳標記。
    益生菌對載鴨水體和產蛋性能的影響及其分子機制
    應詩家,許愛紅,戴子淳,郗正林,何宗亮,匡偉,趙偉,吳云良,施振旦
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2262-2269.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.017
    摘要 ( 188 )   HTML ( 1 )   PDF (379KB) ( 346 )   收藏
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    【目的】研究飼糧添加芽孢桿菌和載鴨水體應用光合細菌對載鴨水體和鴨產蛋性能的影響及其分子機制。【方法】采用“地面平養+水池”養殖模式,以2×2因子試驗設計,選擇同批次連城白鴨和櫻桃谷鴨雜交后代蛋鴨240只,隨機分為4組,每組6個重復,每個重復10只,每個重復獨立一欄。兩處理因子分別為飼糧添加有效活菌含量為8×107 cfu/kg的枯草芽孢桿菌和載鴨水體應用光合細菌至水體有效活菌含量為1.8×1012 cfu/m3。對照組為不應用芽孢桿菌和光合細菌,光合組為只應用光合細菌,芽孢組為只添加芽孢桿菌,聯合組為既添加芽孢桿菌又應用光合細菌。預飼7 d,試驗期120 d。試驗期間統計每10 d的平均產蛋率、平均采食量和平均料蛋比;每10 d采集水樣用于檢測大腸桿菌和沙門+志賀氏菌數量;每15 d采集水樣和血樣用于檢測內毒素濃度。試驗結束時,采集新鮮糞樣用于檢測大腸桿菌和沙門+志賀氏菌數量;取十二指腸、空腸和回腸黏膜用于檢測內毒素水平;取空腸、回腸和脾臟組織用于炎癥和凋亡相關基因表達。試驗鴨自由飲用池水、自由采食、自然光照。水體和血液內毒素、采食量、產蛋率、料蛋比、水體大腸桿菌和沙門+志賀氏菌數據采用重復測量的線性混合模型分析,LSD修正法多重比較。糞便微生物數量、腸道黏膜內毒素水平和組織基因表達數據采用單因子方差分析,Duncan法多重比較。【結果】芽孢桿菌和光合細菌不顯著影響鴨采食量(P>0.05)空腸Caspase-3Bcl-2 mRNA表達(P>0.05)、回腸Bcl-2 mRNA表達(P>0.05)、以及脾臟IL-1β mRNA表達(P>0.05),但芽孢桿菌和光合細菌顯著提高蛋鴨產蛋率(P <0.001),顯著降低蛋鴨料蛋比(P<0.001)、載鴨水體(P<0.001)、十二指腸(P<0.01)和回腸(P<0.01內毒素濃度、糞便大腸桿菌數(P<0.001)、空腸TLR4P<0.05)和回腸Caspase-3P<0.05)mRNA表達水平。采食量、產蛋率、料蛋比、水體大腸桿菌、沙門+志賀氏菌和內毒素水平存在顯著的時間效應(P<0.001)。與芽孢組和聯合組相比,對照組和光合組血液內毒素和糞便沙門+志賀氏菌數量顯著提高,對照組空腸粘膜內毒素水平、載鴨水體沙門+志賀氏菌數量以及脾臟TNF-α mRNA表達水平顯著提高。聯合組水體大腸桿菌數量顯著低于對照組、光合組和芽孢組。僅聯合組回腸TLR4 mRNA表達水平顯著低于對照組,脾臟IL-10 mRNA表達水平顯著高于對照組。【結論】芽孢桿菌和光合細菌可能通過降低載鴨水體革蘭氏陰性菌數量和內毒素水平、降低腸道和血液內毒素濃度、降低炎癥反應和腸道細胞凋亡,提高蛋鴨產蛋性能。
    多轉座子載體的構建及轉座特性比較研究
    沈丹,謝雨琇,李慶平,薛松磊,史云強,王賽賽,陳才,錢躍,高波,崔恒宓,宋成義
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2270-2278.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.018
    摘要 ( 302 )   HTML ( 1 )   PDF (2092KB) ( 949 )   收藏
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    【目的】轉座子(transposon, Tn)是染色體上可自主復制和移位的基本單位,普遍存在生物體基因組內,Sleeping beauty(SB)、piggyBac(PB)和Tol2分別來源于鮭魚、甘藍尺蠖蛾和青鳉魚,是目前脊椎動物中活性較高的轉座子。比較了這3種轉座子在哺乳動物細胞的轉染、插入和剪切效率,從而獲得細胞水平上的高活性轉座子系統。【方法】通過高保真PCR法分別從SB、PB和Tol2 3種轉座子載體克隆3種轉座子3′和5′端的轉座元件,測序正確后,將各轉座元件依次亞克隆至pT2-HB載體框架,構建成包含這3種轉座子的多轉座子載體pT3-PST。將綠色熒光蛋白表達框CAG-GFP和新霉素表達框PGK-NEO分別克隆至pT3-PST載體,獲得兩個表達載體pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。將這兩個表達載體分別和轉座酶表達質粒pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、pCMV-Tol2以1﹕1質量比混合,經多聚陽離子PEI包裹,共轉染小鼠胚胎成纖維細胞(3T3),同時以突變失活的轉座酶質粒SB△DD與轉座子載體共轉染作為陰性對照組。轉染GFP 36 h后,用熒光顯微鏡進行檢測GFP表達率,提取細胞基因組,以Amp基因作為內參,進行實時熒光定量PCR,檢測GFP插入拷貝數;根據被剪切位置上下游序列設計引物,進行實時熒光定量PCR,檢測3種轉座子的剪切效率。細胞轉染NEO 48 h后,用濃度為500 µg·mL-1G418進行耐藥性篩選,至正常細胞基本全部死亡(10 d),將細胞進行吉姆薩染液染色,統計耐藥細胞數,從而比較各組轉座活性。【結果】成功構建了多轉座子載體PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO實驗組轉染細胞效率均大于50%,且差異不顯著(P>0.05)。SB組GFP相對拷貝數高于Tol2和PB組,但差異不顯著(P>0.05),均顯著高于對照組(P<0.05)。SB和PB組剪切效率顯著高于Tol2組(P<0.05),但SB和PB組之間差異不顯著(P>0.05)。pT3-PGK-NEO與轉座酶共轉染3T3細胞,G418抗性篩選結果表明,SB組耐藥細胞數顯著高于PB和Tol2組(P<0.05),但PB和Tol2兩組差異不顯著(P>0.05),此3組均極顯著高于陰性對照組(P<0.01)。【結論】SB轉座子系統在細胞水平的轉座效率優于PB和Tol2,為細胞水平的轉基因研究提供有效基因轉移工具
    研究簡報
    鴨梨幾丁質PbChiIV的克隆與表達
    李朋朋,劉寧,張玉星,彭建營,董金皋
    中國農業科學. 2015, 48(11):  2279-2286.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.019
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    【目的】從鴨梨果實中克隆PbChiIV的全長cDNA序列,檢測PbChiIV在根、莖、葉、果實以及在水楊酸(SA)和梨輪紋病菌誘導下的表達特性,以探討該基因與SA信號轉導及抗梨輪紋病菌的相關性。【方法】設計特異引物,克隆PbChiIV的全長序列,將測序得到的核苷酸序列和推導的氨基酸序列在NCBI上用BLAST進行序列相似性分析,利用BiotEdit軟件對氨基酸序列進行比對,利用MEGA6.0構建系統發育樹,利用實時熒光定量PCR技術分析該基因在梨不同組織以及在SA和梨輪紋病菌誘導下的表達。【結果】克隆了PbChiIV的cDNA序列為819 bp,GenBank數據庫登錄號為KJ872676。生物信息學分析表明,PbChiIV編碼272個氨基酸,與沙梨的同源性達100%,與毛果楊(XP_006376418.1)、葡萄(NP001268173.1)、擬南芥(CAA74930.1)、紫花苜蓿(ACL36992.1)、蒺藜苜蓿(AAR87869.1)、豇豆(CAA61281.1)、榛子(AEM97876.1)、東方山羊豆(AAP03085.1)、葡萄(NP_001268075.1)、華東葡萄(ABY66958.1)、葡萄(AAB65777.1)、煙草(BAF44533.1)和海島棉(AER29902.1)的同源性分別為79%、73%、73%、72%、72% 、72%、69%、68%、67%、67%、65%、67%和62%,屬于第IV類幾丁質酶基因。表達分析表明,PbChiIV在根中的表達量最大,分別是莖和葉的4.32和2.96倍,其次是在果實中的表達量,分別是莖和葉的2.48和1.70倍,在葉片和莖中的表達相對較低。在鴨梨幼果和成熟期果實中,SA和梨輪紋病菌均可誘導該基因表達。SA處理后基因的最大表達量是對照的2.83和3.8倍,病原菌處理后基因的最大表達量是對照的1.82和1.66倍,SA、病原菌處理后基因的最大表達量是對照的2.49和3.43倍,表達量分別在72、24和72 h達到最大值。【結論】PbChiIV可能參與SA介導的植物抗病防衛反應的信號通路,推測其參與梨輪紋病菌引起的防衛反應,在鴨梨抗病過程中起作用。
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