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當期目錄

    2015年 第48卷 第12期 刊出日期:2015-06-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    SP1互作的水稻穗頂部退化基因qPAA3的精細定位
    張興元,羅勝,王敏,叢楠,趙志超,程治軍
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2287-2295.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.001
    摘要 ( 333 )   HTML ( 4 )   PDF (2260KB) ( 425 )   收藏
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    【目的】水稻頂部小穗退化減少了單穗的總枝梗數和總粒數,嚴重影響單株產量,是水稻生產上的一個不利性狀。因其遺傳基礎復雜,受環境影響較大,控制頂部小穗退化的相關基因克隆研究報道極少,該不利性狀發生的分子機制及其遺傳網絡還不得而知。對頂部小穗退化基因進行精細定位,可為穗頂部基因的克隆奠定基礎;開發的緊密連鎖分子標記,也可以運用于分子育種實踐,對這一不利性狀進行早期識別和淘汰。【方法】首先對小穗突變體sp進行精細定位。用sp分別與粳稻品種ITA182和秈稻品種J160雜交構建2個遺傳定位群體。為了研究不同穗退化突變體之間的關系,再以小穗突變體sp和穗頂部退化材料05261雜交,獲得了農藝性狀穩定的擬雙突變體(表型與sp相似)。通過連續自交,純合擬雙突變體的遺傳背景。再以高代的擬雙突變體為非輪回親本,穗頂部正常品種IRAT129為輪回親本,構建含有雙突變體的BC1F2亞群體。其中一個亞群體14C2017既表現單基因的穗退化性狀分離,又出現小穗和穗頂部退化的雙突變體表型,被用作頂部小穗退化基因的精細定位材料。【結果】水稻小穗性狀是由1對隱性基因(sp)控制的。利用混池方法將SP(t)初步定位于第11染色體分子標記RM26281RM7391之間;利用新開發的60對SSR分子標記,將其定位在標記sc50sc66之間。在此區間內設計引物,最終將SP(t)定位在標記sc24sc66之間,物理距離為54.3 kb的范圍內。測序結果表明,突變體在該區間內有15.03 kb的大片段缺失,導致基因SP1的編碼序列缺失。對擬雙突變體的表型分析表明,sp與一個穗頂部退化基因存在互作。利用亞群體14C2017作為克隆與SP1互作基因的遺傳分離群體,利用分布于全基因組的239對引物,篩選出在擬雙突變體和IRAT129之間有多態的引物114對,將目標基因精細定位于第3染色體SSR標記RM6929RM1319之間,物理距離為97.3 kb范圍內,該候選基因屬于早先報道的QTL——qPAA3【結論】水稻sp的小穗性狀是由基因SP1引起的缺失突變。與SP1互作的qPAA3定位于第3染色體SSR標記RM6929RM1319之間,物理距離為97.3 kb的范圍內。
    華南大豆種質對大豆疫霉根腐病的抗性分析
    程艷波,馬啟彬,牟英輝,譚志遠,吳鴻,年海
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2296-2305.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.002
    摘要 ( 294 )   HTML ( 1 )   PDF (366KB) ( 440 )   收藏
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    【目的】大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的嚴重影響大豆生產的世界性病害之一,選用抗病品種是控制該病最經濟有效的措施。篩選抗大豆疫霉菌PGD1的優異抗源和多抗疫霉根腐病種質資源,推導大豆種質抗疫霉根腐病基因,為熱帶、亞熱帶地區大豆抗病育種提供有效抗源。【方法】采用下胚軸創傷接種法,利用在廣東發現并分離的大豆疫霉菌PGD1菌株,接種鑒定主要來自廣東、廣西、福建、海南、湖南、江西和四川等華南省份631份大豆種質資源的抗病性,篩選抗大豆疫霉菌PGD1種質資源;再用其他6個不同毒力的大豆疫霉菌株接種鑒定抗大豆疫霉菌PGD1的種質,篩選多抗資源,通過基因推導方法分析抗病種質的抗病基因類型。【結果】631份大豆種質中有101份種質抗大豆疫霉菌PGD1,占鑒定種質的16.0%;73份為中間反應類型,占11.6%;457份表現感病,占72.4%。其中83份抗大豆疫霉菌PGD1的種質對其他6個不同毒力菌株Pm14、Pm28、PNJ1、PNJ3、PNJ4、P6497的侵染率分別為28.9%、34.9%、9.6%、66.3%、57.8%和10.8%。4份種質同時抗7個不同毒力的大豆疫霉菌株,分別為ZDD21538、ZDD21604、ZDD14286和明夏豆1號,占鑒定種質的4.8%。毒力頻率為0的種質有15份,占鑒定種質的18.1%。83份大豆種質對7個不同毒力的大豆疫霉菌株共產生20種反應型,1種反應型與單個抗病基因的鑒別寄主Williams79反應型一致,可能含有抗病基因Rps1c;45份種質產生的9種反應型符合一些2個或2個以上已知抗病基因組合的反應型,這些種質可能含有已知抗病基因組合;38份種質共產生11種反應型既不同于任何含有單個已知抗病基因品種的反應型也不同于2個或2個以上已知抗病基因組合的反應型,它們可能含有新的抗病基因或基因組合。【結論】華南地區大豆種質中蘊藏著豐富的抗大豆疫霉菌PGD1和多抗大豆疫霉菌抗源,這些抗病種質可作為熱帶、亞熱帶地區大豆抗病育種的重要親本和抗病基因定位的重要研究材料。
    棉花鈉尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析
    劉小雙,劉廷利,袁洪波,張保龍,王榮富
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2306-2316.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.003
    摘要 ( 276 )   HTML ( 1 )   PDF (2403KB) ( 551 )   收藏
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    【目的】分析棉花中鈉尿肽GhPNP1的結構特征、表達模式以及耐旱功能,并分析其耐旱機制,為將該基因應用于作物改良奠定基礎。【方法】通過對從植物中水平轉移到大麗輪枝菌中的鈉尿肽基因AVE1進行同源性搜索,得到與AVE1蛋白序列相似度較高的其他物種的蛋白序列;使用MEGA5軟件對AVE1蛋白序列及其同源序列進行多序列比對分析并構建同源物種間系統進化樹;利用MEGA和expasy在線工具進行蛋白序列分析;并根據編碼該蛋白的核酸序列設計引物在陸地棉品種奧3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多種生物信息學軟件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1編碼蛋白的等電點、分子量、信號肽、進化關系等進行預測分析。利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析GhPNP1在不同器官部位的組織表達模式以及受到PEG模擬干旱脅迫處理后的表達模式。將GhPNP1的cDNA序列連入CLCrV沉默載體中,構建GhPNP1的病毒誘導基因沉默載體CLCrV:GhPNP1,轉入農桿菌,并通過和輔助載體CLCrVB共侵潤2葉期幼苗進行葉片注射,獲得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模擬干旱處理沉默植株檢測其耐旱性,并測定沉默植株的失水率、相對含水量、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化活性(T-AOC水平)、離子滲漏率等與植物抗逆相關的生理指標。【結果】從陸地棉奧3503中克隆到的GhPNP1的開放閱讀框長度為396 bp,編碼131個氨基酸,信號肽長度為15個氨基酸,通過系統進化樹分析GhPNP1編碼的蛋白含有保守的鈉尿肽結構域,與可可樹的PNP蛋白進化關系最近。GhPNP1在棉花植株的根、莖、葉中均表達且在莖中表達量較高,PEG模擬干旱處理后根、莖、葉中的GhPNP1均上調表達。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性顯著降低。在干旱條件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、離子滲漏率、葉片失水率均高于對照的未沉默植株;而沉默植株的總抗氧化能力(T-AOC水平)、相對含水量顯著低于對照的未沉默植株。【結論】從棉花中克隆得到一個植物鈉尿肽基因,受干旱脅迫誘導上調表達,沉默后耐旱性降低。推測GhPNP1可能通過cGMP信號途徑參與棉花的干旱脅迫,在干旱脅迫下對棉花耐旱性起正調控作用。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    小麥籽粒蛋白質光譜特征變量篩選方法研究
    李栓明,郭銀巧,王克如,謝瑞芝,戴建國,肖春華,李靜,李少昆
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2317-2326.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.004
    摘要 ( 243 )   HTML ( 2 )   PDF (845KB) ( 719 )   收藏
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    【目的】篩選整粒小麥籽粒蛋白質的近紅外特征光譜波段并建立優化模型,可實現快速、無損測定整粒小麥籽粒蛋白質含量,為田間便攜式小麥籽粒蛋白質含量速測儀設計提供依據。【方法】2012—2013年以蛋白質含量有明顯差異的8個冬小麥品種為試驗品種,設置3個施氮量和2個灌溉量共6個處理,建立豐富的樣本類型,共采集176個小麥籽粒光譜數據;將ASD FieldSpec Pro光譜儀采集到的基于全反射下墊面的整粒小麥籽粒反射光譜通過公式A=log(1/R)轉換為吸收光譜,對吸收光譜采用S-G平滑、多元散射校正和基線校正等方法進行預處理,以消除背景噪聲,然后采用交叉驗證偏最小二乘回歸方法進行特征波段壓縮;分析比較無信息變量剔除法(UVE)結合交叉驗證偏最小二乘回歸、連續投影算法(SPA)結合交叉驗證偏最小二乘回歸、UVE與SPA組合后結合交叉驗證偏最小二乘回歸、UVE與SPA組合后結合多元線性回歸(MLR)及UVE與SPA組合后結合逐步多元線性回歸(SMLR)等多種特征光譜篩選方法選出的蛋白質特征波段的優劣,并與凱氏定氮法測定的小麥籽粒蛋白質含量進行回歸分析,構建并優選小麥籽粒蛋白質最佳預測模型。【結果】利用無信息變量剔除(UVE)方法可將與小麥籽粒蛋白質含量無關的信息變量剔除,把籽粒的原始光譜由1 621個波段壓縮至717個,在保留了蛋白質信息的同時,實現了特征譜段的初次優選;對逐步多元線性回歸(SMLR)、連續投影算法(SPA)、連續投影算法(SPA)+逐步多元線性回歸(SMLR)及連續投影算法(SPA)+偏最小二乘回歸(PLS)+交叉驗證(CV)等特征波段優選算法比較發現,不同的方法獲得的特征譜段有差異,構建的模型及精度也明顯不同。對經過無信息變量剔除(UVE)法篩選光譜特征譜段,利用SPA消除光譜矩陣中波段共線性影響,再利用SMLR篩選出小麥籽粒蛋白質信息貢獻最大的15個特征譜段,所得模型的預測均方根誤差(RMSEP)和R2分別為0.5898和0.9410,模型預測精度最高。【結論】本研究利用UVE、SPA與SMLR方法有效壓縮了整粒小麥籽粒光譜矩陣,基于所篩選的蛋白質含量特征譜段數構建的預測模型可以實現無損、快速測定整粒小麥籽粒蛋白質含量,預測模型精度可靠,方法經濟有效,為設計田間便攜式整粒小麥籽粒蛋白質測定儀的波段選擇和開發奠定了基礎。
    玉米籽粒比重與灌漿特性的關系
    張麗,張吉旺,樊昕,劉鵬,董樹亭
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2327-2334.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.005
    摘要 ( 453 )   HTML ( 1 )   PDF (386KB) ( 834 )   收藏
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    【目的】玉米籽粒比重與容重呈顯著正相關,容重偏低一直是中國玉米低商品品質的主要問題之一。論文旨在探討玉米籽粒比重在籽粒灌漿過程中的建成動態及其與籽粒灌漿特性的關系,以期為提高籽粒比重和容重,改善玉米商品品質提供理論依據。【方法】選用普通型品種農大108(ND108)、硬粒型品種費玉4號(FY4)、高淀粉型品種費玉3號(FY3)和鄭單18(ZD18)為供試材料,對授粉后玉米籽粒的干比重、鮮比重、百粒干重、單粒鮮體積和水分含量進行測定,采用回歸分析討論比重與灌漿特性的關系。【結果】籽粒鮮比重授粉后隨著籽粒的發育呈上升趨勢,到成熟期趨于穩定;而干比重在灌漿前期處于下降趨勢,授粉后20—35 d是其增長的快速時期,到灌漿后期基本趨于穩定;成熟期FY4、FY3及ZD18籽粒干比重和鮮比重均大于對照ND108。百粒干重和單粒鮮體積在灌漿前期增長迅速,之后增長速率變緩,至成熟期逐漸趨于穩定,其授粉后的變化趨勢均可用Logistic曲線較好的模擬,各回歸方程的相關系數在0.986—0.999,均達到顯著水平,FY4、FY3和ZD18成熟期百粒干重和單粒鮮體積均大于ND108;授粉后隨著干物質的不斷積累,籽粒水分含量迅速下降,平均每天下降1.302個百分點。籽粒鮮比重與百粒干重(R2=0.851,P<0.01)、單粒鮮體積(R2=0.594,P<0.05)均呈顯著正相關,而與水分含量(R2=0.803,P<0.01)呈顯著負相關。以灌漿期的百粒干重,單粒鮮體積和水分含量為自變量x,籽粒干比重為依變量y,用二次曲線方程y=a+bx+cx2對它們之間的回歸關系進行擬合,方差分析表明各方程回歸系數在0.623—0.748,F檢驗均達到顯著水平(P<0.01),其中干比重與籽粒水分含量的關系最為密切(r=0.731,P<0.01)。當百粒干重、單粒鮮體積和水分含量分別為18.75 g、0.589 cm3和61.5%時,干比重處于最小值,此時對應的各品種授粉后天數分別在24.0—28.1 d、16.3—20.7 d和21.1—23.6 d,均處在籽粒快速增長期,說明在16—28 d內籽粒快增持續期階段內,是籽粒干比重形成的關鍵時期。【結論】籽粒干比重在灌漿前期處于下降趨勢,之后快速增長到灌漿后期基本趨于穩定;籽粒灌漿快增持續期是干比重形成的關鍵時期,此期間影響籽粒灌漿將顯著影響干比重的大小;干比重與籽粒水分含量的關系最為密切,回歸系數達0.731。
    中國橡膠樹種植氣候適宜性區劃
    劉少軍,周廣勝,房世波
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2335-2345.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.006
    摘要 ( 354 )   HTML ( 1 )   PDF (2484KB) ( 1062 )   收藏
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    【目的】天然橡膠是國民經濟建設不可缺少的重要戰略物資,受氣候因素限制,中國種植橡膠樹范圍有限,迫切需要厘清天然橡膠樹種植的氣候適宜性區域。本研究旨在劃分出中國橡膠樹種植氣候適宜性分布,以闡明中國橡膠樹種植的氣候差異格局。【方法】根據中國橡膠樹種植區的自然氣候特點和生物學特征,基于橡膠樹種植存在概率、橡膠樹臺風影響概率和橡膠樹寒害影響概率,分別采用最大熵模型和影響橡膠樹種植的5個主導氣候因子(最冷月平均溫度、極端最低溫度平均值、月平均溫度≥18℃月份、年平均氣溫、年平均降水量)計算橡膠樹種植氣候適宜性指數。根據臺風歷史資料和橡膠林臺風災害分級標準計算橡膠樹臺風災害指數、參照《橡膠寒害等級(QX/T169-2012)》行業標準計算橡膠樹綜合寒害指數。根據確定的橡膠樹種植的氣候區劃指標(氣候適宜性指數、橡膠樹臺風災害指數、橡膠樹綜合寒害指數),結合模糊綜合評價模型,進行中國橡膠樹種植氣候適宜性區劃,區劃結果劃分為高適宜區、中適宜區、低適宜區。【結果】橡膠樹種植的氣候高適宜區面積約4.99×104 km2,占研究區面積的20.94%,主要分布在海南儋州、澄邁、定安、樂東、保亭,廣東徐聞、雷州、湛江、陽江,云南景洪、勐臘,福建詔安、云霄,廣西防城等地。該區域氣候條件優越,但部分區域屬于臺風高影響區,因此需要防御臺風災害對橡膠樹的影響。氣候中適宜區面積約8.85×104 km2,占研究區面積的35.86%,主要分布在在海南瓊中、東方、昌江、萬寧、瓊海等,廣東廉江、高州、茂名、信宜、惠來、潮州,福建漳州、漳浦等,云南瑞麗、舊過,廣西北海、合浦。與高適宜區相比,該區域橡膠樹寒害發生概率增加,部分區域受臺風影響概率也增加,應針對不同災害特點,加強橡膠寒害和風害的防御。氣候低適宜區面積約10.3×104 km2,占研究區面積的43.20%,主要分布在在云南盈江、永德、思茅、屏邊等一線,廣西玉林、浦北,廣東陽春、海豐、陸河,福建華安等地。該區域主要受寒害影響為主。【結論】該方法考慮了農業氣候資源與農業氣象災害的綜合影響,可以較好地反映中國橡膠樹種植的氣候優勢區域分布,對橡膠樹種植的區域布局和科學規劃具有重要的參考意義。
    植物保護
    中國小麥品種蘭天9號慢葉銹性QTL分析
    韓柳莎,王佳真,師令智,朱琳,李星,劉大群
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2346-2353.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.007
    摘要 ( 269 )   HTML ( 1 )   PDF (854KB) ( 317 )   收藏
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    【目的】由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起的小麥葉銹病是影響小麥穩產、高產的一種重要真菌病害。目前防治小麥葉銹病最經濟、安全、有效的方法是種植抗病品種。中國小麥品種蘭天9號苗期對大多數葉銹菌小種表現感病,成株期對小麥葉銹菌則表現為明顯的慢銹性。研究旨在分析中國小麥品種蘭天9號的成株抗葉銹性,發掘其中含有的QTL,并利用分子標記進行定位,為小麥分子育種提供理論基礎。【方法】利用抗病親本蘭天9號和感病親本輝縣紅雜交獲得到197個家系的F2:3群體,2011—2014年連續3年在河北保定種植,并利用3個葉銹菌生理小種混合菌種(THTT、THTS、THTQ)進行田間接菌,小麥成株期調查最終發病嚴重度,獲得表型數據。利用1 232對SSR標記對蘭天9號、輝縣紅以及F2:3群體進行基因檢測,獲得基因型數據。結合表型數據和基因型數據,利用Map Manager QTXb20創建連鎖圖、QTL Icimapping 3.2軟件進行抗葉銹病QTL分析。【結果】檢測到5個QTL,其中位于2B染色體上的QTL暫命名為QLr.hbau-2BS,在連續兩年的數據結果中都被檢測到,解釋的遺傳變異分別為6.0%和9.1%;標記區間分別為Xbarc55-Xgwm148Xgwm429-Xwmc154;LOD值分別為2.6和3.46;加性效應分別為-6.1和-8.7;顯性效應分別為3.03和3.4。1B染色體上1個QTL暫命名為QLr.hbau-1BL.2,連續兩年被檢測到,解釋的遺傳變異分別為7.7%和10.7%;標記區間為Xwmc766—Xbarc269;LOD值分別為2.5和3.1;加性效應分別為-1.0和-1.1;顯性效應分別為-13.0和-14.9。其他3個QTL只在一個年份被檢測到,1B染色體上暫命名為QLr.hbau-1BL.1、4B上暫命名為QLr.hbau-4BS、3A上暫命名為QLr.hbau-3A,均在2011—2012年度檢測到,解釋的遺傳變異分別為11.7%、8.5%、5.6%;標記區間分別為Xbarc80—Xwmc728Xgwm495—Xwmc652Xgwm161—Xbarc86;LOD值分別為5.1、4.0和2.8;加性效應分別為6.5、-5.5和-3.1;顯性效應分別為-6.5、6.2和6.6。QLr.hbau-1BL.1來源于感病親本輝縣紅,其余4個QTL來源于蘭天9號。【結論】結合田間表型數據和基因型數據,檢測到位于1B、2B、3A、4B染色體上5個控制成株抗葉銹的QTL。
    利用酵母雙雜交系統篩選介體異沙葉蟬中與小麥矮縮病毒外殼蛋白互作的蛋白質
    趙藝澤,劉艷,王錫鋒
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2354-2363.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.008
    摘要 ( 289 )   HTML ( 1 )   PDF (2842KB) ( 10339 )   收藏
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    【目的】利用分離泛素酵母雙雜交膜系統(split-ubiquitin yeast membrane system),以小麥矮縮病毒Wheat dwarf virus,WDV)的外殼蛋白(CP)基因為誘餌對異沙葉蟬(Psammotettix alienus L.)cDNA文庫進行篩選,研究異沙葉蟬傳播WDV的分子機制。【方法】以筆者實驗室飼養的異沙葉蟬為材料,提取其總RNA后取100 ng進行純化,利用SMART法反轉錄合成ds cDNA,經過Sfi I酶切純化,連接到pPR3-N文庫載體上,構建得到以pPR3-N為載體的異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統cDNA文庫。同時,構建帶有Sfi I酶切位點的誘餌載體pDHB1-WDV CP,經功能檢測后用誘餌載體初步篩選pPR3-N空文庫,尋找適合篩庫的條件和確定His基因產物抑制劑3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)的使用濃度。然后用誘餌載體篩選異沙葉蟬cDNA文庫,對篩選結果進行分析,再通過共轉驗證和β-半乳糖苷酶檢測進一步驗證是否發生互作。利用Uniprot和KEGG在線網站,對篩到的蛋白進行gene ontology(GO)注釋和Pathway分析。【結果】初級文庫庫容量超過2.0×106 cfu,文庫實際擴增數量大于1.3×106 cfu,文庫重組率大于97%,擴增文庫插入片段平均長度大于1 000 bp,表明異沙葉蟬cDNA文庫的質量較高。酶切驗證顯示誘餌載體pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而準確。功能檢測表明融合蛋白能夠正確表達。3-AT濃度為5 mmol?L-1的篩選條件下,誘餌載體篩選異沙葉蟬cDNA文庫得到280個克隆,經測序和Blast比對分析最終得到12個可能與WDV的CP發生互作的異沙葉蟬蛋白質。將這12個蛋白質再次進行共轉驗證和β-半乳糖苷酶檢測,最終得到9個蛋白質與WDV CP互作。GO注釋顯示,9個蛋白參與的生物過程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代謝過程、先天性免疫應答、模式識別受體的信號通路、運輸、同向運輸和乙醇氧化等;分子功能包括金屬離子結合活性、蛋白磷酸酶活性、信號模式識別受體的活性、水解酶活性、磷酸離子載體活性和葉酸運輸活性等。參考KEGG數據庫,這些蛋白參與的代謝途徑有泛素介導的蛋白水解途徑、內吞作用、花生四烯酸代謝途徑、cAMP信號通路和模式識別受體的信號通路等。【結論】異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統cDNA文庫的成功構建與篩選,為研究異沙葉蟬與小麥矮縮病毒的互作機制研究奠定了基礎。
    綠盲蝽TRPA1基因的鑒定及功能分析
    付婷,楊婷,劉楊,王桂榮
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2364-2373.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.009
    摘要 ( 291 )   HTML ( 2 )   PDF (2050KB) ( 369 )   收藏
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    【目的】克隆綠盲蝽(Apolygus lucorum)TRPA1基因,明確其在成蟲不同組織中的表達分布,研究綠盲蝽TRPA1基因的功能,闡明綠盲蝽感受溫度的分子基礎。【方法】在綠盲蝽轉錄組測序的基礎上,通過生物信息學方法分析轉錄組數據,得到編碼綠盲蝽TRPA1基因的cDNA序列片段。根據已知的cDNA序列,設計引物。采用RT-PCR及RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術克隆TRPA1基因的全長序列,并通過DNAMAN軟件及BLAST分析測序結果。測序正確后,使用在線工具SMART及TMpred預測TRPA1蛋白的錨蛋白重復序列(Ankyrin repeats)及跨膜結構域序列。通過序列比對,構建昆蟲TRP(transient receptor potential)通道的家族進化樹,分析綠盲蝽TRPA1與其他物種同源基因的相似性及進化地位。以GADPH為內參基因,利用RT-PCR檢測綠盲蝽TRPA1在成蟲觸角、頭、喙、足、腹等不同組織中的相對表達量。通過爪蟾卵母細胞體外表達結合雙電極電壓鉗記錄技術研究綠盲蝽TRPA1對溫度刺激的反應。【結果】通過綠盲蝽轉錄組數據預測得到TRPA1基因的4個cDNA序列片段,經過RT-PCR及RACE技術克隆得到了綠盲蝽TRPA1的全長序列,并命名為AlucTRPA1AlucTRPA1開放閱讀框全長3 672 bp,編碼1 223個氨基酸。通過在線工具SMART及TMpred預測分析結果表明,AlucTRPA1含有16個錨蛋白重復序列結構及6個保守的跨膜結構域。序列比對及進化樹分析結果顯示,昆蟲TRPA家族包含TRPA1、Painless、Pyrexia及Water witch,AlucTRPA1屬于昆蟲TRPA1亞家族。AlucTRPA1與其他昆蟲的同源基因具有很高的相似性,特別是與同屬半翅目的豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的同源性高達65.1%。成蟲組織表達譜分析結果表明,AlucTRPA1在成蟲觸角中的表達量最高,頭、喙、足、腹中也都有表達。爪蟾卵母細胞體外表達結合雙電極電壓鉗記錄結果表明20℃至40℃逐漸上升的溫度可以直接激活AlucTRPA1通道,且兩次連續重復的溫度刺激未引起AlucTRPA1通道的鈍化。【結論】AlucTRPA1在綠盲蝽成蟲的觸角、頭等組織中均有表達,且在爪蟾卵母細胞表達的AlucTRPA1能被20℃至40℃逐漸上升的溫度刺激直接激活,推測AlucTRPA1在綠盲蝽體內是直接的溫度感受器,參與調控綠盲蝽對生活環境溫度的感知行為。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    中國耕地保育技術創新不足已危及糧食安全與環境安全
    張維理,徐愛國,張認連,冀宏杰
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2374-2378.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.010
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    中國自20世紀80年代初以來隨作物產量的提高,化肥等農用化學品投入量增加了3.6倍,而同期農民耕地保育技術水平卻沒有明顯提升,盲目施肥、大量施肥、用藥不當、灌溉不當,即以“費”的方式補償技術不足現象普遍,由此不僅引起肥、水資源的過度消耗,還導致土壤質量退化、農民生產成本增加,水、土、大氣環境和農產品污染加劇,對糧食安全、環境安全和食品安全造成隱患。研究顯示,導致農民耕地保育技術水平難以提升的兩大主要原因分別是耕地保育應用與應用基礎研究的弱化與現代農技服務業的缺失。多年來,國家級和省部級公益性土壤肥料農業專業研究機構均質化、碎片化、行政化問題不斷加深,使得需要長期研究才能有所突破的土壤肥料應用與應用基礎研究難以為繼并被空洞化,至今難以為各農區提供易于為農民掌握和應用的耕地保育分區、分類、量化技術指標,難以推動現代專業化農技服務業的發展。要在根本上解決這一問題,亟需在3個方面進行改進:第一,重視穩定和保持國家與省級公益性土壤肥料專業科研院所的專業特征,發揮其在耕地保育技術創新研究中的核心作用。第二,在國家科研計劃中,對耕地保育應用與應用基礎領域研究主題適度穩定,執行年限也應適度延長,以便中國能夠逐步為各主要農區建立一批科學、可靠的耕地保育技術規程,并對其進行持續的升級換代。第三,探索與中國農村經濟技術條件更相適應的現代農技推廣模式,發展現代信息技術、通訊技術、智能技術在耕地保育技術推廣傳播中的作用,以技術創新帶動中國農技推廣方式的轉變,全面提升中國農民耕地保育技術水平
    不同生長階段水分脅迫對旱區冬小麥生長發育和產量的影響
    姚寧,宋利兵,劉健,馮浩,吳淑芳,何建強
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2379-2389.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.011
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    目的為了探究不同生長階段水分脅迫對旱區冬小麥生長發育和產量形成的影響,通過2012—2013和2013—2014兩個生長季在遮雨棚人工控水試驗,對比分析不同分段受旱條件下冬小麥的株高、葉面積指數、生物量、物候期和產量等生理生態指標的動態變化過程。方法試驗將冬小麥整個生育期劃分為越冬、返青、拔節、抽穗和灌漿5個主要生長階段,每相鄰兩個生長階段連續受旱,形成4個不同的受旱時段水平(D1—D4),根據小麥生育期的需水量,設置灌水定額分別為40和80 mm兩個水平(I1和I2),共形成8個處理,每處理3次重復,在遮雨棚內采用裂區試驗布置,此外在旁邊設置1個各生育期全灌水的對照處理。結果在冬小麥營養生長階段進行連續水分脅迫時,明顯影響小麥的正常生長發育,越冬期和返青期受旱時冬小麥的株高和葉面積指數都最小,但是拔節后受旱對小麥植株生長影響不明顯,且拔節期后冬小麥株高和葉面指數的平均生長速率均為拔節前的10倍;拔節期前各處理小麥的生物量都沒有明顯的差異,但是拔節后各處理差異明顯,越冬期和返青期受旱處理的生物量明顯低于其他各處理,并且后期復水也不能彌補生物量的嚴重損失;干旱脅迫能縮短冬小麥的生育期,在同一灌溉水平下,受旱階段D1、D2、D3、D4的抽穗期和開花期比對照處理延遲1-3 d,且受旱時期越早、脅迫程度越大,則生育期越提前,成熟期最多可提前5 d;相同灌溉水平下,若抽穗和灌漿期受旱(即越冬、返青、拔節期灌水)可獲得較高的有效穗數和穗粒數,但千粒重較低;而抽穗和灌漿期灌水,可以提高冬小麥千粒重,但穗數和穗粒數較低;在I1和I2水平下,越冬期和返青期受旱處理的產量最低,僅為對照處理產量的42%左右,但I1水平下拔節期和抽穗期受旱的處理產量最高,約為對照處理的63%,I2水平下返青期和拔節期受旱的處理產量最高,約為對照處理的75%。結論灌水定額和受旱階段具有明顯的交互作用,返青期和灌漿期為旱區冬小麥田間水分管理的關鍵時期,生產中需加強這兩個生長階段的田間水分管理以確保高產。
    根層調控措施對甜玉米-黃瓜設施蔬菜輪作體系土壤硝態氮的影響
    郝曉然,彭亞靜,張麗娟,王琳,巨曉棠,吉艷芝,任翠蓮
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2390-2400.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.012
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    【目的】以甜玉米作為填閑作物,探討不同的根層調控措施對消減土壤剖面累積硝態氮及下茬黃瓜生長的影響。【方法】在華北平原傳統棚室蔬菜的休閑季種植甜玉米,針對甜玉米設置添加土壤調理劑和秸稈還田2種根層調控措施,以甜玉米傳統種植作為對照,進行田間小區試驗。試驗于2008年5月至2011年5月進行,共3次甜玉米-黃瓜輪作,6季作物。每年6月初至9月底種植甜玉米,10月初至次年1月底扣棚育黃瓜苗,當年2月初種植黃瓜。在甜玉米季,共3個處理,隨機排列,重復3次。小區面積為4 m×2 m,小區間隔0.3 m,區組之間布設1 m的保護行。【結果】甜玉米種植季,調理劑處理的玉米籽粒產量最高,2008、2009和2010年的產量分別為6.2、7.4和7.9 t·hm-2;土壤調理劑和秸稈還田2種根層調控處理的甜玉米總吸氮量高于傳統種植。秸稈還田和調理劑處理能夠促進20—60 cm土層根系的生長發育,促使根系吸收更深層的土壤養分。2種根層調控措施均能降低土壤剖面NO3--N的累積,尤其對100—200 cm的作物根區NO3--N的消減能力更強,NO3--N消減趨勢大致為:調理劑>秸稈還田>傳統種植。3季黃瓜種植季,不同前茬處理的黃瓜產量、生物量和吸氮量差異均不顯著;3季平均土壤NO3--N在0—200 cm土層的殘留量為秸稈還田<調理劑<傳統種植。3個輪作季后,傳統種植、調理劑和秸稈還田處理在0—200 cm土層的氮素盈余量分別為1 911.6、1 966.3和1 930.2 kg·hm-2,調理劑處理顯著高于傳統種植。【結論】在硝態氮高累積的設施土壤上,隨著種植年限的增加,加入土壤調理劑和適當的秸稈還田對100—200 cm的作物根區土壤剖面NO3--N的消減能力更強。填閑作物種植第二年對下茬黃瓜土壤NO3--N的消減作用最為明顯。土壤調理劑和秸稈還田措施能夠顯著提高甜玉米對土壤剖面NO3--N的消減能力,減緩土壤NO3--N 的淋失,提高經濟效益。
    園藝
    MaCaM在采后香蕉果實溫度脅迫及后熟中的作用
    王海波,龔家建,蘇新國,張昭其
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2401-2407.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.013
    摘要 ( 211 )   HTML ( 1 )   PDF (1019KB) ( 364 )   收藏
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    【目的】研究香蕉CaM在溫度脅迫及香蕉果實后熟過程中的表達模式,了解CaM在增強香蕉果實對溫度脅迫的適應性作用,解釋CaM參與調控香蕉果實褪綠轉黃的機制。【方法】通過比對NCBI數據庫中已有物種的CaM氨基酸序列,設計兼并引物。采用熱硼酸法,從香蕉果皮中提取總RNA,通過RT-PCR與RACE方法擴增目的基因。利用DNAMAN軟件和NCBI網站對CaM的氨基酸序列進行氨基酸比對和同源樹分析。利用地高辛探針合成試劑盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit)合成特異基因帶有DIG標記的探針,使用Northern雜交法對MaCaM在采后香蕉果實溫度脅迫及后熟中的表達規律進行分析。鈣離子螯合劑EGTA及鈣信號恢復處理采用香蕉果皮離體培養,采用真空滲透的方法對香蕉果皮進行試劑處理,利用色差計測定顏色h值。【結果】從香蕉果皮中克隆得到一個CaM,長648 bp,編碼138個氨基酸,命名為MaCaM(登錄號:HM061077),序列分析表明,MaCaM包含4個EF-Hand鈣離子結合區域,與MaCaM、OsCaM、ZmCaM、AtCaM3、TaCaM1-2等基因同源性極高。Northern雜交結果表明,熱激(52℃,3 min)處理香蕉果實0.5 h后,MaCaM表達迅速增強;香蕉果實在冷害溫度(7℃)下放置10 d,MaCaM在冷藏的第7—10 d表達逐漸增強,當采后香蕉果實先經熱激處理再放入7℃下貯藏,MaCaM表達在第4天和第7天強于7℃處理;乙烯催熟處理誘導香蕉MaCaM表達逐漸增強;30 mmol·L-1鈣離子螯合劑EGTA處理在一定程度上抑制了香蕉果實的后熟,同時也抑制了MaCaM的表達。而在EGTA處理的同時,利用30 mmol·L-1 CaCl2進行鈣信號恢復處理,能一定程度地恢復香蕉果實的正常后熟,也恢復了MaCaM的表達。【結論】MaCaM能增強香蕉果實對溫度脅迫的適應性;MaCaM作為一種調控因子參與了香蕉果實后熟的褪綠轉黃過程。
    UV-A誘導大豆芽苗菜下胚軸中花青苷積累的分子機理
    戚楠楠,張曉燕,蘇娜娜,鄔奇,耿殿祥,齊學會,魏圣軍,崔瑾
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2408-2416.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.014
    摘要 ( 231 )   HTML ( 1 )   PDF (929KB) ( 668 )   收藏
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    【目的】研究長波紫外光(UV-A)、白光(W)和藍光(B)對大豆芽苗菜下胚軸中花青苷含量、花青苷合成相關酶活性、花青苷合成途徑相關基因及光受體基因表達量的影響,以探明UV-A誘導大豆芽苗菜下胚軸中花青苷生物合成的分子機理,為光質調控技術應用于大豆芽苗菜工業化生產提供理論依據。【方法】以大豆‘東農690’為試材,以黑暗培養為對照,連續的UV-A、白光(W)和藍光(B)光照培養作為試驗處理,在處理0 h、12 h、24 h和36 h后各采樣一次,分別測定花青苷含量,苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮異構酶(CHI)以及類黃酮半乳糖苷轉移酶(UFGT)活性,相關基因(PAL、CHS、CHI、DFR、ANS、UFGT、MYB75、CRY1、CRY2、UVR8)表達量。花青苷含量采用分光光度法測定,苯丙氨酸解氨酶(PAL)及查爾酮異構酶(CHI)活性采用分光光度法測定,類黃酮半乳糖苷轉移酶(UFGT)活性采用超高效液相色譜法(UPLC)測定。材料總RNA采用Trizol試劑法提取,基因表達量采用qRT-PCR測定。結果黑暗培養下的大豆芽苗菜子葉為黃色,而白光(W)、藍光(B)和UV-A培養下的大豆芽苗菜子葉為綠色。與黑暗培養及其他光質處理相比,UV-A顯著提高大豆芽苗菜下胚軸中花青苷含量;隨著處理時間的延長,花青苷積累逐漸增加。0 h處理下,大豆芽苗菜下胚軸中花青苷含量較低,約2 U·g-1FW。經36 h的UV-A處理,大豆芽苗菜下胚軸中花青苷含量達到最大值(43 U·g-1FW),顯著高于黑暗及其他光照處理。0 h處理下,PALCHI酶活性較高。與黑暗培養及其他光質處理相比,24 h36 h UV-A處理顯著提高了PAL酶活性;12 h及24 h UV-A處理顯著提高了UFGT酶活性。0 h處理下,不同處理間的花青苷合成相關基因表達均無差異。與黑暗培養及其他光質處理相比, UV-A處理36 h顯著上調了MYB75CRY1CRY2UVR8的表達,分別上調約12倍、30倍、6倍和2倍;UV-A處理12 h顯著上調了花青苷合成相關結構基因(PAL、CHS、CHI、DFR、ANS、UFGT)的表達,分別上調約5倍、58倍、10倍、6倍、44倍和47倍。【結論】UV-A通過提高PAL、UFGT酶活性及上調花青苷合成和光受體相關基因的表達,誘導了大豆芽苗菜下胚軸中花青苷的積累。
    貯藏·保鮮·加工
    ‘華紅’蘋果果肉的流變特性及其主成分分析
    楊玲,張彩霞,康國棟,田義,叢佩華
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2417-2427.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.015
    摘要 ( 214 )   HTML ( 1 )   PDF (440KB) ( 492 )   收藏
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    【目的】研究‘華紅’蘋果果肉在貯藏期間的流變特性(蠕變、松弛)變化規律,并進行流變特性參數間的相關性分析,用流變學方法預測評價果實質地品質,完善蘋果果實品質評價體系。【方法】通過對‘華紅’蘋果果肉蠕變、松弛特性的研究,分別建立四元件Burger’s蠕變模型和三元件Maxwell應力松弛模型;分析蠕變、松弛參數隨貯藏時間的變化規律,進行蠕變、松弛特性參數之間相關性分析,并利用SPSS軟件進行蠕變、松弛特性主要參數的主成分分析。【結果】在‘華紅’蘋果貯藏過程中,蠕變特性參數初始彈性系數E1,延遲彈性系數E2,黏性系數η1、η2變化規律基本一致,均呈下降趨勢,且這些參數間兩兩都呈極顯著正相關;蠕變量呈緩慢上升趨勢,與以上4個蠕變特性參數呈極顯著負相關;延遲時間τ也呈緩慢上升趨勢,達到最大硬度時做功呈先升高后降低的趨勢,這兩個蠕變特性參數和以上5個蠕變特性參數相關性較差;松弛特性參數零時彈性模量E0、平衡彈性模量Ee、衰變彈性模量E1、黏滯系數η、硬度、應力和總功變化規律基本一致,呈先下降略有升高后下降的變化趨勢,且這7個松弛特性參數之間都呈極顯著正相關。松弛時間T與其他7個松弛特性參數變化規律不一致,而且與它們相關性較差。運用主成分分析蠕變、松弛特性參數,第一主成分對10個變量指標的提取很充分,貢獻率為88.828%。第一主成分‘流變因子’F1在貯藏過程中隨著果實質地變軟、食用品質的下降而呈下降趨勢。【結論】‘華紅’蘋果果肉具有壓縮黏彈性力學性質,四元件Burger’s模型和三元件Maxwell模型可以很好地擬合‘華紅’蘋果蠕變、松弛模型,可表征‘華紅’蘋果果肉貯藏期間流變力學特性變化規律,反應果肉質地變化狀況。
    豬宰后肌肉體系中μ-calpain及肌原纖維蛋白理化特性的變化規律
    魏秀麗,謝小雷,張春暉,李俠,王春青
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2428-2438.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.016
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    【目的】研究豬宰后1—168 h,肌肉體系中μ-calpain及肌原纖維蛋白理化特性變化規律,并探究肌肉持水性變化機理,為冷鮮肉汁液流失控制提供理論依據。【方法】取宰后1 h內的豬背最長肌,在4℃條件下分別成熟6、12、24、72、120和168 h,通過活性電泳(casein zymography)對μ-calpain活性定量分析,對肌原纖維小片化指數(myofibril fragmentation index,MFI)進行過程測定,利用SDS-PAGE變性凝膠電泳分析肌原纖維蛋白降解聚合情況,研究宰后肌肉的成熟與肌原纖維蛋白的結構變化規律;通過測定肌原纖維蛋白表面疏水性和溶解性,考察肌原纖維蛋白水合力的變化,利用加壓濾紙法測定肌肉的持水性(water-holding capacity,WHC),并借助低場核磁共振技術(low field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)定性定量考察肌肉3種不同狀態水(結合水、不易流動水及自由水)的分布和遷移。【結果】宰后1—24 h,μ-calpain活性升高,肌原纖維蛋白未發生明顯降解,MFI無顯著變化(P>0.05)。宰后24 h肌肉進入成熟期,μ-calpain活性逐漸下降,MFI值顯著升高(P<0.05),肌原纖維蛋白顯著降解,肌肉持水性隨之改變。肌肉成熟過程中,μ-calpain作用于肌肉蛋白導致蛋白質結構伸展并降解,一方面會有低分子量的蛋白生成,增加蛋白質的比表面積,使其溶解度增加;另一方面也有疏水殘基的暴露及蛋白的交聯聚合,導致蛋白溶解度降低,表面疏水性增加,這兩者之間的競爭結果決定了降解后蛋白質的水合特性。其中,宰后24—120 h,μ-calpain適度降解肌原纖維蛋白,溶解度顯著升高(P<0.05),使肌肉中不易流動水P22升高(r=0.286,P<0.01),自由水P23下降(r=-0.246,P<0.05);肌原纖維蛋白內部疏水性殘基的暴露引起表面疏水性顯著升高(P<0.05),致使肌肉自由水P23升高(r=0.319P<0.01);LF-NMR-T2結果表明結合水P21與不易流動水P22的相關系數為r=-0.890(P<0.01),不易流動水P22與自由水P23的相關系數為r=-0.360(P<0.01),表明結合水和自由水會“態變”為不易流動水,蛋白結合水隨著蛋白質的高級結構被破壞,結合水被釋放,轉變為不易流動水,同時肌肉蛋白的降解導致位于肌纖維細胞外的自由水流回肌纖維細胞內部,肌肉持水性升高。宰后120—168 h,肌原纖維蛋白的高度降解,引發低分子量蛋白相互聚集,表面疏水性和溶解度下降,肌肉中不易流動水P22降低(P<0.05),自由水P23升高(P<0.05),不易流動水“態變”成自由水,肌原纖維結構內的不易流動水逐漸流向肌原纖維外的空隙,變為自由水,從而造成新的汁液流失,肌肉持水性下降。【結論】宰后24—120 h,μ-calpain介導的肌原纖維蛋白降解,使蛋白溶解度和表面疏水性增加,水合力上升,肌肉中結合水和自由水“態變”為不易流動水,肌肉持水性升高。宰后120—168 h,肌原纖維蛋白進一步降解,低分子量蛋白發生交聯聚合,蛋白水合力降低,肌肉中不易流動水“態變”成自由水成為汁液流失
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    EGF、EGFR在牦牛卵母細胞中的表達及對胚胎發育能力的作用
    潘陽陽,李秦,崔燕,樊江峰,楊琨,何俊峰,余四九
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2439-2448.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.017
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    【目的】探明表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)及其受體(EGFR)在牦牛卵母細胞成熟過程中的表達動態,并且研究EGF對牦牛卵母細胞成熟的影響及可能的分子作用機制。【方法】采集牦牛卵巢,撿取質量較好的牦牛卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes,COCs),進行體外成熟培養;分別處理未成熟和成熟的牦牛COCs,采用Real-time PCR和間接免疫熒光方法檢測COCs成熟過程中EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表達動態;牦牛COCs成熟培養時在基礎培養基中分別添加0、50、100和200 ng·mL-1 EGF及最佳作用濃度的EGFR抑制因子Gefitinib,比較作用前后卵母細胞成熟率、受精后卵裂率及囊胚率;Real-time PCR方法分析不同濃度EGF和Gefitinib作用后成熟COCs中凋亡相關基因Bax和Baxi的相對表達量。【結果】EGF,EGFR基因在成熟COCs的表達顯著高于未成熟COCs,成熟COCs中EGF基因的相對表達量為未成熟COCs 的2.17±0.36倍,EGFR基因在成熟COCs的表達量為未成熟COCs 6.82±0.21倍,且在未成熟和成熟COCs中EGFR基因表達量均顯著高于EGF。免疫熒光檢測顯示未成熟COCs和成熟COCs均表達EGF和EGFR蛋白,EGF和EGFR蛋白的標記熒光主要集中在卵丘細胞,卵母細胞表達較弱。100 ng·mL-1 EGF可以顯著提高COCs成熟率(73.45±2.09)%及其受精后的卵裂率(59.46±1.41)%和囊胚率(26.23±1.08)%;對照組中(0 EGF)COCs成熟率為(54.16±3.25)%,卵裂率為 (48.33±1.93)%,囊胚率為(15.34±0.43)%;EGF濃度為50 ng·mL-1時成熟率、卵裂率及囊胚率分別為(61.79±1.04)%、(51.76±0.61)%和(18.62±1.13)%;200 ng·mL-1成熟率、卵裂率及囊胚率分別為(71.26±4.18)%、(57.13±2.06 )% 和(23.96±0.53)%;而加入EGFR抑制因子Gefitinib顯著的降低了COCs的成熟率及其受精后的卵裂率及囊胚率,分別為(43.63±1.46)%、(41.79±2.81)%和(12.65±0.67)%。COCs成熟過程中EGF的作用可以顯著抑制促凋亡基因Bax的表達,在50 ng·mL-1100 ng·mL-1200 ng·mL-1EGF作用后成熟COCs中Bax基因的相對表達量分別僅為對照組(0 EGF)的0.83±0.12,0.21±0.02,0.27±0.03倍,EGF濃度為100 ng·mL-1Bax基因表達量最低,而Gefitinib作用后可以顯著促進成熟COCs中Bax基因的表達,其相對表達量為對照組的4.24±0.10倍;EGF在COCs成熟過程中可以顯著促進抗凋亡基因Baxi的表達,其相對表達量在EGF濃度為50、100、200 ng·mL-1EGF分別為對照組的2.18±0.127.06±0.59和6.73±0.31倍,EGF濃度為100 ng·mL-1Baxi基因表達量最高,而Gefitinib作用后可以顯著降低成熟COCs中Baxi基因的表達,其相對表達量為對照組的0.32±0.04倍。【結論】EGF和EGFR作為牦牛COCs體外成熟過程中重要的自分泌因子,且外源的EGF可以顯著提高卵母細胞成熟率、卵裂率及囊胚率,最佳作用濃度為100 ng·mL-1,其作用機制可能與調控凋亡相關基因Bax和Baxi表達有關。
    基于1H NMR技術的奶牛I型和II型酮病血漿代謝譜分析
    李影,徐闖,夏成,張洪友,孫玲偉,許楚楚
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2449-2459.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.018
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    【目的】運用代謝組學中1H NMR技術方法篩選出Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病與健康對照組之間血漿差異性代謝物。【方法】選取產后7—28 d,平均胎次為2—3胎的實驗奶牛50頭。根據血糖(Glc)、β-羥丁酸(BHBA)和游離脂肪酸(NEFA)的含量與臨床發病特點分為Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病與健康對照組,其中Ⅰ型酮病20頭,Ⅱ型酮病為20頭,健康對照組為10頭。當患病牛血中BHBA>1.20 mmol·L-1,Glc<2.50 mmol·L-1,NEFA>0.50 mmol·L-1時,被認為患I型酮病;當患病牛血漿中BHBA>1.20 mmol·L-1,Glc>2.80 mmol·L-1, NEFA>0.50 mmol·L-1時,被認為患II型酮病;當奶牛血中BHBA<1.00 mmol·L-1,Glc>3.75 mmol·L-1,NEFA<0.40 mmol·L-1時,被認為健康對照組。運用代謝組學中1H NMR技術對實驗奶牛的血漿代謝物分析,獲得相應的代謝圖譜,并結合多元統計分析中的主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的模式判別,從而尋找潛在的生物標記物。【結果】通過1H NMR分析,Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病與健康對照的代謝圖譜差異明顯,3組代謝產物各自聚集,分散區域顯著。Ⅱ型酮病與健康對照比較,獲得7種血漿差異代謝物,主要為丙氨酸、賴氨酸、β-羥丁酸、丙酮、乳酸等,其中血漿中β-羥丁酸、丙酮、乳酸濃度升高;丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸、肌酸濃度呈現下降。Ⅰ型酮病與健康對照組比較,獲得19種血漿差異代謝物,主要為酪氨酸、苯丙氨酸、肌酸、β-羥丁酸、丙酮等,其中β-羥丁酸、丙酮濃度升高;酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、丙氨酸、肌酸、肌醇、β-葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、檸檬酸、α-葡萄糖、甲酸、甘氨酸、O-乙酰葡萄糖胺、磷酸膽堿濃度呈現下降。Ⅰ型酮病與Ⅱ型酮病比較,獲得24種血漿差異代謝物,主要為檸檬酸、組氨酸、β-葡萄糖、異亮氨酸、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等,其中β-羥丁酸、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白、異亮氨酸、纈氨酸、丙酮、亮氨酸、乙酸濃度升高;檸檬酸、酪氨酸、組氨酸、肌醇、谷氨酰胺、β-葡萄糖、苯丙氨酸、谷氨酸、α-葡萄糖、賴氨酸、甲酸、甘氨酸、磷酸膽堿、丙氨酸、O-乙酰葡萄糖胺濃度呈現下降。【結論】1H NMR技術與多元統計分析的有效結合能夠有效的篩選出Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病與健康對照組之間血漿差異性代謝物,為進一步探究奶牛Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病的發病機理和診斷與防治提供了新的方向。
    TGF-β/Smad信號通路在Follistatin調節鴨骨骼肌衛星細胞增殖過程中的作用機制
    林凱,虞德兵,解曉東,于敏莉,李東鋒,杜文興
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2460-2468.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.019
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    【目的】卵泡抑素(Follistatin)能夠調節骨骼肌肥大和脂肪沉積,可促進骨骼肌衛星細胞增殖。擬采用體外重組 Follistatin處理增殖期的鴨骨骼肌衛星細胞,闡明TGF-β/Smad信號通路在Follistatin調節鴨骨骼肌衛星細胞增殖過程中的作用機制。【方法】以孵化14 d的鴨胚為試驗材料,采用差速貼壁的方法分離骨骼肌衛星細胞,待細胞長到70%—80%時,將培養基換成含有濃度分別為0、1、10、100 ng·mL-1Follistatin培養基,繼續培養36 h后,采用CCK-8檢測骨骼肌衛星細胞增殖情況;使用抗pax7抗體染色,DAPI染核,鑒定骨骼肌衛星細胞;采用real-time qPCR方法檢測Follistatin對骨骼肌衛星細胞增殖過程中的標記基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信號通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表達的影響。【結果】在倒置顯微鏡下觀察,傳代培養12 h鴨骨骼肌細胞一部分未貼壁呈圓形,一部分貼壁呈梭形。24 h后細胞全部貼壁,細胞略有變長。2 d后細胞繼續增多,且呈長梭形。3 d后細胞數目增加,個別細胞融合。4 d后細胞數目進一步增加,細胞變粗,個別細胞融合。5 d后有少量細胞開始分化,細胞進一步融合。Pax7免疫熒光染色分析顯示,95%以上的細胞中Pax7呈陽性表達;CCK-8檢測細胞增殖分析表明,不同濃度的Follistatin處理鴨骨骼肌衛星細胞后,各處理組細胞增殖均顯著高于對照組(P<0.01),且10 ng·mL-1 Follistatin處理鴨骨骼肌衛星細胞增殖效果最明顯,為最佳處理濃度;與對照組相比,10 ng·mL-1 Follistatin處理組的MyoD基因表達量顯著下降(P0.05),PCNA基因表達量顯著升高(P<0.05),Myf5基因表達量顯著升高,TGF-β和Smad2基因表達顯著升高(P<0.05),且Smad3基因表達量極限著升高(P<0.01);Western blotting檢測蛋白表達水平結果表明,與對照組相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也顯著升高。【結論】10 ng·mL-1 Follistatin能顯著促進鴨骨骼肌衛星細胞增殖,這一過程可通過TGF-β/Smad信號通路實現。使用最佳Follistatin處理濃度能夠顯著促進鴨骨骼肌衛星細胞增殖,該研究為鴨骨骼肌生長發育調控機理研究奠定分子基礎。
    研究簡報
    利用全基因組SNP芯片分析油菜遺傳距離與雜種優勢的關系
    桑世飛,王會,梅德圣,劉佳,付麗,王軍,汪文祥,胡瓊
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2469-2478.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.020
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    【目的】利用單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,簡稱SNP)標記估算油菜優異親本間的遺傳距離,分析其與雜種優勢間的關系,探討利用SNP標記預測油菜雜種優勢的可行性,為油菜雜種優勢利用育種提供指導。【方法】將油菜波里馬細胞質雄性不育系的6個保持系(1019B、1055B、6098B、8908B、6019B、ZS11B)和8個恢復系(R1、R2、R3、R6、R9、R10、R11、OR1)采用不完全雙列雜交試驗設計配制得到的46個F1雜種及其親本,在湖北武漢、貴州貴陽和安徽巢湖3種生態環境下考察株高、分枝部位高度、一次有效分枝數、結角密度、主花序有效長、主花序有效角果數、單株有效角果數、每角粒數、千粒重及單株產量共10個產量相關性狀,統計各性狀在每個F1組合中的雜種優勢,包括中親優勢和超親優勢。利用油菜全基因組60K SNP芯片對14個親本進行基因型分型,對分型得到的SNP標記經質控后利用MEGA5.0軟件估算親本間的遺傳距離,采用非加權類平均法(unweighted pair group method arithmetic averages,UPGMA)對親本進行聚類分析,利用SAS9.1軟件進行遺傳距離與性狀雜種優勢的相關性分析。【結果】14個親本經油菜全基因組60K SNP芯片進行基因型分型后共得到52 157個SNP位點,經質量控制后,最終篩選出40 201個SNP有效位點用于親本遺傳距離計算及聚類分析。14個親本中以6098B與6019B的遺傳距離最小,ZS11B與R6的遺傳距離最大,所有親本間的遺傳距離介于0.1883—0.8811,平均為0.5217。14個親本被分成4個主群,6個保持系為一個主群,8個恢復系中OR1單獨為一個主群,R1、R3、R11為一個主群,R2、R6、R9、R10為一個主群,證明恢復系群體的遺傳變異大于保持系,分群結果與實際系譜相符。所考察的10個性狀的中親優勢均值變幅為-0.07%—38.78%,超親優勢均值變幅為-7.74%—20.78%。10個性狀中除了一次有效分枝數外,其他性狀的雜種優勢效應顯著,尤其是株高、每角粒數、分枝部位高度和單株產量,平均中親優勢分別達到6.83%、15.31%、16.13%和38.78%,正向中親優勢組合數分別有45、41、46和46個;平均超親優勢分別達到3.18%、5.19%、7.85%和20.78%,正向超親優勢的組合數分別有41、31、42和44個。10個性狀中株高、分枝部位高度和單株產量的雜種優勢與遺傳距離的相關系數達到極顯著正相關水平,該3個性狀的中親優勢與遺傳距離的相關系數分別為0.4200、0.5033和0.4711,超親優勢與遺傳距離的相關系數分別為0.3884、0.4051和0.4038,而其他性狀的雜種優勢與遺傳距離的相關性不顯著。【結論】SNP標記在油菜基因型分型、遺傳距離估算及聚類分析的研究中優勢明顯,基于全基因組SNP標記估算的遺傳距離與油菜株高、分枝部位高度和單株產量的雜種優勢相關性極顯著,說明基于油菜60K SNP芯片分析親本的遺傳關系預測油菜雜種優勢的效果顯著。
    TRV介導的大豆基因瞬時沉默體系的建立
    劉曉彬,劉娜,李福寬,吳立柱,張潔,王冬梅
    中國農業科學. 2015, 48(12):  2479-2486.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.021
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    【目的】病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技術已在植物基因功能研究領域得到廣泛應用。建立以TRV為載體介導的大豆基因瞬時沉默體系,為將煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介導的基因沉默技術在大豆與大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus,SMV)互作體系中對大豆基因功能進行研究提供基礎。【方法】從大豆品種冀豆7號(J7)葉片中特異性擴增八氫番茄紅素脫氫酶基因(GmPDS)的部分片段,并將該基因片段插入質粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真葉注射攜帶有TRV或TRV﹕GmPDS的農桿菌,注射后對上部未接種病毒的葉片進行表型觀察,并通過半定量RT-PCR檢測GmPDS的表達量。為探討接種TRV是否影響大豆對SMV的抗性表現,在大豆第一片真葉上預接種TRV病毒后10 d,再分別接種SMV株系N3和SC-8,以單獨接種N3或SC-8作為對照。待接種SMV后第5天觀察未接種的上位葉表型并檢測SMV的外殼蛋白基因CP【結果】大豆葉片注射攜帶有TRV﹕GmPDS的農桿菌后25 d,上部未接種病毒的葉片出現了白化現象,通過半定量RT-PCR分析,發生白化的植株中GmPDS的表達量明顯降低。在此基礎上,向大豆葉片預注射攜帶有TRV的農桿菌后再接種SMV,SMV株系N3和SC-8與J7分別組成不親和與親和組合。 發現J7第一片真葉上預接種TRV后再接種SMV株系N3,與單獨接種N3對上位葉的影響在表型上表現一致,對未接種的上位葉片進行病毒外殼蛋白基因CP檢測,發現J7單獨接種N3以及預接種TRV后再接種N3的上位葉片上均未能檢測到CP表達。而J7單獨接種SMV株系SC-8,以及預接種TRV后再接種SC-8均在上位葉上能夠檢測到CP。說明在J7上預接種TRV不影響J7對SMV的抗性。在感病品種南農1138-2上也獲得了相似結果。【結論】建立了以TRV為載體介導的大豆基因瞬時沉默體系,并證明在大豆上先接種TRV不改變大豆對SMV的抗性表現。
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