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當期目錄

    2015年 第48卷 第15期 刊出日期:2015-08-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    基于關聯分析的新陸早棉花品種農藝和纖維品質性狀優異等位基因挖掘
    聶新輝,尤春源,鮑健,李曉方,惠慧,劉洪亮,秦江鴻,林忠旭
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2891-2910.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.001
    摘要 ( 598 )   HTML ( 2 )   PDF (3343KB) ( 708 )   收藏
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    【目的】尋找與新陸早棉花品種農藝和纖維品質性狀相關聯的分子標記,鑒別與這些性狀相關的優異等位變異及攜帶優異等位變異基因的典型載體材料,為新陸早棉花品種分子設計育種奠定基礎。【方法】利用篩選出分布于26條染色體且多態性高的75對SSR標記對51份新陸早棉花品種進行多態性掃描;采用R語言編程軟件對多環境的表型性狀繪制boxplot圖;在對供試材料進行群體結構和連鎖不平衡分析的基礎上,利用TASSEL軟件中MLM(mixed linear model)方法進行分子標記與15個性狀的關聯分析;依據計算的表型效應值,鑒別和統計優異等位變異的位點及典型材料。【結果】通過群體遺傳結構分析將51份新陸早棉花品種劃分為4個亞群結構。針對15個表現型性狀的BLUP(best linear unbiased prediction)結果進行統計和分析,鑒別出極顯著和顯著相關的性狀。分析結果顯示,在4種環境條件下,棉花5個性狀(果枝始節高、果枝始節數、衣分、纖維上半部長度和短纖維率)變化趨勢穩定,10個性狀(株高、果枝數、葉枝數、有效鈴數、單鈴籽棉重、單鈴皮棉重、馬克隆值、比強度、纖維整齊度和纖維伸長率)較穩定。通過關聯分析,獲得與農藝性狀相關的等位變異位點117個(P<0.05),其中對9個農藝性狀貢獻率(R2)最大的等位變異位點分別為:BNL3650b(株高,R2=11.78;果枝始節高,R2=20.80;果枝始節數,R2=11.54)、NAU3995c(果枝數,R2=14.86)、BNL119b(葉枝數,R2=9.7)、NAU3995d(有效鈴數,R2=14.98)、BNL3255a (單鈴籽棉重,R2=11.11)、NAU1071a(單鈴皮棉重,R2=10.15)和BNL663a(衣分,R2=12.42)。與纖維品質相關的等位變異位點55個(P<0.05),其中分別對6個纖維品質性狀貢獻率最大的等位變異位點為:NAU1103b(纖維上半部長度,R2=6.4)、NAU1071a(纖維比強度,R2=7.57)、BNL3140b(馬克隆值,R2=12.06)、BNL3650b(纖維整齊度,R2=13.47)、BNL1421a(短纖維率,R2=13.04)和BNL2960b(纖維伸長率,R2=11.67)。共檢測到39個與農藝(29個)和纖維品質(10個)性狀相關的位點(P<0.01),對表型變異解釋率范圍為6.45%—20.8%,平均值為11.14%,同時檢測到與2個以上性狀相關聯的位點47個。攜帶優異等位變異基因的典型材料共計17份。通過與已經報道的棉花農藝和纖維品質性狀相關的QTL(quantitative trait loci)比較,檢測的27個QTL在前人研究中已經報道,其中BNL3650(纖維整齊度)、BNL3033(馬克隆值)、NAU3254(纖維伸長率)、GH132(衣分)、TMB1618(比強度)、BNL1421(比強度和纖維整齊度)和BNL119(纖維伸長率)7個QTL具有相同的關聯性狀。【結論】51份原種新陸早棉花品種的群體遺傳結構簡單,連鎖不平衡水平低,表型性狀在2種環境條件下變化趨勢較穩定。基于SSR的關聯分析,發掘了一些與農藝和纖維品質相關的優異等位變異基因及典型材料。
    MicroRNA828負調控缺磷脅迫誘導的番茄花青素生物合成
    賈小云,劉慧,沈潔,李芳,丁娜,孫巖,高昌勇,李潤植
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2911-2924.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.002
    摘要 ( 462 )   HTML ( 1 )   PDF (4743KB) ( 764 )   收藏
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    【目的】深入解析番茄miR828的生物學功能,特別是參與番茄缺磷脅迫響應和花青素生物合成的調控作用。【方法】分別利用psRNATarget和RLM-5′ RACE預測和驗證miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5對番茄SlMYB7-like與部分R2R3 MYB轉錄因子氨基酸序列進行了多重比對和進化樹分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3個不同番茄種質中的表達和miR828在番茄(AC)中的組織特異性表達模式。以miR828過表達轉基因番茄和野生番茄為材料,設置正常供磷(+Pi,MS+KH2PO4 3.4 g·L-1)和缺磷(-Pi,MS+KCl 1.86 g·L-1)2個處理的培養試驗。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷脅迫下的表達模式。將野生型和miR828過表達的轉基因番茄植株缺磷培養15 d后,觀察番茄植株地上部分和地下部分的表型差異,通過qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like(SGN-U320618)和花青素合成相關酶基因(PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H)的表達模式,應用分光光度計測量各樣品的花青素含量。【結果】RLM-5′ RACE剪切試驗表明miR828對靶基因SlMyb7-like存在剪切調控作用,且剪切作用位點位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之間,從而驗證了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比對及進化樹分析顯示番茄SlMYB7-like與擬南芥AtMYB7和金魚草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有與花青素合成相關的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表達最高,在LA1996中的表達最低。相反,miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表達水平最高,在MicroTom中的表達水平最低。qRT-PCR分析顯示SlMyb7-like的表達模式與miR828相反,證明SlMyb7-like被miR828調控。正常供磷條件下,野生型番茄各組織中miR828的表達量普遍較低,但在花芽、花和綠果中相對較高;miR828過表達轉基因番茄植株中各花青素合成相關基因的表達量降低為野生型植株的30%—60%,花青素含量降低為野生型植株的40%。在缺磷脅迫下,野生型和miR828過表達轉基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表達均受到誘導上調表達;轉基因番茄植株地上部分和根系生長受到的抑制程度均小于野生型番茄;轉基因番茄植株的顏色較野生型番茄植株顏色淺;轉基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相關基因的表達以及花青素含量均低于野生型植株;miR828過表達轉基因番茄植株缺磷脅迫耐受性卻高于野生型番茄。【結論】在番茄中,miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所測組織中miR828的表達量普遍較低,但在花芽、花和綠果中相對較高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表達受缺磷脅迫誘導。在正常供磷和缺磷條件下,miR828過表達轉基因番茄植株中各花青素合成相關基因的表達量和花青素含量均低于野生型,表明miR828通過靶向SlMyb7-like負調控花青素合成相關基因的表達,進而負調控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能夠提高番茄對缺磷脅迫的耐受性。
    紫花苜蓿NAC類轉錄因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析
    申玉華,徐振軍,唐立紅,楊曉坡,黃文婕,武小斌,張文波
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2925-2938.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.003
    摘要 ( 472 )   HTML ( 2 )   PDF (4153KB) ( 661 )   收藏
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    【目的】NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子,N端含有一段高度保守、約150個氨基酸組成的NAC結構域,而C端為高度變異的轉錄調控區。NAC轉錄因子不僅參與植物生長發育的調控,而且在植物抗逆反應中具有重要的調控作用。作者從紫花苜蓿中克隆了一個NAC類轉錄因子基因MsNAC2,期望通過分析其DNA和氨基酸序列特征,闡明其在紫花苜蓿中響應非生物脅迫的表達模式,通過在煙草中過量表達鑒定其生物學功能,為進一步了解MsNAC2在紫花苜蓿中的耐逆調控機理提供試驗基礎,并為通過轉基因技術改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品質奠定研究基礎。【方法】應用RT-PCR和RACE技術獲得紫花苜蓿MsNAC2全長序列,并進行生物信息學分析。應用real-time PCR技術分析該基因在非生物脅迫下的時空表達特征。構建MsNAC2-GFP融合表達載體,進行基因表達的亞細胞定位分析。同時構建pBI121-MsNAC2植物超表達載體,通過農桿菌介導法轉化煙草葉盤,比較逆境脅迫條件下野生型煙草和轉基因株系的表型和生理指標,鑒定超表達MsNAC2對煙草耐逆能力的調控效應。【結果】MsNAC2全長1 358 bp,開放閱讀框長度為1 023 bp,編碼340個氨基酸,編碼蛋白質分子量為39.4 kD,其N端含有典型的NAC保守結構域,C端高度變異。進化樹聚類分析表明,該基因與臍橙CsNAC親緣關系較近,屬于NAC蛋白的ATAF亞家族。洋蔥亞細胞定位分析表明MsNAC2定位于細胞核。轉錄水平表達分析表明MsNAC2受250 mmol·L-1 NaCl、20% PEG6000、0.1 mmol·L-1 ABA和4℃脅迫誘導而顯著升高,并且MsNAC2在根中的表達量要明顯高于在葉中的表達量。抗性試驗結果顯示,在NaCl、PEG和4℃冷害脅迫下,轉基因煙草苗高、根長、鮮重和干重等生長指標均高于野生型。生理指標檢測結果表明,在250 mmol·L-1 NaCl、20% PEG6000和4℃處理24 h后,轉基因煙草葉片丙二醛含量明顯低于野生型煙草,分別為野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型煙草,分別達1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型煙草,分別為野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【結論】從紫花苜蓿中克隆了一個新的NAC轉錄因子基因MsNAC2,該基因能夠對鹽、冷害和干旱脅迫產生響應,與野生型煙草相比,過量表達MsNAC2煙草具有較強的耐鹽、抗旱和抵御寒冷的能力,說明該基因可能參與調控非生物逆境脅迫的生理響應。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    施氮量對春谷農藝性狀、光合特性和產量的影響
    張艾英,郭二虎,王軍,范惠萍,李瑜輝,王麗霞,王秀清,程麗萍
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2939-2951.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.004
    摘要 ( 501 )   HTML ( 1 )   PDF (1138KB) ( 787 )   收藏
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    【目的】通過分析不同氮素水平下春谷品種農藝性狀、光合特性與產量的變化規律,確定春谷最佳施氮量,并探討光合特性與產量相關性。【方法】以春谷品種長農35號和晉谷21號為試驗材料,采用裂區設計,品種為主區、施氮量為副區,重復3次,小區面積15.0 m2(5 m×3 m),留苗30萬株/hm2。共設0(N1)、45(N2)、90(N3)、135(N4)、180(N5)和 225 kg·hm-2(N6)6個氮素水平,40%氮肥作底施,60%在拔節至孕穗期追施。于谷子抽穗后,用日本產葉綠素測定儀SPAD-502(Konica Minolta)測定頂三葉SPAD值,用美國產CIRAS-2光合速率儀(PPSYSTEMS)測定谷子頂三葉的細胞間隙二氧化碳濃度(Ci)、光合速率(Pn)和蒸騰速率(E)。【結果】隨著氮素水平的提高,春谷品種的株高、莖粗、穗長呈上升趨勢,穗重、穗粒重、旗葉與頂三葉SPAD值、蒸騰速率(E)及光合速率(Pn)表現為先升高后降低,千粒重在各氮素處理間無顯著差異,氮水平為90 kg·hm-2 時,以上各指標值(千粒重除外)達到或接近最大,產量趨于穩定,預示氮肥施用量90 kg·hm-2 為春谷最佳施氮量,進一步通過2個春谷品種產量隨氮素施用量變化回歸方程計算出最高理論產量,方差分析表明兩品種最高理論產量和施氮90 kg·hm-2 時產量無顯著差異(P長農35號=0.5571、P晉谷21號=0.6632)。綜合以上結果,將90 kg·hm-2 施氮量確定為春谷最佳施氮量。春谷光合生理指標與產量相關性分析表明:谷子旗葉蒸騰速率(E)及光合速率(Pn)與產量相關系數分別為 0.87和0.86,頂三葉總蒸騰速率(E)及總光合速率(Pn)與產量相關系數分別為 0.82和0.83,4個相關系數值均達到顯著水平。【結論】明確了春谷品種在山西中南部生態氣候和土壤條件下的最佳施氮量為90 kg·hm-2,發現谷子開花后旗葉蒸騰速率(E)及光合速率(Pn)、頂三葉蒸騰速率(E)及光合速率(Pn)與春谷產量呈顯著正相關。
    中國冬油菜栽培方式變遷與相應的養分管理策略
    王寅,魯劍巍
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2952-2966.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.005
    摘要 ( 345 )   HTML ( 1 )   PDF (1688KB) ( 688 )   收藏
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    直播和育苗移栽是目前長江流域冬油菜并存的兩種栽培方式,其技術發展和推廣狀況對中國油菜產業發展和油料供應安全具有重要意義。不同的歷史階段下,隨栽培品種、種植目標、勞動力條件和生產力水平等因素的變化,中國冬油菜栽培方式也在不斷的轉變和發展。文章概述了新中國建立后冬油菜栽培方式的發展變化歷程,從最初以直播種植為主,到20世紀60年代中期直播為主而育苗移栽開始起步,20世紀80年代育苗移栽方式實現全面推廣并長期應用,再到當前直播和育苗移栽兩種栽培方式并存。而養分管理措施也經歷了從最初施用農家肥,到開始施用氮、磷化肥,到提倡氮、磷、鉀、硼肥配合施用,再到當前形成的育苗移栽油菜高產高效養分管理技術。直播和育苗移栽油菜的栽培特點和生長過程存在著顯著差異,文章主要從生育進程、種植密度、群體結構與個體形態等方面對兩者進行了分析和比較。相比育苗移栽油菜,直播油菜的生育期一般相應縮短,個體生長狀況較弱,單株產量偏低,但在較高的種植密度基礎上可發揮群體優勢,且根群結構也有助于增強養分和水分吸收能力,因此具有高產高效的潛力。目前,長江流域育苗移栽油菜的養分豐缺指標和推薦施肥體系已經建立,養分管理策略也較為完善,其要點為:根據土壤肥力狀況和目標產量水平合理確定氮、磷、鉀、硼肥用量,保證養分平衡供應,實行有機無機肥料配合施用,采取氮、鉀肥分次施用(推薦基肥﹕越冬肥﹕薹肥=60%﹕20%﹕20%)以協調生長發育和養分吸收,強壯個體而實現高產。針對直播油菜發展迅速而在高產條件下養分管理研究相對滯后的現狀,文章重點比較了其與育苗移栽油菜在養分響應、吸收分配和需求利用等方面的差異,發現直播油菜對養分缺乏較為敏感,養分不足導致個體生長低下和群體衰亡,后期物質和養分轉運效率較低,而且對磷、鉀養分的需求明顯更高。基于已有研究結果總結出直播油菜的“前促后穩”養分管理策略,即在氮、磷、鉀及微量元素養分合理平衡施用基礎上,保證磷、鉀供應,施用有機肥并進行秸稈還田,肥料運籌中重視氮肥對個體和群體發展的調控作用,減少基施而增加苗肥以促前期生長,中后期適時追肥以保證群體數量和產量形成,推薦基肥﹕苗肥﹕越冬肥﹕薹肥=40%﹕30%﹕15%﹕15%。此外,應配合其他栽培措施協同增效提質,選用適宜早熟和耐密的品種,采用機械化精量播種技術,施用長效專用復合肥或專用控釋肥,配合密植以省肥補遲、增庫促源,加強病蟲草害防控技術。文章還對直播油菜養分管理研究中的問題和未來方向進行了探討和展望,以期為進一步完善其栽培管理措施和科學施肥技術提供參考。
    植物保護
    中國冬小麥區域試驗品種抗病性評價
    劉太國,邱軍,周益林,徐世昌,陳懷谷,劉艷,高利,劉博,鄭傳臨,陳萬權
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2967-2975.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.006
    摘要 ( 438 )   HTML ( 3 )   PDF (413KB) ( 605 )   收藏
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    【目的】明確中國小麥主要后備品種和高代品系對條銹病、葉銹病、稈銹病、白粉病、赤霉病、紋枯病、黃矮病的抗性程度和水平,為培育抗病新品種、品種審定與推廣、抗病品種合理布局、降低品種抗性“喪失”風險提供依據。【方法】以中國小麥條銹菌流行小種條中32(CYR32)、條中33號(CYR33)等、葉銹菌PHT、THT等、稈銹菌21C3、34C2等、對15個已知抗白粉病基因具有毒性的白粉菌混合菌系、赤霉病菌、紋枯病菌強毒力菌株和BYDV-GAV株系對1999—2014年度國家小麥區域試驗品種(系)1 815份次試驗材料進行成株期人工接種抗性鑒定,重要材料連續進行兩年試驗,以確保結果的重復和可靠。【結果】在所鑒定的品系中,具有3種抗病性以上的品種(系)共250個,通過農業部國家農作物品種審定委員會審定的品種共310個;中抗和高抗條銹病品種占參試品種的(39.8±21.7)%、中感和高感品種占(39.7±27.9)%;赤霉病、紋枯病、稈銹病和白粉病抗病品種所占比例分別為(31.5±27.5)%、(31.1±35.6)%、(48.2±25.6)%和(25.0±14.6)%、感病品種分別占(68.5±27.5)%、(62.2±38.6)%、(31.3±20.7)%和(70.7±14.6)%;抗葉銹病品種比例僅為(9.9±3.8)%,感病品種高達(70.4±15.1)%;除河農831表現中抗外,所有品種對黃矮病均表現感病,未出現高抗品種。【結論】抗源缺乏的病害未鑒定出抗性強的品種,抗條銹病和白粉病品種主要出現在甘肅、四川等地,抗葉銹小麥品種(系)較少。
    褐飛虱Yellow基因的克隆及功能
    王博,姚云,徐澤煒,林欣大
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2976-2984.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.007
    摘要 ( 345 )   HTML ( 8 )   PDF (5409KB) ( 14615 )   收藏
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    【目的】克隆褐飛虱(Nilaparvata lugens)Yellow基因(NlYellow),研究該基因在褐飛虱不同發育時期和不同組織中的表達譜,通過RNA干擾沉默NlYellow了解其功能。【方法】使用網絡版primer3設計引物克隆NlYellow,將得到的cDNA序列翻譯為氨基酸序列后,與GenBank數據庫中其他物種的Yellow序列進行同源比對,并構建系統發育樹。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術,研究褐飛虱胚胎、1-5齡若蟲以及成蟲期NlYellow的相對表達量,并檢測該基因在雌、雄成蟲頭、胸、腹、足、翅、卵巢和睪丸等組織中的相對表達量。向褐飛虱5齡若蟲體內注射0.4 µg針對NlYellow的雙鏈RNA,待羽化為成蟲后觀察表型。【結果】克隆得到NlYellowORF序列,通過序列比對發現它與豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)Yellow的氨基酸序列同源性最高(98%),但與黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyx mori)等物種的氨基酸序列同源性較低。系統發育樹分析顯示它與豌豆蚜的親緣關系最近。qRT-PCR顯示NlYellow在胚胎期表達水平具有波動性,其中第1、3、4和5天中的表達量低于其他時段的表達量。此外,NlYellow在3齡和5齡若蟲期表達量高于其他若蟲期(P<0.05);該基因在雄蟲頭、胸、翅、足、中腸和睪丸中均有表達,但前4個組織中表達量相對較高(P<0.05);而在雌蟲中,該基因只在頭、胸、翅、足中表達。另外,該基因在短翅成蟲中表達水平顯著高于長翅成蟲(P<0.05),并且在短翅成蟲當中,雄蟲中的表達量高于雌蟲并達到顯著水平(P<0.05)。采用RNA干擾技術沉默NlYellow后,褐飛虱成蟲整體體色變黃,胸、腹和足顏色變化尤其明顯。【結論】初步推測NlYellow的功能是參與外表皮色素沉積,改變體色。
    防治薊馬的球孢白僵菌SDDZ-9菌株液體發酵工藝優化
    張璐璐,吳圣勇,王帥宇,李娟,雷仲仁
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2985-2994.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.008
    摘要 ( 379 )   HTML ( 1 )   PDF (2728KB) ( 536 )   收藏
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    【目的】球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作為一種重要的蟲生真菌,已廣泛應用于害蟲生物防治,但其不成熟的規模化生產技術一直是限制球孢白僵菌廣泛應用的主要問題之一。開展球孢白僵菌液體發酵工藝研究,提高液體發酵生物量,從而為固體發酵階段提供優質的種子液,進而提高固體發酵的產孢量,為球孢白僵菌規模化生產提供參考。【方法】影響球孢白僵菌液體發酵的培養條件有溫度、裝樣量、搖床轉速、接種濃度和pH等,首先采用Plackett-Burman試驗設計,篩選出影響球孢白僵菌菌株SDDZ-9的液體發酵的主要因子,然后運用最陡爬坡路徑法,以試驗值變化的梯度方向和各因素效應值的大小分別確定爬坡方向和變化步長,確定響應面的中心點,逼近最佳值區域,最后采用central composite design (CCD)響應曲面法,建立多元二次回歸方程來擬合各因素與效應值之間的關系,并對影響發酵生物量的各因素及其交互作用進行響應面分析和評價,確定對西花薊馬(Frankliniella occidentalis)毒力較高的球孢白僵菌菌株SDDZ-9液體發酵的最優培養條件。【結果】培養溫度、裝樣量、轉速和濃度是影響發酵生物量的主要因子,一定范圍內的pH變化對此菌株的液體發酵影響較小。在自然pH下,當培養溫度27.08℃、裝樣49.72 mL(250 mL三角瓶)、搖床轉速205.45 r/min、接種濃度1.122×107孢子/mL時,發酵48 h產生的生物量最大。在優化發酵條件下進行液固雙相發酵試驗,得到的球孢白僵菌液體發酵生物量為14.769 g·L-1,與模型預測生物量相符,固體發酵后產孢量為20.16 g·kg-1,含孢量1.84×1011孢子/g。【結論】在優化發酵工藝條件下進行發酵,可顯著提高球孢白僵菌的產孢量,此液體發酵工藝為球孢白僵菌的規模化生產奠定了基礎。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    基于Meta-Analysis研究施肥對中國農田土壤有機碳及其組分的影響
    蔡岸冬,張文菊,楊品品,韓天富,徐明崗
    中國農業科學. 2015, 48(15):  2995-3004.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.009
    摘要 ( 384 )   HTML ( 1 )   PDF (418KB) ( 774 )   收藏
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    【目的】施肥是影響農田土壤有機碳至關重要的因素之一。探討施肥對不同利用類型與種植制度下土壤有機碳的影響程度,對于深刻認識農田土壤有機碳及其可持續管理均具有重要意義。【方法】收集已公開發表文獻數據,建立具備相同有機碳分組方法但相對獨立的286組數據庫。采用數據整合分析方法(Meta-analysis),定量分析種植制度、利用類型等人為管理及土壤屬性(質地)等因素下施肥(化肥和有機肥)對土壤總有機碳及礦物結合態組分含量的影響程度。【結果】與不施肥相比,施肥均能顯著提高土壤總有機碳和礦物結合態組分的含量,其提高的幅度分別為39.4%和27.7%;且施用(增施或配施)有機肥對土壤總有機碳及礦物結合態組分的提高幅度(58.4%和41.9%)是化肥(13.4%和8.0%)的3.4倍和5.2倍。不同種植制度、利用類型和土壤質地條件下,施用化肥和有機肥對土壤總有機碳和礦物結合態組分的影響程度存在顯著差異。一年一熟下,施用有機肥對土壤總有機碳的提高幅度(58.5%)顯著高于一年兩熟制(55.6%),施用化肥對礦物結合態組分含量的提高幅度(10.7%)也顯著高于一年兩熟(7.3%);但兩種種植制度下施用有機肥對礦物結合態組分含量的提高幅度基本相當(42.6%—43.5%)。不同利用類型下,施肥能顯著提高旱地土壤總有機碳及礦物結合態組分,且提高的幅度均高于水田;但施用化肥并沒有顯著提高水田中土壤總有機碳和礦物結合態含量。不同土壤質地條件下,施用有機肥能使土壤總有機碳水平較低的砂土提高64.4%,顯著高于土壤有機碳水平較高的壤土和黏土(48.7%和50.3%);施用化肥使礦物結合態組分含量較低的砂土提高15.6%,其提高的幅度均顯著高于礦物結合態組分含量較高的壤土和黏土(7.8%和8.1%)。【結論】有機肥的施用(增施或配施),尤其在一年一熟及有機碳水平較低的砂土上,對于農田土壤有機碳積累及肥力維持與提升均具有重要意義。
    不同施肥制度下中國東部典型土壤易分解與耐分解氮的組分特征
    于維水,盧昌艾,李桂花,武紅亮,趙雅雯,王碧勝,孟繁華
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3005-3014.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.010
    摘要 ( 348 )   HTML ( 1 )   PDF (410KB) ( 294 )   收藏
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    【目的】土壤易分解氮(labile nitrogen,Lab-N)和耐分解氮(recalcitrant nitrogen,Rec-N)是土壤氮庫的兩個重要組分,其組分含量與比例可反映土壤有機氮周轉與固存特性。因此,研究土壤長期不同施肥制度下易分解氮與耐分解氮的含量及比例特性,是土壤氮庫管理與土壤肥力質量建設的重要研究內容。【方法】利用中國東部3種旱作土樣(吉林公主嶺黑土、河南鄭州潮土、湖南祁陽紅壤)和1種水稻土土樣(湖南望城),運用顆粒密度分組法,研究長期不施肥(CK)、施化肥(NPK)、化肥配施秸稈(NPKS)和化肥配施有機肥(NPKM)4種不同施肥制度下易分解氮和耐分解氮的含量及比例變化特征。【結果】旱作土壤易分解氮的平均含量為0.15 g·kg-1(0.10—0.29 g·kg-1)低于水田的0.22 g·kg-1(0.20—0.23 g·kg-1),而其占全氮的比例高于水田。經23年處理后,旱作土壤CK處理全氮含量較試驗初期氮含量顯著下降,下降的比例為7.5%—9.7%,水稻土則顯著上升,升高的比例為11.5%;長期NPK處理,旱作土壤和水田全氮含量較CK顯著增加,紅壤易分解氮含量較CK易分解氮顯著下降,其他地點無顯著變化;長期NPKS處理,旱作和水田土壤全氮含量顯著增加,黑土和水稻土易分解氮含量及其占全氮的比例較CK無顯著變化,紅壤易分解氮含量顯著下降,而潮土易分解氮含量顯著增加;長期NPKM處理,顯著提高了旱作土壤全氮含量、易分解氮含量及易分解氮占全氮的比例,其中黑土增加的比例最大分別為85.0%、106.0%和4.2%,水稻土易分解氮含量及其占全氮的比例無顯著差異性。4種土壤耐分解氮的含量與全氮含量的變化趨勢一致,均表現為NPKM>NPKS>NPK>CK,其中NPKM處理降低了耐分解氮占全氮的比例。【結論】旱作土壤易分解氮含量及其占全氮的比例對不同施肥處理的響應比水田更加敏感。化肥配施有機肥處理顯著提高了旱作土壤全氮含量、易分解氮含量及其占全氮的比例,效果優于秸稈還田,更優于化肥處理。
    園藝
    中國主要落葉果樹果實硒含量及其膳食暴露評估
    聶繼云,匡立學,李志霞,龐榮麗,楊蓮,陳秋生,李安,趙旭博,徐維華
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3015-3026.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.011
    摘要 ( 261 )   HTML ( 1 )   PDF (495KB) ( 467 )   收藏
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    【目的】針對蘋果、梨、桃、葡萄、棗、獼猴桃等6種主要國產落葉果樹開展果實硒含量及其膳食暴露評估研究,明確硒含量水平及其對消費者健康的風險水平,為水果生產和消費提供參考。【方法】從主產區(包括安徽、河北、河南、江蘇、遼寧、山東、陜西和新疆)共采集760個水果樣品,采用氫化物原子熒光光譜法測定樣品硒含量。分別以硒耐受上限(UTL)、硒最高用量(UIL)和硒適宜膳食攝入量(AI)為評價標準,對中國成人和哺乳婦女每日從6種水果中攝入硒的量(包括平均攝入量、最高攝入量、中間攝入量和最低攝入量)進行風險評估。【結果】 ⑴ 測定的760個水果樣品,平均硒含量為4.3 μg·kg-1,最高硒含量為38.0 μg·kg-1,硒含量<5 μg·kg-1的樣品占78.2%,富硒(硒含量≥10 μg·kg-1)樣品占14.2%;⑵ 樣品間硒含量有異,變異系數分別達到80.0%(棗)、110.0%(葡萄)、116.8%(梨)、125.7%(獼猴桃)、126.0%(蘋果)、148.2%(桃)和136.5%(總體);⑶硒平均含量依次為棗(7.3 μg·kg-1)>葡萄(6.4 μg·kg-1)>桃(5.5 μg·kg-1)>獼猴桃(5.3 μg·kg-1)>梨(4.7 μg·kg-1)>蘋果(1.3 μg·kg-1);⑷ 陜西的梨和桃以及陜西和新疆的葡萄,其硒含量均明顯高于其他省份同類水果;⑸ 中國居民來自6種水果的硒平均攝入量分別為0.032 μg·d-1(獼猴桃)、0.120 μg·d-1(蘋果)、0.183 μg·d-1(葡萄)、0.197 μg·d-1(棗)、0.213 μg·d-1(桃)、0.222 μg·d-1(梨)和0.968 μg·d-1(總體);⑹ 風險評估結果顯示,中國居民從6種水果中攝入硒的量是安全的,風險指數均低于100%,為0.001%—99.702%(成人)和0.001%—31.847%(哺乳婦女)。【結論】中國6種主要落葉水果的硒含量均普遍較低,富硒產品比例均不高。棗硒含量最高,蘋果硒含量最低,其他4種水果之間硒含量差異不明顯。有的省份之間水果硒含量存在明顯差異。哺乳婦女來自6種水果的硒攝入風險均較成人低。中國居民從6種水果中攝入硒的量是安全的,不會影響人體健康。生產富硒水果是增加中國居民硒膳食攝入量的有效途徑。
    梨果實發育軟化與果膠多糖降解特性的關系
    齊秀東,魏建梅,高海生,賈艷茹,張海娥
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3027-3037.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.012
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    【目的】探討細胞壁果膠多糖降解特性與梨果實質地軟化和貯藏性的關系,進一步闡明果實軟化機理,為果實品質的提高及貯藏技術的完善提供理論依據。【方法】以‘鴨梨’和‘京白梨’為試材,根據果實發育和后熟特性,分別在果實發育和后熟軟化兩個階段進行定期采樣,用質構儀分析比較兩品種果實的質構參數變化特性,分別采用生化方法和瓊脂糖凝膠色譜柱層析法分析‘鴨梨’和‘京白梨’果實發育軟化過程中細胞壁果膠組分含量變化及其分子質量的分布特點,并測定果膠多糖降解相關酶活性的動態變化規律,以探討貯藏性不同的梨果實果膠多糖降解特性的差異。【結果】發育期,‘鴨梨’果實共價結合果膠(CSP)和離子結合果膠(ISP)含量迅速增加,顯著高于‘京白梨’,其水溶性果膠(WSP)含量緩慢增加且低于‘京白梨’,‘鴨梨’果實WSP和CSP均由低分子量組分向高分子量組分轉變。貯藏期,‘鴨梨’果實CSP含量高且恒定,WSP含量緩慢增加,但均保持較高的分子質量;而‘京白梨’果實CSP含量迅速降低,WSP和ISP含量快速增加,各果膠顯著地由高分子量組分向低分子量組分轉變。‘鴨梨’果實WSP、CSP和ISP含量變化僅在發育期與硬度變化顯著相關,而‘京白梨’果實果膠與硬度的顯著相關性主要表現在貯藏階段。果膠降解酶活性測定結果表明,兩品種的差異主要表現在貯藏期,即在貯藏階段‘京白梨’果實多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲酯酶(PME)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Af)的活性和增加速率均顯著高于‘鴨梨’,其中β-Gal和α-Af活性在‘京白梨’果實采收后即迅速增加,PG和PME相對滯后,且β-Gal和α-Af活性變化與硬度和各果膠組分含量變化間的相關度均強于PME和PG,此時期‘鴨梨’果實僅α-Af活性與ISP含量變化的相關性顯著。綜上,‘鴨梨’和‘京白梨’果實的果膠降解特性差異顯著,而且在果實軟化的不同階段表現不同,導致兩品種果實具有不同的后熟軟化和貯藏特性。【結論】耐貯性強的‘鴨梨’果實發育期表現明顯的大分子果膠組分積累和隨果實后熟軟化降解緩慢的特性,不耐貯的‘京白梨’果實發育期積累的大分子量果膠組分隨果實軟化迅速降解成小分子量組分。其中,難溶性果膠CSP含量的高低及其分子質量的分布是衡量梨果實耐貯性的重要指標。β-Gal和α-Af更促進‘京白梨’果實軟化。
    專題:流感病毒對人類和畜牧業健康的影響
    專題導讀:流感病毒對人類和畜牧業健康的影響
    王秀榮,陳化蘭
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3038-3039.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.013
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        流感病毒是一種分節段的、有囊膜包裹的負鏈RNA病毒,屬于正黏病毒科。根據其內部NP和M的不同,分為A、B、C三型[1]。到目前為止,禽流感(avian influenza,AI)只由A型流感病毒引起,B、C型流感病毒尚未在禽類體內發現。自然界中,A型流感病毒的宿主范圍相當廣泛,豬、馬、虎、水貂、狐貍、貓、鯨、禽類以及人體內都分離到A型流感病毒,是人畜共患的重要呼吸道疾病病原,具有特殊的重要性。
        A型流感病毒基因組由8個片段組成,從大到小依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS,共編碼11種病毒蛋白[2]。HA、NA與NP、M1、M2、PB1、PB2、PA共同構成病毒的組成成分,根據HA的不同將A型流感病毒進一步分為18個亞型。其中,H1—H16都能在禽類中發現,而H17—H18目前只在蝙蝠體內發現[3]。不同宿主中亞型分布存在差異,H1、H3在人群中廣泛傳播,H5、H7、H9在家禽體內流行廣泛,野生水禽則是AIV的主要自然宿主,可以分離到H1—H16亞型的病毒,病毒在水禽體內長期存在而不表現明顯臨床癥狀。NS1蛋白能夠直接調控病毒的復制過程,NS2介導病毒核糖核蛋白復合物的轉運過程。后發現的PB1-F2蛋白與流感病毒介導的細胞凋亡有關[4]
        眾所周知,1918年的西班牙H1N1流感,造成了美國50萬人死亡,全球至少5 000萬人死亡。近來利用反向遺傳技術救獲的來源于 1918 年流感基因的病毒相關研究表明,在動物模型中,1918年流感病毒 HA 基因對小鼠模型毒性增強起到了重要作用[5]。另外,1957 年亞洲H2N2流感造成 100 萬人死亡,1968 年香港H3N2流感估計造成200萬人死亡。2009 年暴發的 H1N1 大流感,到 2010423共引起超過17 853人死亡,該毒株致死率不高,但新病毒以前所未有的速度傳播,在大約8周內傳播到120個國家和地區,幾乎所有國家都有報道。流感病毒對人類健康、社會發展和經濟增長具有巨大影響及沖擊。
      禽流感是A型流感病毒感染各種禽類的總稱,對家禽養殖業危害非常嚴重。根據致病性不同,禽流感又劃分為高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)和低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)。影響最大的是H5亞型HPAI,已在60多個國家的家禽和野鳥中檢測出該亞型病毒,而且,在一些國家,主要是中國、印度、印度尼西亞、孟加拉國、埃及和越南,H5N1亞型禽流感已經發展成為危害養禽業健康發展的頭號重要病原。不僅僅是H5N1,與H5亞型組合的還有2008年臺灣爆發的H5N2亞型AI疫情[6],2014年初在日本和韓國爆發的H5N8亞型AI[7],今年美國也受到H5N8的嚴重影響,給養禽業造成重大損失。除H5亞型外,H7亞型HPAI也對家禽造成嚴重危害,2003年,荷蘭、比利時以及德國等國家出現H7N7亞型HPAI[8],短短幾周,荷蘭共有約900個農場內的1 400萬只家禽被隔離,1 800多萬只病雞被宰殺,引發H7N7禽流感蔓延歐洲。LPAI病毒通常不引起明顯臨床癥狀,但可引起雞群生產性能下降,伴有其他疾病混合感染,環境影響時可造成嚴重后果,目前家禽體內流行廣泛的LPAI以H9亞型為主。該亞型1966 年被報道引起威斯康星州火雞發病以來,已在多個國家被分離和報道,可以感染多種禽類,如雞、鴨、鵪鶉、野雞、鷓鴣、鴿、絲羽烏骨雞、歐石雞等。中國1994年首次分離到了H9N2亞型病毒,臨床表現為禽產蛋量下降,死亡率不高。
        禽流感除直接影響養禽業的發展外,還出現了直接感染人,引起嚴重的公共衛生的問題。1997年香港首次爆發了H5N1亞型HPAI跨越宿主屏障直接感染人并致死亡的事件[9],截止到2015年5月,全球共報告了人感染高致病性H5N1禽流感840例,其中死亡447例。病例分布于16個國家,其中,中國發現52例,死亡31例[10]。感染H5N1禽流感的多為年輕人和兒童。從1996—2012 年間,在荷蘭、意大利、加拿大、美國、墨西哥和英國有報告人感染H7N2、H7N3 和 H7N7亞型流感病毒的事件,除荷蘭有1人死亡以外,其他感染者大多僅有結膜炎和輕微的上呼吸道癥狀。在2013年3月,中國首次出現了人感染H7N9亞型流感病例,患者臨床表現均類似于流感癥狀,早期主要為呼吸道癥狀,體溫升高、咳嗽等癥狀,很快變成嚴重肺炎并出現呼吸困難。這是第一次報告人感染該亞型病毒,對人類健康造成了嚴重危害,引起廣泛關注的事例。此外,還陸續發現了H9N2和H10N8等亞型AI感染人事件,控制其在家禽中流行以降低傳播給人類的潛在風險是十分必要的。
        禽流感病毒不僅可以跨越種間障礙直接感染人,還為人的新型流感病毒提供供體基因。有證據表明 1918 年西班牙大流感是由 H1N1 禽流感傳染給人類而引起的;1957 年亞洲大流感是由 人H1N1流感重組了禽H2N2流感PB1、HA 和 NA三個基因片段而引起的;1968 年,人H3N2亞型流感是由禽源 H3病毒提供 PB1和HA基因,由1957年大流感提供其他內部基因而形成的重組毒株,重組后成為一個新的大流行毒株;2009年H1N1大流感是來源于北美豬群中流行的三源重組毒[11],其PB2和PA來源于禽類;2013年人感染的H7N9流感病毒,其內部基因來自于H9N2禽流感病毒[12]。人類歷史上出現的這幾次大流行的流感病毒都與禽流感密切相關。
        本專題圍繞目前中國獸醫行業內流感研究工作新進展,集中報道了來自禽或豬體內流感病毒的生物信息學、致病機理和診斷技術等方面的研究成果。通過學術交流和討論,加大對流感的宣傳,促進公眾對流感的認知,有助于提高人類對流感的防范意識,盡可能降低流感對社會秩序、食品安全和人類自身健康造成的沖擊和負面影響。
    一株鴨源H4N8亞型禽流感病毒的全基因測序及遺傳進化分析
    趙晴晴,李群輝,朱杰,鐘蕾,劉晶晶,顧敏,王曉泉,劉文博,劉秀梵
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3040-3049.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.014
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    【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根據其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神經氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分為16種HA和9種NA亞型。根據其致病力的差異可分為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。雖然H4亞型禽流感病毒為低致病性AIV,感染家禽表現為無癥狀感染,但其對禽類甚至是哺乳動物是一個潛在的威脅,因此必須要加強對H4亞型禽流感病毒的調查監控。【方法】為了探討H4亞型禽流感病毒的分子特征及遺傳演化規律,對2010年在中國華東地區某活禽市場進行流行病學監測時分離到的一株H4N8亞型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010(簡稱DK/NJ /1102)進行了全基因組序列測定及遺傳進化分析。通過常規的血清學試驗確定其HA亞型,提取病毒總RNA,并通過RT-PCR方法分別擴增出其各基因片段,連接 pGEM-Teasy載體上后進行序列測定。利用GenBank中的BLAST工具進行核苷酸序列的同源性分析,并與GeneBank 中的H4亞型流感病毒及其它相關序列進行遺傳進化分析。【結果】DK/NJ/1102的HA基因與Mongolia 分離株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,為98.9%。推導的氨基酸剪切位點序列為“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因與華東地區分離的鴨源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,達99.4%;PB1、PA和NP基因均與H1亞型禽流感病毒親緣關系最近;M基因與A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高達99.9%;NS基因與韓國2009年分離的H7N7亞型流感病毒遺傳距離最近。NS1蛋白的80-84處氨基酸沒有發生氨基酸缺失。【結論】該H4N8亞型禽流感病毒基因組構成比較復雜,可能是一株多基因重組病毒。
    H7N9亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法建立
    王云鶴,包紅梅,孫佳善,李雁冰,徐曉龍,王子龍,施建忠,曾顯營,王秀榮,陳化蘭
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3050-3055.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.015
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    【目的】2013年3月,中國國家衛生和計劃生育委員會宣布在上海、安徽地區發現了人感染H7N9亞型流感病毒事件,由于這種新型重組H7N9流感病毒未曾有過感染人或者動物的報道,因此出現了一系列亟待解決的問題,引起了全世界范圍的廣泛關注。根據H7N9亞型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,設計并合成靶基因為HA和NA的2對引物,建立快速檢測H7N9亞型禽流感病毒的一步法RT-PCR檢測方法。【方法】根據測序結果,用DNAStar生物軟件進行同源性分析比較,選出H7和N9基因中高度保守且特異的核苷酸區域,用oligo6.0軟件設計針對H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR擴增反應液,建立了一步法檢測H7N9亞型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亞型流感病毒為陽性對照,其他亞型流感病毒以及新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊等其他禽病病原作為陰性對照,按所建立的反應體系和反應程序進行RT-PCR反應,驗證所建立方法的特異性。對病毒含量為 106.5 EID50·mL-1 的 H7N9 亞型禽流感病毒尿囊液依次進行 10 倍倍比稀釋,提取RNA用RT-PCR 方法檢測,評價其敏感性。另外,采取雙盲試驗用熒光定量RT-PCR對該方法進行了比對驗證。【結果】用H7亞型特異性引物檢測 H1—H15 亞型禽流感病毒和雞新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亞型流感病毒外,其他樣品均為陰性;用N9亞型特異性引物檢測N1—N9 亞型禽流感病毒和其他禽病病原,僅當前流行的H7N9 亞型 AIV 樣品有特異性目的條帶,與其他N1—N9 亞型禽流感病毒和雞新城疫病毒等其他禽病病原均無交叉反應。通過對 H7N9亞型禽流感病毒尿囊液進行10倍倍比稀釋檢測,證實該方法最低檢出量為 1.4×102.5 EID50·mL-1,并可以從陽性棉拭子浸出液中擴增出目的基因片段。【結論】該RT-PCR 方法具有特異性強和準確率高的特點,可以作為H7N9亞型AIV核酸檢測的一種有效候選方法。
    H9N2亞型AIV鼠肺適應株的獲得及其氨基酸變異分析
    丁潔,高玉偉,桑曉宇,程凱慧,于志君,張坤,柴洪亮,王鐵成,夏咸柱,華育平
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3056-3063.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.016
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    【目的】將H9N2亞型禽流感病毒在豚鼠體內連續性傳播9代后,能夠穩定的在豚鼠間傳播,可見H9N2亞型禽流感病毒對哺乳動物的感染能力以及在哺乳動物間傳播的能力還是很強的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)簡稱JN,應用小鼠動物模型,研究H9N2亞型流感病毒在小鼠肺內適應性傳代后對小鼠的致病力,以及傳代過程中流感病毒的變異。檢測和篩選流感病毒致病性變異的關鍵氨基酸位點,探索H9N2亞型流感病毒變異的分子機制。【方法】將一株H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)在小鼠的肺臟進行傳代,將小鼠解剖、摘除肺部、研磨離心后經滴鼻接種下一代小鼠,傳播九代后,用MDCK細胞擴繁病毒,得到鼠肺適應株JN-P9-2-M1;擴增、克隆傳代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因測序,推斷各基因編碼的氨基酸,與JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比對,得到各代次病毒核苷酸與氨基酸變化的位點;解剖小鼠,獲得小鼠的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦和腸,滴定各組織中的病毒滴度,檢測病毒的組織噬性;乙醚麻醉小鼠后,每個病毒稀釋度鼻內接種3只小鼠,檢測小鼠的幸存率和發病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后進行病理切片和免疫組化,比較JN原代病毒與JN-P9-2-M1對小鼠肺部的損害。【結果】JN-P9-2-M1對小鼠的致病性明顯提高,其MLD50為103.5EID50,106EID50、105EID50、104EID50攻毒劑量的小鼠幸存率是0,而原毒JN對小鼠不致死,JN-P9-2-M1對小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒劑量為106—103EID50的小鼠,體重明顯減少,臨床癥狀也很明顯,攻毒后3—8 d,小鼠表現精神萎靡、被毛零亂、呼吸急促、弓背等癥狀,而原毒JN在106EID50時,小鼠的體重變化率都跟陰性對照組相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受體結合特性相同,都是只能特異性結合SAa-2,6Gal受體,具有人樣流感病毒的受體結合特性;JN病毒僅能在小鼠肺部檢測到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不僅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝臟、脾臟、腎臟和腦部都能檢測到。【結論】 JN-P9-2-M1對小鼠的致病性明顯提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3個位點可能是病毒對小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T這兩個點突變,就有可能是進一步提高病毒對小鼠致病力的關鍵位點。
    H9亞型AIV型特異性電化學發光免疫檢測方法的建立
    亓文寶,李芳,李華楠,黃麗紅,和君,穆光慧,羅開健,廖明
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3064-3070.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.017
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    【目的】H9亞型禽流感是重要的人獸共患性傳染病,該亞型病毒為H7N9亞型和H10N8亞型流感病毒提供了6個內部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS),并且一直處于動態重組過程中。因此,建立針對H9亞型禽流感的型特異性電化學發光免疫的高通量快速檢測方法,加強H9亞型流感的監測,具有重要意義。【方法】用釕聯吡啶標記H9亞型AIV的單克隆抗體,用MPI-E型電致化學發光分析系統評價釕標單抗標記效率;用生物素標記H9亞型AIV的多克隆抗體,HABA法檢測抗體生物素化的效率;待測抗原與釕標單抗作用1 h后,將此抗原-抗體復合物與通過生物素-鏈霉親和素系統固定在磁微球表面的多克隆抗體反應,最后加入反應底物三丙胺后即可在電化學分析系統進行發光檢測。優化生物素化多抗和釕標單抗最佳工作濃度,確定臨界值和反應譜,對所建立的方法進行敏感性、特異性和重復性試驗。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒組和空白對照組雞只的88份咽拭子和肛拭子,分別用電化學發光免疫檢測方法和雞胚病毒分離法進行檢測和比較。【結果】釕標抗H9亞型AIV單克隆抗體的標記效率為每個單抗IgG分子上結合21個Ru2+,且間接免疫熒光方法證明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亞型AIV多克隆抗體的標記效率為每個IgG分子上結合了6個生物素分子,且Western blotting試驗證明其仍保持生物活性;該方法的檢測臨界值為28.3,可疑區間為23.4—33.2;陰性和陽性變異系數均小于10%;檢測限為5×104EID50,能夠特異性地檢測H9亞型AIV,不與其他亞型流感病毒(H1、H3、H4、H5和H6亞型)和其他類型的禽源病毒(NDV、IBV和IBDV)反應。3 h內即可完成檢測,與雞胚病毒分離法的符合率為86.4%。【結論】所建立的H9亞型AIV型特異性電化學發光免疫檢測方法可以用于臨床樣品檢測,對H9亞型禽流感的監測和防控具有重要意義。
    一株H1N1豬流感病毒的進化分析與分子特征
    徐匯洋,許榜豐,陳艷,隋金鈺,楊煥良,尹航,楊大為,喬傳玲,陳化蘭
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3071-3078.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.018
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    【目的】了解豬流感病毒的分子流行病學,為動物流感的防控提供科學依據。【方法】將豬的鼻拭子接種雞胚進行病毒分離,對血凝試驗陽性的樣品在SPF雞胚上進一步純化、增殖,采用RT-PCR對分離毒株的全基因組進行擴增,使用Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer進行序列測定,利用DNASTAR軟件對測序基因片段進行整個閱讀框的核苷酸序列同源性比對分析,并用 MEGA 6.0繪制遺傳進化樹及分析氨基酸位點。【結果】分離毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)為H1N1亞型病毒,核苷酸的分析結果發現該分離毒株的8個基因片段均與中國近期分離的H1N1亞型流感病毒高度同源,屬于類禽型豬H1N1的進化分支,沒有出現不同基因型流感病毒片段之間的重組。分離株HA蛋白的裂解位點序列為IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5個抗原位點區域與其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未發生改變;HA蛋白受體結合位點中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13與SA-α-2,6-Gal受體有較強的結合能力,而SA-α-2,6-Gal受體普遍存在于哺乳動物宿主(豬和人)上呼吸道中;HA共有6個潛在糖基化位點,其中4個(N27、N40、N212和N291)位于HAl區,2個(N498和N557)位于HA2區;NA有7個潛在糖基化位點,其中4個(N50、N58、N63和N68)在鏈接區,其他3個(N88、N146和N235)在結構域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸組合;M2蛋白發生抗藥位點S31N的突變。【結論】 類禽型H1N1豬流感病毒的持續存在和不斷變異,提示應加強豬流感的監測,為動物流感的防控提供重要的科學依據。
    研究簡報
    大豆轉錄因子基因GmMYB111的克隆及功能分析
    許玲,衛培培,張大勇,徐照龍,何曉蘭,黃益洪,馬鴻翔,邵宏波
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3079-3089.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.019
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    【目的】克隆大豆MYB轉錄因子基因,進行序列分析和表達模式分析,并對其功能進行鑒定。【方法】通過對鹽脅迫相關的數字表達譜(DGEP)數據分析,獲得一個MYB轉錄因子GmMYB111;以鹽脅迫處理的cDNA為模板,利用RT-PCR法分離克隆MYB基因cDNA編碼序列;根據GmMYB111蛋白序列進行同源性搜索,得到與GmMYB111蛋白序列相似度較高的其他物種的蛋白序列;使用 MEGA5.05對GmMYB111蛋白序列及其同源序列進行多序列比對分析并構建同源物種間系統進化樹;利用實時熒光定量PCR方法檢測目的基因在大豆中受非生物脅迫誘導表達情況及組織特異性表達情況;利用擬南芥原生質體轉化體系分析GmMYB111的亞細胞定位情況;通過酵母雜交系統檢測其轉錄激活活性以及體外結合活性。【結果】根據前期江蘇省農業科學院農業生物技術研究所鹽土農業研究室鹽脅迫相關的數字表達譜(DGEP)數據獲得鹽脅迫響應顯著上調(27倍)的GmMYB111,利用RT-PCR方法從栽培大豆根組織中克隆該基因片段,序列比對發現其與已公布的Williams82基因組數據庫序列一致,生物信息學分析表明,其編碼的氨基酸序列具有MYB類轉錄因子的共同特征,其N端具有R2、R3兩個MYB結構域,同時其C-端還存在一個富含酸性氨基酸的轉錄激活區;系統進化樹分析表明,該基因編碼的蛋白與GmMYB76、GmMYB12a以及苜蓿MtMYB61的親緣關系最近; GmMYB111在大豆中的表達受高鹽、干旱、冷害和ABA誘導表達,實時熒光定量PCR檢測結果顯示,在高鹽和冷害脅迫下,GmMYB111呈上調表達,在干旱脅迫誘導后呈先上調后下調的表達模式,在ABA誘導下其表達量呈現波動式上調和下調表達;時空表達分析表明,GmMYB111為組成型表達,在大豆幼苗期和成熟期的表達量相對較強,成熟期的表達量相對較低,從不同組織來看,GmMYB111在莖、葉和花中表達量最高,在根中表達量相對較低,在豆莢中不表達;亞細胞定位結果顯示GmMYB111定位于細胞核中,為典型的轉錄因子;酵母雜交系統檢測表明,GmMYB111具有轉錄激活功能,并且能夠與順式作用元件TAACTG基序相結合。【結論】GmMYB111為典型的R2R3-MYB轉錄因子基因,具有轉錄激活活性及DNA結合活性,在大豆中的表達可能與大豆的非生物脅迫和ABA信號轉導途徑有關,推測其可能通過調節下游基因的表達來調控大豆對非生物脅迫的應答。
    不同品種雞蒸煮加工適宜性評價技術研究
    王春青,李俠,張春暉,李學科,杜桂紅,李海,謝小雷
    中國農業科學. 2015, 48(15):  3090-3100.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.020
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    【目的】選取不同品種雞為研究對象,分析肉雞原料肉以及蒸煮肉樣品質,為篩選雞肉蒸煮加工專用品種提供參考。【方法】分別測定10個不同品種雞原料肉的16項品質指標以及經過蒸煮加工后肉樣的9項品質指標。對所測得的指標進行相關分析,建立原料肉品質與蒸煮肉樣品質的相關性;運用因子分析篩選出蒸煮加工的品質評價指標;運用層次分析,確定品質評價指標的權重;運用“合理-滿意度”的評價方法,確定綜合評價得分;并結合聚類分析,將10個品種肉雞分為不同等級;運用回歸分析,進行綜合評價模型驗證。【結果】不同品種雞胸肉基本品質指標之間呈顯著差異性(P<0.05)。經過煮制,樣品的剪切力、硬度、彈性以及咀嚼性均增加,肌節長度縮短,但品種之間收縮率呈顯著差異,其中柴母雞肌節收縮率為30.41%,顯著高于其他9種雞(P<0.05),而矮腳雞肌節收縮率為4.99%。品種間原料肉及其煮制肉樣品質指標變異較大。其中,原料肉指標中脂肪含量和肌原纖維密度的變異系數較大,分別為60.51%和48.62%,但是在加工產品中肌節收縮率、咀嚼性和剪切力的變異系數較大,分別為48.33%,34.64%和20.51%,因此,10個品種肉雞可以作為代表樣品。相關分析結果表明,原料肉指標脂肪含量、亮度值(L*)、剪切力、蒸煮損失率、硬度、咀嚼性、肌節長度、肌節收縮率及體積收縮率與煮制肉樣的品質指標相關性極顯著(P<0.01),其中原料肉的剪切力與產品剪切力,原料肉的硬度和咀嚼性與產品硬度之間相關系數分別達到0.59、0.62和0.48;因子分析結果表明,前5個因子的特征值均大于0.8,同時9個品質指標中(脂肪含量、L*、剪切力、蒸煮損失率、硬度、咀嚼性、肌節長度、肌節收縮率及體積收縮率)7個指標對前5個因子的貢獻率較大。因此,篩選出原料肉指標脂肪含量、剪切力、硬度、咀嚼性、肌節長度、肌節收縮率及體積收縮率作為品質評價指標,代表原來所有指標的90.09%的信息;層次分析確立品質評價指標的權重,分別為0.0603、0.1045、0.0920、0.2223、0.0416、0.1898及0.2896,同時建立品質評價方程為Y=0.0603×M脂肪含量+0.1045×M剪切力+0.0920×M硬度+0.2223×M咀嚼性+0.0416×M肌節長度+0.1898×M肌節收縮率+0.2896×M體積收縮率;通過聚類分析,將10個品種雞分為3類;回歸分析結果表明,評價模型與感官評價結果相近,其回歸方程為y=1.899x-0.510,相關系數為0.887,綜合評價模型可以較準確的評價雞肉蒸煮加工適宜性。【結論】在10個品種肉雞中,通過原料肉品質指標進行分析,清遠雞、白羽肉雞和童子雞最適宜蒸煮加工,柴母雞不適宜蒸煮。
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