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當期目錄

    2016年 第49卷 第9期 刊出日期:2016-05-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    兩系法雜交稻兩優培九育種的理論與實踐
    呂川根,鄒江石
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1635-1645.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.001
    摘要 ( 742 )   HTML ( 2 )   PDF (2481KB) ( 742 )   收藏
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    兩系法超級雜交稻兩優培九是中國獨創的兩系法雜交稻育種中形成的品種,是中國超級稻育種計劃完成第一步目標的標志性品種,是繼三系雜交稻汕優63之后種植面積最大的雜交稻,在國內外具有重大影響。兩優培九的育種實踐經歷了艱苦曲折的科研攻關和推廣過程。最初是嘗試通過化學殺雄制種的方法利用典型秈粳雜種的優勢,在亞優2號的育種實踐失敗后,技術路線調整為通過光溫敏兩系法將部分亞種間雜種優勢與江淮生態區的水稻理想株型相結合,克服雜交稻結實率不高、不穩等弱點,達到高產、優質、多抗、適應性廣泛并能安全制種的目標。通過分析多個水稻光溫敏不育系與不同生態型父本配組的雜種F1的性狀表現,確定以帶有1/4爪哇稻親緣的培矮64S為重點母本,選擇優勢生態群中的合適類型父本重點配組,避開生育期超長和植株偏高等障礙性問題,并根據江淮流域一季稻區的常年氣候特點進行生態育種。通過大量篩選,育成兩優培九,達到遺傳、形態和功能“三優”的統一,將優質、超高產、多抗性狀聚集于一體。通過對培矮64S育性轉換、開花授粉有危害的高溫、低溫指標的研究和對各生態區常年氣候中出現這些溫度頻率的分析,提出適宜制種區域和相應的父母本安全抽穗期。研究培矮64S育性轉換的植株溫度指標,提出遭遇低溫危害時“以水調溫”的制種純度保障技術。通過對兩優培九的生物學特性和適宜生長條件的研究,提出適宜種植區、各種植區的適宜齊穗期和主要種植方式的播栽期等生產指導性指標,分析生產上可能發生的問題并提出相應的預防措施和解決對策,研發提高結實率及其穩定性的栽培技術。通過配套生產技術的系統研究和應用,兩優培九在南方稻區多年大面積成功種植。通過全程回顧育種戰略的形成、研究思路和技術路線、品種培育和核心配套技術的研發及示范推廣過程,論述了兩優培九育成和大面積應用的意義;補充了水稻理想株型中的莖稈分布性狀,提出“漁叉型”莖稈分布的概念;認為可以利用秈粳米質性狀的互補選擇各種適口性的稻米;大面積成功推廣一個品種,尤其要加強應用技術研究,前瞻性地研究品種的最適生長條件,然后根據各地的氣候條件規劃最適種植區,并制定相應的最優栽培措施,還要儲備可能發生問題的預防措施和解決對策。
    大豆百粒重QTL定位及多樣性評價
    陳 強,閆 龍,馮 燕,鄧瑩瑩,侯文煥,劉 青,劉兵強,楊春燕,張孟臣
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1646-1656.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.002
    摘要 ( 433 )   HTML ( 1 )   PDF (856KB) ( 709 )   收藏
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    【目的】百粒重是大豆重要的育種目標性狀,它不僅是產量構成因子之一,也是重要的品質性狀,不同用途對百粒重有著不同要求。通過連鎖分析定位大豆百粒重QTL,獲得連鎖標記,闡明QTL連鎖標記在種質資源中的多樣性特征,為百粒重定向改良提供依據。【方法】以冀豆12×黑豆(ZDD03651)雜交衍生的188個重組自交系的F6:8和F6:9群體為材料,采用WinQTL Cartographer V. 2.5的復合區間作圖法(CIM),經300次Permutation 計算,以P=0.05顯著性水平確定QTL存在的閾值,定位百粒重QTL。連續3年在石家莊對來自國內外的205份大豆育成和地方品種的百粒重進行表型鑒定,利用定位到的百粒重QTL連鎖SSR標記對種質資源材料進行基因型分型,在每個標記處確定發生頻率大于5%(對應資源材料個數大于10個)的等位變異為有效等位變異,計算等位基因多樣性指數,明確百粒重QTL在種質資源里的多樣性特征,通過多重比較確定不同等位變異與百粒重的關系。【結果】在冀豆12×黑豆后代群體中,百粒重呈正態連續分布,遺傳力為88.72%。共檢測到5個百粒重QTL,分別位于Chr.02(D1b)、Chr.06(C2)、Chr.08(A2)和Chr.17(D2)染色體,遺傳貢獻率(R2)7.68%—12.83%,加性效應-0.65—-0.84 g,增效基因均來自冀豆12。年份間穩定的QTL有2個,其中,qSW-6-1位于第6染色體Satt457—Sat_062,緊密連鎖的標記為Satt281,貢獻率最大值為12.02%,加性效應最大值為-0.81g;qSW-17-1位于第17染色體Satt301—Satt310,貢獻率最大值為12.83%,加性效應最大值為-0.84g。在205份資源材料中,百粒重遺傳力為96.88%。百粒重連鎖SSR標記有效等位變異數為2—8個,多樣性指數為0.34—0.82。發掘出大粒相關等位變異6個,分別為Satt281-227 bp、Barcsoyssr_2_304-245 bp、Satt301-199 bp、Sat_406-214 bp、Satt119-136 bp和Satt341-218 bp。其中Satt281-227 bp在RIL和資源材料中均為百粒重增效效應,主要分布在國內大粒育成品種中。篩選到含有4個及以上大粒相關等位變異的資源材料3份,分別為綠75、中品大黑豆和中野2號。【結論】在大豆育成品種冀豆12×地方品種黑豆的雜交后代群體中,檢測到5個百粒重QTL,冀豆12含有1個在RIL和種質資源中均為大粒相關的優異等位變異。明確了上述5個QTL在205份育成品種和地方品種間的多樣性分布特征,可應用于百粒重定向改良過程中的親本選配及后代選擇。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    地表覆蓋對旱地小麥氮磷鉀需求及生理效率的影響
    何剛,王朝輝,李富翠,戴健,李強,薛澄,曹寒冰,王森,劉慧,羅來超,黃明
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1657-1671.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.003
    摘要 ( 430 )   HTML ( 1 )   PDF (401KB) ( 500 )   收藏
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    【目的】研究地表覆蓋對黃土高原旱地冬小麥氮磷鉀需求和生理效率的影響,為促進黃土高原旱地冬小麥高效優質生產提供可靠的理論依據和實踐經驗。【方法】通過田間試驗,以裸地休閑為對照,研究地膜覆蓋、秸稈覆蓋、種植綠肥和秸稈覆蓋+種植綠肥對冬小麥籽粒產量、籽粒養分含量、籽粒產量形成和籽粒養分含量形成的氮磷鉀需求及生理效率的影響。【結果】地膜覆蓋降低了籽粒產量形成的需氮量,提高了籽粒產量形成的氮生理效率,從而使冬小麥籽粒產量顯著增加6%;秸稈覆蓋降低了地上部吸氮量,使籽粒產量減少7%;種植綠肥和秸稈覆蓋+種植綠肥提高了籽粒產量形成的氮磷鉀養分需求量、降低了籽粒產量形成的養分生理效率,從而使籽粒產量均減少5%。地膜覆蓋提高了籽粒氮含量形成的需氮量,降低了氮生理效率,從而使籽粒含氮量降低8%,地膜覆蓋增加了地上部吸鉀量,使籽粒含鉀量增加4%;秸稈覆蓋的籽粒含氮量降低4%,但它的籽粒磷和鉀含量分別提高6%和4%,這與降低籽粒磷鉀含量形成的養分需求量、提高磷鉀生理效率有關;種植綠肥提高了籽粒氮含量形成的氮生理效率,從而使籽粒氮含量增加8%;秸稈覆蓋+種植綠肥對籽粒氮和磷含量無顯著影響,但籽粒含鉀量增加4%,歸因于提高了籽粒鉀含量形成的鉀生理效率。【結論】地膜覆蓋降低籽粒產量形成的需氮量,提高籽粒產量形成的氮生理效率,從而提高籽粒產量;但增加了籽粒氮含量形成的需氮量、降低了籽粒氮形成的氮生理效率,不利于籽粒含氮量提高。秸稈覆蓋不利于作物養分吸收,從而影響籽粒產量和養分含量形成。種植綠肥和秸稈覆蓋+種植綠肥提高了籽粒氮磷鉀養分需求量、降低它們的生理效率,從而降低籽粒產量。種植綠肥可提高籽粒氮含量形成的氮生理效率,從而提高籽粒氮含量。因此,旱地小麥生產中為保證籽粒產量和營養品質,需增加地膜覆蓋和秸稈覆蓋的氮肥用量;夏閑期種植綠肥是旱地土壤培肥的重要措施,但需注意其可能帶來的減產風險,應結合區域降水情況因地制宜。
    噴施化學打頂劑對棉花冠層結構及群體光合生產的影響
    楊成勛,張旺鋒,徐守振,隨龍龍,梁福斌,董恒義
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1672-1684.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.004
    摘要 ( 349 )   HTML ( 1 )   PDF (982KB) ( 468 )   收藏
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    【目的】選用氟節胺復配型、縮節胺復配型2種化學打頂劑,研究田間噴施化學打頂劑對棉花株型特征、冠層結構、群體光合生產及產量的影響,分析冠層結構變化對群體光合生產和產量的影響,為棉花化學打頂技術的應用提供理論依據。【方法】選用北疆棉區主栽品種(新陸早45號)和主推品種(系)(中棉所50、45-21)為試驗材料,在田間自然條件下,以常規人工打頂的棉花為對照,分別測定不同棉花品種(系)株高、株寬、葉面積指數、葉片葉綠素含量、冠層不同部位透光率、群體光合速率及產量構成等指標。研究化學打頂技術對棉花葉面積指數、冠層透光率、群體光合速率及產量的影響。【結果】與人工打頂的棉花相比,化學打頂的棉花株高顯著高于人工打頂處理,且噴藥后生長量較大;株寬顯著小于人工打頂處理,噴藥后橫向生長被明顯抑制。化學打頂的棉花葉面積指數和葉片葉綠素含量較高,且高值持續期長,至初絮期(出苗后115 d)仍維持較高的值,與人工打頂的棉花相比差異均達到極顯著水平;冠層上、中部透光率較高,生育后期冠層下部漏光損失較小。化學打頂的棉花群體光合速率顯著高于人工打頂,且高值持續期長,至初絮期仍維持在16.04 μmol·m-2·s-1以上,較人工打頂的棉花高出14.35%—36.35%,差異均達到顯著水平;群體呼吸速率在達到峰值前顯著高于人工打頂的棉花,峰值后與人工打頂的棉花無顯著差異;群體呼吸速率占群體總光合速率的比率高于人工打頂的棉花。化學打頂的棉花單株結鈴多,其中氟節胺處理棉花產量高于人工打頂。【結論】棉花化學打頂技術具有塑造株型、調節棉花冠層結構形成的重要作用;同時棉花冠層上、中部透光率大,改善了冠層中下部光環境,保證了冠層各部位均勻的光分布。化學打頂的棉花葉面積指數高且高值持續期長,增加了光合面積。葉片葉綠素含量高且高值持續時間長,延長了光合時間,保證了較高的群體光合能力及長的光合功能持續期。
    植物保護
    稻曲病菌T-DNA插入突變菌株B1241側翼基因克隆
    薄惠文,俞咪娜,于俊杰,尹小樂,丁慧,王亞會,劉永鋒
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1685-1695.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.005
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (4447KB) ( 416 )   收藏
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    【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力減弱的T-DNA插入突變菌株B1241的生物學性狀和致病力,并結合分子生物學手段研究其T-DNA插入位點的側翼基因,以解析突變基因在稻曲病菌生長和致病過程中的作用,從而為闡明稻曲病菌致病機制提供理論基礎。【方法】以野生菌株P1作為對照,觀察并檢測突變菌株B1241的菌落形態、生長速率、孢子形態、產孢量等生物學性狀;采用注射接種的方法將菌絲和孢子的混合液接種于水稻穗苞中,統計每穗發病的病粒數,分析B1241的致病性變化;突變菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上轉接5代之后,PCR檢測T-DNA插入的穩定性并通過Southern雜交分析B1241中T-DNA插入的拷貝數;利用HiTail-PCR獲得T-DNA插入位點的側翼序列,經NCBI比對得到側翼基因;運用RACE-PCR克隆插入位點側翼基因全長;qRT-PCR分析側翼基因的表達情況。【結果】經生物學特性觀察及田間接種發現,與野生菌株P1相比,突變菌株B1241在固體培養基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形態以及生長速率無顯著差異,其致病力、產孢能力均呈極顯著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上轉接5代之后,仍能擴增到GFP和HPH基因,說明T-DNA已經穩定地插入到其基因組中。Southern雜交結果顯示T-DNA在該突變菌株中以單拷貝的形式插入。經擴增并比對側翼序列,T-DNA的插入位點處少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因組中都沒有比對到。NCBI比對發現,側翼基因Uvt-1241與UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,開放閱讀框長2 317 bp,包含81和106 bp的2個內含子,編碼709個氨基酸。經RACE-PCR獲得基因全長2 650 bp,5'非編碼區長度為14 bp,3'非編碼區長度為319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的啟動子區域,位于起始密碼子之前516 bp處。qRT-PCR分析結果表明,Uvt-1241在該突變體中表達量下降。該基因編碼一個糖基水解酶18家族的蛋白,同時含有一個保守結構域D××D×D×E。【結論】稻曲病菌突變菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的啟動子區域,從而導致該啟動子功能部分缺失,基因表達量下降,使得突變菌株的生長、產孢等生物學特性及致病力發生改變,由此推測該基因可能在稻曲病菌生長及致病過程中起著重要的作用。
    二斑葉螨多重抗性品系解毒酶基因表達模式解析
    周興隆,宋麗雯,楊順義,李靜靜,王進軍,張新虎,沈慧敏
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1696-1704.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.006
    摘要 ( 222 )   HTML ( 1 )   PDF (478KB) ( 571 )   收藏
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    【目的】二斑葉螨(Tetranychus urticae)是一種重要的農業害螨,由于個體小、繁殖快等特點,極易產生抗藥性,論文從生理生化和分子水平探討二斑葉螨mRNA水平相對表達量的變化,旨在明確二斑葉螨對混劑的多重抗性機制,為該螨的綜合治理提供依據。【方法】在溫度(25±l)℃,相對濕度60%±5%,光周期L﹕D=16 h﹕8 h的室內條件下,于盆栽豇豆苗上飼養不接觸任何藥劑的二斑葉螨敏感品系(SS)和用螺螨酯、甲氰菊酯、阿維菌素以其單劑的致死中濃度(LC50)為汰選濃度混合連續汰選的多重抗性品系(Mp-R);Mp-R品系用藥4—5次待其種群擴增后,參照FAO推薦的葉片殘毒法進行室內毒力測定一次,計算其LC50,求出抗性倍數(RR),并記為一個汰選周期;連續汰選3個周期后,逐漸增加汰選濃度,用PoloPlus軟件求其毒力回歸方程、LC50、抗性指數及卡方值;采用生化分析法測定選育50代的二斑葉螨SS與Mp-R品系卵、幼螨、若螨、雄成螨、雌成螨的谷胱甘肽S轉移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)、多功能氧化酶(MFOs)的活性,以ELFn為內參基因,采用RT-qPCR技術以比較Ct值的方法計算二斑葉螨Mp-R品系中10個與抗性相關的解毒酶基因的表達量。【結果】在室內經50代抗性選育,二斑葉螨對阿維菌素、甲氰菊酯及螺螨酯的LC50分別達到1 103.55、5 993.33和2 345.62 mg·L-1,抗性倍數分別為603.03、167.65和51.77倍。卵中Mp-R品系MFOs比活力顯著高于SS品系,GSTs、CarEs比活力差異不顯著;其他發育階段Mp-R品系的GSTs、CarEs比活力顯著高于SS品系,MFOs比活力則差異不顯著;Mp-R品系雌成螨的GSTs、CarEs比活力顯著高于其他發育階段,卵的MFOs比活力顯著高于其他發育階段。與敏感品系相比,二斑葉螨TuGSTd05、TuGSTd06與TuGSTd09基因表達量在Mp-R品系各發育階段顯著上調1.80倍以上,TuGSTd01表達量在若螨期顯著上調1.63倍,其他發育階段差異不顯著;CYP392E10表達量在卵中極顯著上調5.87倍,幼螨、若螨階段顯著上調2.15倍和2.09倍,成螨階段表達量差異不顯著;CYP392A6在卵、幼螨與若螨階段表達量均顯著上調1.89、1.64和1.59倍,在成螨階段表達量差異不顯著。CYP392A16在各發育階段均極顯著上調,卵中上調6.97倍,幼螨中上調8.20倍,若螨中上調8.88倍,雄成螨上調7.34倍,雌成螨上調8.59倍。CYP392D 8在卵、幼螨和雄、雌成螨中表達量均顯著上調2.18、2.00、2.03和2.41倍,在若螨階段表達量差異不顯著;TuCCE35在若螨及雄、雌成螨中表達量顯著上調1.58、1.86和2.65倍;TuCCE36在卵和雄、雌成螨中表達量顯著上調1.73、1.89和2.14倍。【結論】與敏感品系相比,二斑葉螨Mp-R品系10個與抗性相關的解毒酶基因表達量在其不同發育階段均有不同程度的變化。CYP392A16表達量在各發育階段上調較大,可能參與了二斑葉螨多重抗性的形成;其余基因表達量均未見大幅度上調,這些基因是否參與了對3種藥劑的代謝還需進一步驗證。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    長期施肥處理下不同類型水稻土有機碳礦化的動態差異
    吳 萌,李忠佩,馮有智,陳瑞蕊,江春玉,劉 明
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1705-1714.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.007
    摘要 ( 342 )   HTML ( 1 )   PDF (720KB) ( 512 )   收藏
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    【目的】研究田間長期定位施肥處理下不同類型水稻土有機碳礦化的動態差異及其影響因素,為揭示不同類型水稻土有機碳的循環特征及制定合理的養分管理措施等提供依據。【方法】以江蘇常熟(烏柵土)、江西余江(低肥力紅壤)、湖南望城(高肥力紅壤)和重慶(紫色土)4個地點長期定位施肥試驗的水稻土為研究對象,選擇不施肥(CK)、單施化肥(NPK)和化肥配合秸稈還田(NPKS)3個處理,通過室內27 d的有機碳礦化培養試驗,采用室內恒溫培養、堿液吸收法測定土壤有機碳的礦化量;選擇Jones一級動力學方程擬合土壤有機碳累積礦化量的動態變化,比較土壤類型和長期不同施肥處理對有機碳礦化動態的影響。【結果】長期施肥處理可以提高土壤全量養分(全氮、全磷、全鉀)和有機碳含量,但會降低土壤pH。長期施肥可以顯著提高土壤有機碳累積礦化量(C)(常熟試驗點除外),不同施肥處理下增加幅度為11.7%—86.1%,而對于礦化動力學方程擬合所得土壤潛在可礦化有機碳量(C0)、易礦化有機碳量(C1),只有同為紅壤的余江和望城兩地的施肥處理可以顯著提高。相同施肥處理下C、C0和C1均表現為常熟、望城試驗點的較大,重慶、余江試驗點的較小,而潛在可礦化有機碳量與土壤有機碳的比值(C0/SOC)則是余江試驗點較大;相關性分析發現有機碳、總氮、堿解氮、全磷與C、C0和C1呈極顯著正相關(P<0.01),pH和全鉀與C呈極顯著負相關,而C0/SOC與有機碳、pH和各養分指標均呈顯著或極顯著負相關。對于礦化速率常數(k),施肥處理對其影響并不顯著,但不同土壤類型可以顯著影響k。相關性分析表明k與pH、C/N和全鉀呈極顯著負相關(P<0.01),與速效鉀呈顯著負相關(P<0.05)。通過聚合推進樹(ABT)方法分析了不同因子的相對影響,結果表明堿解氮和有機碳含量對C和C0影響較大,相對貢獻率分別為23.8%、20.2%(對于C)和29.5%、23.7%(對于C0);有機碳含量和pH對C1和C0/SOC影響最大,相對貢獻率分別為26.7%、15.9%(對于C1)和34.4%、23.0%(對于C0/SOC);pH和全鉀對k的影響最大,相對貢獻率分別為34.2%和22.1%。【結論】土壤類型對有機碳礦化動態的影響要大于長期施肥措施產生的影響,不同地點長期定位施肥處理下土壤母質、pH、有機碳含量和養分含量等土壤性質的不同,造成了土壤有機碳礦化的動態差異。
    中國不同麥區小麥籽粒硒的含量及調控
    劉慧,楊月娥,王朝輝,李富翠,李可懿,楊寧,王森,王慧,何剛,戴健
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1715-1728.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.008
    摘要 ( 360 )   HTML ( 1 )   PDF (1567KB) ( 422 )   收藏
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    【目的】通過取樣調查和田間葉噴硒肥試驗,研究中國不同麥區小麥籽粒硒含量狀況、硒含量的影響因素以及提高硒含量的農藝措施。【方法】分別于2008—2009、2009—2010、2010—2011年小麥季收集中國不同麥區73份春小麥和582份冬小麥共計655份田間小麥樣品,調查籽粒產量并測定籽粒硒含量。于2010—2011年在14個省(市)的30個國家小麥產業技術體系綜合試驗站開展葉面噴施硒肥試驗,設葉面噴施清水或0.017%亞硒酸鈉2個處理,于拔節中、末期各噴施1次,完全隨機區組設計,重復3次,測定拔節前植株樣品的硒含量和收獲后籽粒產量和硒含量。【結果】655份小麥籽粒樣品平均硒含量為64.6 µg·kg-1,遠不能滿足以小麥為主食人群對硒的營養需求,變幅為0—821.0 µg·kg-1,春、冬小麥平均分別為67.5和64.2 µg·kg-1。有63%缺硒,19%偏低,僅有8%富硒,未發現有小麥籽粒硒含量達到中毒水平。小麥籽粒硒含量在不同區域表現為北部高于南部、西部高于東部。各地的田間試驗表明,葉面噴施亞硒酸鈉對小麥籽粒產量沒有顯著影響,不噴硒和噴硒平均產量分別為6 650和6 649 kg·hm-2。葉噴硒肥使籽粒硒含量顯著提高,不噴硒時,籽粒硒含量平均為31.0 µg·kg-1,噴硒116 g·hm-2使籽粒硒含量平均增加到647.8 µg·kg-1,達到了富硒水平,但沒有達到中毒水平。每施用1.0 g Se·hm-2,籽粒硒含量平均提高5.3 µg·kg-1,施用51 g Se·hm-2可將小麥籽粒硒含量從平均31.0 µg·kg-1提高到300 µg·kg-1以上。小麥籽粒硒含量不受產量的影響,但不噴硒時籽粒硒含量與0—20 cm土層土壤有效硒含量和拔節前植株硒含量分別呈顯著和極顯著正相關。土壤有效硒含量在6.3—30.7 µg·kg-1每增加1.0 µg·kg-1,不噴硒時籽粒硒含量平均增加2.1 µg·kg-1,拔節前植株硒含量在0—147.2 µg·kg-1每增加1.0 µg·kg-1,不噴硒籽粒硒含量平均增加0.7 µg·kg-1。噴硒后籽粒硒含量和硒強化指數均與拔節前植株硒含量極顯著正相關。拔節前植株硒含量每增加1.0 µg·kg-1,噴硒籽粒硒含量平均增加5.7 µg·kg-1,籽粒硒強化指數平均增加0.043 μg·kg-1(g·hm-2-1。【結論】在農業生產中,通過拔節前土壤施硒提高土壤有效硒水平、在拔節中期或末期葉面噴施硒肥等,均可使植株累積較多的硒,并在灌漿期向籽粒轉移,從而提高籽粒硒含量。
    中國主要旱地農田N2O背景排放量及排放系數特點
    徐玉秀,郭李萍,謝立勇,云安萍,李迎春,張 璇,趙 迅, 刁田田
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1729-1743.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.009
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    【目的】收集中國已發表的旱地農田N2O排放田間監測文獻并建立數據庫,以此為基礎解析中國主要旱地農田(小麥地、玉米地、蔬菜地)的N2O背景排放值(不施肥情況下土壤的N2O排放量)和排放系數(EF)及影響因子,為估算區域溫室氣體清單和提出相應的減排策略提供數據支持。【方法】利用亞組歸類和回歸分析等方法對主要類型旱地農田N2O背景排放量的影響因子(如土壤全氮含量和土壤碳氮比)及影響EF的因子(如氮肥用量及肥料類型——硝化抑制劑和緩控釋肥)進行分析。【結果】(1)中國旱地農田N2O背景排放量為0.70—3.14 kg N2O-N·hm-2;小麥地和夏玉米地的N2O背景排放量和蔬菜地的N2O日背景排放量均隨土壤全氮含量增加而增加,并隨土壤碳氮比的增加而降低,灌溉促進小麥地N2O背景排放量增加;(2)EF隨著無機氮肥用量的增加而增加,不同作物種植類型農田的EF大小依次為蔬菜地(0.61%—1.13%)>夏玉米地(0.50%—0.68%)>春玉米地(0.35%—0.40%)>小麥地(0.22%—0.36%);夏玉米地的EF是小麥地的2倍左右;(3)使用不同種類硝化抑制劑后氮肥的EF均有不同程度的降低,EF降低了34%—60%,EF降低程度依次為:DCD+HQ(58.9%)>NBPT+DCD(52.9%)>DMPP(51.1%)>NBPT(44.1%)>吡啶(39.5%)>DCD(38.9%);硝化抑制劑降低EF的效果在不同旱地農田的表現為:小麥地(60.0%)>蔬菜地(50.6%)>春玉米地(39.6%)>夏玉米地(34.7%);(4)與常規尿素相比,不同類型緩控釋肥使得EF降低了15.9%—78.9%,降低次序依次為:長效碳酸氫銨(78.9%)>聚合物包膜尿素(59.8%)>脲甲醛(53.4%)>樹脂包膜尿素(44.9%)>硫磺包膜尿素(30.6%)>鈣鎂磷肥包膜尿素(15.9%);緩控釋肥降低EF的效果在不同農田表現為:蔬菜地(78.4%)>春玉米地(58.2%)>小麥地(49.2%)>夏玉米地,控釋肥在降低夏玉米地EF的作用較小。【結論】旱地農田N2O排放主要受土壤養分狀況(全氮含量和碳氮比)和管理措施(灌溉和施肥)及其他因素的共同影響,應依據不同氣候生態區的氣候和土壤特點以及作物類型并考慮氮肥用量和類型采取針對性的減排措施,以有效降低農田N2O排放。
    貯藏·保鮮·加工
    薯類加工與營養專題導讀:中國薯類加工現狀與展望
    木泰華,陳井旺
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1744-1745.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.010
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        薯類作物營養豐富,富含淀粉、膳食纖維、維生素及礦物元素等成分,在改善居民膳食營養結構,提高全民健康素質,保障國家糧食安全等做出了重要貢獻,而薯類加工業的發展在促進中國農業的持續增效、農民的持續增收、現代農業的可持續發展中具有不可替代的作用。2014年,中國薯類種植面積約為1 100萬hm2,總產量達1.64億t。目前,中國薯類(甘薯、馬鈴薯)的種植面積和產量均居世界首位。但其加工比例相對較低,加工產業發展水平與國外發達國家相比還存在一定的差距。以馬鈴薯為例,歐美等發達國家加工技術比較先進,馬鈴薯的加工比例高達80%,其相關食品隨處可見,主要有馬鈴薯條、馬鈴薯泥、脫水馬鈴薯片(泥、條)、馬鈴薯全粉等,各種馬鈴薯食品的生產工藝及配套設備也十分成熟。中國馬鈴薯加工的主要產品有淀粉、變性淀粉、全粉、速凍薯條、各類薯片及粉絲、粉條、粉皮等產品。據統計,2014年,中國馬鈴薯加工業消耗馬鈴薯約1 000萬t(約占馬鈴薯總產量的10%),其中馬鈴薯淀粉43.4萬t、冷凍薯條28.3萬t、薯片45萬t、全粉25萬t、變性淀粉25萬t、粉絲粉條等28萬t,以及馬鈴薯方便菜肴食品、馬鈴薯泥等方便食品10萬t,說明中國馬鈴薯產品已逐漸呈現多元化發展的趨勢,但加工比例整體仍偏低。
        相比歐美等發達國家,中國薯類淀粉行業普遍存在能耗高、淀粉提取率低、副產物綜合利用水平低、資源浪費及環境污染嚴重等問題。以甘薯淀粉加工能耗為例,中國甘薯淀粉加工設備大多是在仿造國外馬鈴薯淀粉加工設備基礎上制造的,平均淀粉提取率低于85%。中國每年因生產馬鈴薯和甘薯淀粉而排放的廢液約1 650萬t,薯渣約550萬t,薯皮約110萬t,肆意丟棄后造成環境污染;而薯漿中的蛋白、多酚和β-淀粉酶等成分及薯渣中的膳食纖維和果膠等有益副產物未得到有效利用。在薯類全粉加工、生物乙醇發酵以及薯類功效成分等研究方面與世界先進水平也存在較大差距。中國目前加工和銷售的薯類產品主要以淀粉和薯條等休閑食品為主,并未將薯類中豐富的營養成分充分利用,對薯類中的功效成分缺乏深入挖掘,缺少適合中國大眾普遍消費的饅頭、面條等傳統主食類的加工產品。因此,在設備的研發和改進上,需重視和借鑒發達國家薯類淀粉及薯類全粉等產品的研發經驗,對現有技術和設備進行升級改造,提高中國甘薯淀粉及薯類全粉加工技術和裝備的水平。重點針對薯類加工廢棄物(薯漿、薯渣、薯皮)以及薯類莖葉的資源化利用展開研究,開拓其在食品、工業領域的應用途徑,延長產業鏈、提高附加值。強化薯類功效成分及新型薯類加工制品的研發。如紫心甘薯和馬鈴薯中花青素含量較高,其具有較強的抗氧化、抗炎作用,但不同加工處理方式(蒸、煮、烤、炸、微波、超聲波等)、環境條件(pH、溫度)及提取方法都會影響花青素的提取率、結構組成及功能特性,因此有待在提取技術上加強研發。橙色甘薯中的胡蘿卜素含量較高,可用于生產甘薯面包和饅頭作為缺乏VA人群的重要膳食補充。此外,以甘薯、馬鈴薯為原料直接生產乙醇及其他發酵飲料,也將成為開發新型生物能源及新型薯類加工制品的重要研究方向。 
        2015年,中國啟動“馬鈴薯主糧化關鍵技術體系研究與示范”公益性行業(農業)科研專項項目,中央財政安排1億元專項資金用于馬鈴薯主食產品開發;2016年,中央又將“積極推進馬鈴薯主食開發”列入中央1號文件,為薯類加工產業的發展提供了良好的平臺。目前,中國科研人員在薯類品種選育、原料生產、產品加工、營養評價等方面已取得一批科研成果。研發含薯類成分的饅頭、面條、米粉等具有中國特色的主食產品并實現產業化生產和規模化消費,可以豐富中國居民的營養膳食,有力促進中國薯類產品的消費,大幅提高薯類主食產品消費的比重,推動馬鈴薯和甘薯從雜糧副食轉變為與三大主糧協調發展的第四大主糧。
        本專題將從薯類蛋白提取、薯渣發酵技術、甘薯營養成分鑒定等方面展開評述,旨在為薯類產品加工、新型生物能源開發等提供參考。
    馬鈴薯塊莖特異蛋白Patatin的研究進展
    張篤芹,木泰華,孫紅男
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1746-1756.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.011
    摘要 ( 282 )   HTML ( 5 )   PDF (446KB) ( 487 )   收藏
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    馬鈴薯是僅次于小麥、水稻和玉米的第四種主要作物,中國是世界馬鈴薯產量最大的國家。目前,隨著馬鈴薯加工業的發展,對馬鈴薯的研究也在不斷深入。馬鈴薯塊莖特異蛋白Patatin是馬鈴薯塊莖的貯藏蛋白,是馬鈴薯蛋白的主要組成部分。除具有酯酰基水解活性(lipid acyl hydrolase,LAH)和抗氧化活性外,Patatin還具有較好的溶解度、乳化性、起泡性及凝膠性等物化與功能特性,是目前備受關注的植物蛋白之一。文中通過介紹Patatin的分子量、結構特性、物化與功能特性,歸納和比較Patatin的分離、提取及純化方法以及各自的優缺點,旨在為Patatin在食品領域的進一步研究和開發應用提供理論參考。Patatin在馬鈴薯蛋白中含量約為5.4%—38.0%,與馬鈴薯品種及代謝生理等有關,Patatin分子量在39—45 kDa,大小與糖基化程度有關;Patatin是一種結構緊湊的球蛋白,一級結構由360多個氨基酸組成,一級結構不受外界環境因素的影響,而高級結構易受溫度、pH等的影響。Patatin具有較好的溶解度、凝膠性、乳化性、起泡性及抗氧化活性等,且這些物化與功能特性均受外界環境因素的影響。凝膠色譜法和離子交換色譜法是進一步分離和純化Patatin最常用的方法,反向色譜、免疫親和層析及基因表達法等可獲得純度較高的Patatin,但無法進行大規模生產,膨化床法可用于大量制備純度不高的Patatin。目前國內外關于Patatin在食品領域中應用的研究十分缺乏。Patatin是一種可應用于食品領域的極具潛力的食品配料,未來對于馬鈴薯塊莖特異蛋白Patatin的研究應繼續朝著簡化提取方法,降低提取成本,開發具有高功能價值的食品、保健產品及藥品的方向發展。
    酶法降黏工藝在鮮甘薯直接發酵制備乙醇中的應用
    岳瑞雪,鈕福祥,孫 健,徐 飛,王洪云,朱 紅,張 毅
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1757-1766.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.012
    摘要 ( 201 )   HTML ( 1 )   PDF (404KB) ( 260 )   收藏
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    【目的】建立鮮甘薯料液的酶法降黏工藝,并實現鮮甘薯料液不加水直接發酵制備乙醇。【方法】從中國甘薯主產區選擇12個種植范圍較廣的淀粉型甘薯品種作試驗材料。分析甘薯主要成分(干物質、淀粉、蛋白質、可溶性糖、果膠、半纖維素、纖維素和木質素)與鮮甘薯料液黏度的相關性并選擇對應的降黏酶。研究料水比(1﹕0、2﹕1、3﹕2、5﹕4和1﹕1)、酶處理時間(1、2、3、4和5 h)、酶添加量(纖維素酶:1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 GCU·g-1;果膠酶:1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 U·g-1)和酶處理溫度(30℃、40℃、50℃、60℃和70℃)對酶法降黏效果的影響。通過正交試驗確定最佳酶處理條件,并分析其在不同品種鮮甘薯直接發酵制備乙醇中的效果。【結果】對于12個供試淀粉型甘薯品種,在所有組分中,除了半纖維素(r=-0.239)和木質素(r=-0.069)外,其他組分均與黏度呈正相關(干物率,r=0.356;淀粉,r=0.211,可溶性糖,r=0.307;蛋白質,r=0.266;果膠,r=0.526;纖維素,r=0.600)。其中,果膠(P<0.01)和纖維素(P<0.05)與料液黏度分別呈極顯著和顯著正相關性。根據極差分析發現,對酶處理效果影響由大到小的酶處理條件分別為酶用量、料水比、酶處理時間和酶處理溫度。基于正交試驗結果并考慮到工業應用的實際情況,確定最佳酶處理條件為:料水比1﹕0、纖維素酶1.5 GCU·g-1、果膠酶1.5 U·g-1、溫度50℃、作用3 h。經過酶處理后,鮮甘薯料液黏度明顯下降。除皖蘇178號(4 930 cp)外,其余品種的料液黏度在經過酶處理后均低于3 000 cp,降黏幅度95.07%—99.31%。乙醇發酵結束后,11個甘薯品種的乙醇含量均高于12%(v/v),其中有9個品種的發酵效率達到90%以上。【結論】果膠和纖維素是造成甘薯料液黏度高的主要成分。在液化前通過添加纖維素酶和果膠酶可以有效降低鮮甘薯料液黏度,并實現鮮甘薯料液不加水直接發酵制備乙醇。
    鼠李糖乳桿菌利用甘薯廢渣發酵產乳酸的研究
    劉玉婷,吳明陽,靳艷玲,沈維亮,方揚,趙海
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1767-1777.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.013
    摘要 ( 296 )   HTML ( 1 )   PDF (566KB) ( 457 )   收藏
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    【目的】研究鼠李糖乳桿菌發酵甘薯淀粉加工廢渣生產乳酸的工藝條件,為薯渣的治理和利用提供新的技術思路。【方法】使用元素分析儀對甘薯淀粉廢渣中的主要元素進行分析測定,同時,在以菌體OD值法確定的鼠李糖乳桿菌的生長對數期內分別取不同時間點設置4組乳酸發酵試驗,以該菌利用葡萄糖液體培養基產乳酸的發酵效率為考察指標確定該菌的乳酸發酵最適種齡。在此基礎上,利用鼠李糖乳桿菌對甘薯廢渣直接進行固體發酵:采用單因素試驗方法分別考察接種量、發酵溫度、碳酸鈣添加量,以及外加氮源對乳酸發酵效率的影響;此外,考察外加氮源對發酵結束后薯渣固體發酵醪中的生物量的影響;結合正交試驗設計,得到影響薯渣發酵產乳酸因素的最優組合。【結果】元素分析結果顯示甘薯淀粉廢渣是一種高C、H含量的生物質,其干渣中C、H元素質量百分含量分別達40.34%、6.16%,而N元素質量百分含量僅為0.32%,雖C元素含量豐富,但N元素相對匱乏,需要外加氮源方可進一步促進其生長代謝。通過菌體OD值法確定的鼠李糖乳桿菌的生長曲線顯示,菌體接入2 h后OD值迅速增長,菌體生長進入對數期。8 h后OD值基本不變,菌體進入穩定期。確定了種子的對數生長期在2—8 h。在該時間區間內以4 h齡種子的乳酸發酵效率最高,達92.39%,對應殘糖濃度最低,為0.59 g·L-1,確定4 h是鼠李糖乳桿菌乳酸發酵的最適種齡。薯渣固體發酵中分批單因素試驗結果依次為:接種量在10%時發酵效率達最高,為83.87%;發酵溫度在37℃時發酵效率最高,達85.55%;CaCO3添加量在5%時發酵效率達最大值,為90.24%;4種無機氮源中尿素組發酵效率達91.01%;尿素在0.8%添加量下發酵效率最大值為94.13%,同時發酵醪中活菌數達4.32×108 cfu/g。依據以上單因素試驗結果,CaCO3適宜添加量為5%,與中和發酵體系中初始糖(10%)產生的乳酸所需的理論添加值相符,故以5%作為其固定添加量,不再列入正交試驗的考察范圍。此外,加入了纖維素酶作為考察因素,確定正交試驗因素與水平,開展四因素三水平的正交試驗,最終確立了最適薯渣發酵條件:接種量10%、尿素添加量0.8%、纖維素酶含量0.4%、發酵溫度35℃、碳酸鈣添加量5%,在該條件下發酵效率可達(96.55±0.866)%,發酵醪中活菌數達3.04×108 cfu/g。【結論】建立了低成本、簡工藝、高效率的甘薯廢渣發酵生產乳酸工藝。該工藝不僅適于工業化生產乳酸,同時易于被廣大甘薯淀粉加工農戶利用。
    NaCl濃度和pH對甘薯蛋白肽乳化特性的影響
    崔珊珊,木泰華,孫紅男,張苗,陳井旺
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1778-1786.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.014
    摘要 ( 223 )   HTML ( 1 )   PDF (745KB) ( 388 )   收藏
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    【目的】明確不同NaCl濃度和pH對甘薯蛋白肽乳化特性的影響,為甘薯蛋白肽在食品工業中的應用提供理論依據。【方法】測定不同NaCl濃度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)和不同pH(3、5、7和9)條件下,甘薯蛋白肽乳化液的顯微結構、乳化顆粒平均粒徑(d4,3)、乳化活性、乳化穩定性、流變學性質和甘薯蛋白肽的表面疏水活性。【結果】與未添加NaCl的相比,添加濃度為0.2 mol·L-1NaCl時,甘薯蛋白肽乳化液的d4,3由54.19 μm增大至59.70 μm;乳化活性指數由86.29 m2·g-1顯著降低為56.35 m2·g-1P<0.05);乳化穩定性指數由14.84 min降為13.19 min。然而,隨著NaCl濃度的增大,甘薯蛋白肽乳化顆粒均一程度降低,d4,3進一步由0.2 mol·L-1時的59.70 μm增加至69.72 μm;而乳化活性由56.35 m2·g-1逐漸降低至32.32 m2·g-1,乳化穩定性呈先升高后降低的趨勢,在0.4 m2·g-1時達最大值,為15.55 min;初始表觀黏度增大,并有剪切變稀現象發生;表面疏水活性降低。此外,隨著pH增加,乳化顆粒均一程度升高,d4,3由pH 3時的64.45 μm減小至pH 9時的51.21 μm;而乳化活性由pH 3時的3.99 m2·g-1升高至pH 9時的120.47 m2·g-1,乳化穩定性呈先降低后升高的變化趨勢,pH 3時其最佳值為29.13 min;初始表觀黏度降低,并有剪切變稀現象發生;表面疏水活性升高。【結論】甘薯蛋白肽的乳化特性與NaCl濃度和pH密切相關,添加0.2 mol·L-1 NaCl降低了甘薯蛋白肽的乳化活性和穩定性,而增加pH可有效提高甘薯蛋白肽的乳化活性。
    ‘寧紫薯1號’花青素組分鑒定及其對大鼠高脂誘導肥胖的預防效果
    張 毅,王洪云,鈕福祥,孫 健,徐 飛,朱 紅,岳瑞雪
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1787-1802.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.015
    摘要 ( 259 )   HTML ( 6 )   PDF (1719KB) ( 362 )   收藏
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    【目的】紫甘薯是天然抗氧化物花青素的重要來源。鑒定‘寧紫薯1號’花青素(PSPC)組成成分,探索紫甘薯花青素對高脂誘導肥胖的預防效果并探討其分子機制。【方法】通過液質聯用技術分析紫甘薯新品種‘寧紫薯1號’的花青素組分;采用pH示差法測定制備的樣品中總花青素含量。建立因高脂攝入過多導致機體產生營養性肥胖的動物模型,并灌胃不同劑量的紫甘薯花青素比較其預防肥胖效果。每周定時測量大鼠禁食6 h后的體重,通過試劑盒檢測大鼠血清樣品血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的含量,采用酶聯免疫法檢測瘦素(Leptin)含量。通過熒光定量PCR法(RT-PCR)檢測下丘腦樣品瘦素及其受體的mRNA表達,采用蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測瘦素及其下游蛋白的信號表達。【結果】分離鑒定出11種PSPC組分,其中10種為已知的矢車菊素和芍藥素酰基化衍生物,峰1為新發現的1種化合物。制備的花青素樣品中矢車菊素-3-葡萄糖苷含量為17.4%。體重指標直接表明高劑量花青素組預防肥胖效果最好,為(358.2±20.1)g,中劑量組其次,為(371.6±16.3)g;效果最差的為低劑量組,體重為(384.0±7.2)g。紫甘薯花青素各劑量組大鼠血糖、甘油三酯和總膽固醇的3項血生化指標均趨于正常水平,有效預防肥胖的發生。血清瘦素檢測結果顯示,高脂組比對照組多釋放65.50%;低劑量、中劑量和高劑量紫甘薯花青素組血清瘦素含量分別為(3.13±0.05)、(2.84±0.12)和(2.64±0.06)ng·mL-1,與高脂組相比均顯著下降。同時不同劑量紫甘薯花青素組下丘腦中瘦素及瘦素受體的mRNA表達均顯著高于高脂組。而高劑量紫甘薯花青素組可以調節下丘腦中瘦素信號,從而降低下游腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)的磷酸化。【結論】高劑量紫甘薯花青素可以通過調節下丘腦中leptin/AMPKα信號通路有效抑制高脂誘導肥胖的形成。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    豬cGAS基因的克隆與原核表達
    杜麗麗,樊爽爽,李賽賽,陳佩格,陳 磊,孫士平,樊文杰,王 江,王月影,鐘 凱
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1803-1809.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.016
    摘要 ( 261 )   HTML ( 4 )   PDF (1062KB) ( 732 )   收藏
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    【目的】環磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS)是近期在哺乳動物細胞中發現的一種新型核酸轉移酶,能夠識別胞質DNA,催化ATP和GTP生成第二信使cGAMP,繼而通過STING依賴的方式活化轉錄因子IRF3,啟動機體固有免疫。通過構建含豬cGAS基因的重組質粒pBbB3a-His6-NusA-cGAS,進行原核表達,得到cGAS蛋白,為進行體外催化合成cGAMP及探討其在天然免疫過程中的作用奠定基礎。【方法】以豬脾臟cDNA為模板克隆豬cGAS的蛋白編碼區 (open reading frame, ORF),用非酶連接技術將此基因克隆至丙酸誘導型原核表達載體pBbB3a-His6-NusA-LIC中。菌液PCR進行陽性克隆鑒定并測序。將測序鑒定正確的克隆菌液提取質粒,轉化至E.coli BL21 (DE3)中。當細菌生長到對數期時,丙酸鈉誘導表達His6-NusA-cGAS融合蛋白,用20 mmol·L-1丙酸鈉在20℃180 r/min分別誘導0, 2, 4, 6, 8, 10 h,以確定最佳誘導時間;然后,分別用0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 mmol·L-1的丙酸鈉在20℃180 r/min誘導6 h,以確定最佳誘導丙酸鈉誘導濃度;另外,分別在20℃,30℃,37℃條件下用20 mmol·L-1丙酸鈉,180 r/min培養6 h,以確定最佳誘導溫度。篩選最佳誘導條件,并用SDS-PAGE和Western blotting進行鑒定。【結果】(1)本試驗成功克隆了豬cGAS基因,其ORF長度為1 494 bp;(2)構建了cGAS丙酸誘導型原核表達載體pBbB3a-His6-NusA-cGAS;(3)His6-NusA-cGAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L-1丙酸鈉,誘導6 h時表達量最高。(4)His6-NusA-cGAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表達,相對分子質量為111.87 kD。【結論】運用大腸桿菌表達系統成功表達了cGAS融合蛋白,本試驗為體外表達cGAS融合蛋白提供技術方法。
    小鼠角蛋白10(K10)基因啟動子的克隆及活性分析
    張俊珍,劉 彧,姬凱元,楊姍姍,胡帥鵬,劉學賢,范瑞文
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1810-1817.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.017
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    【目的】角蛋白10 (K10) 是黑色素細胞中黑素體向周圍角化細胞遷移的分子標記之一,在研究基因在黑色素細胞與角化細胞相互作用的功能時,可以作為特異的啟動子。本研究欲篩選K10較強的啟動子片段,為研究K10以及相關基因的功能提供理論依據和奠定理論基礎。【方法】從小鼠尾巴提取基因組DNA,經質量鑒定后,采用PCR法擴增K10的6個不同片段(F1—F6),并將其分別亞克隆到pMD18-T載體,經測序驗證是否正確;將K10的6個亞克隆片段再克隆到pGL0載體中,產生pGL0 - F1—F6構建,用脂質體法轉染293T細胞,轉染結束后將細胞裂解,并通過雙熒光素酶報告基因檢測6個片段轉染細胞后引起的熒光素酶活性變化,以篩選啟動效果最好的啟動子片段;用篩選到的K10啟動子片段作為特異啟動子,替換pGL0載體上的CMV強啟動子,并與周期素依賴蛋白激酶5(CDK5)基因進行重組,形成pGL0-F-CDK5構建,用脂質體法轉染小鼠皮膚角化細胞,待轉染結束后,分別進行細胞爬片、細胞裂解和細胞總RNA的提取,之后用免疫熒光化學、雙熒光素酶報告基因檢測法和實時熒光定量PCR法檢測CDK5的表達定位、表達水平及熒光素酶活性,以檢測其在角化細胞中的啟動效果;用生物信息法Promoter Scan分析所得到的活性最強的K10啟動子片段,發現其可能的轉錄因子結合位點。【結果】PCR擴增、克隆得到K10啟動子的6個片段(F1—F6),片段大小分別為1 201、908、664、787、790、656 bp;質粒pGL0 - F1—F6分別轉染293T細胞后,通過雙熒光報告檢測發現長度為787bp的F4啟動子活性最強;但F1—F6啟動子的活性均弱于pGL0-basic中CMV的啟動活性;F4序列中含有基本啟動子保守區域的共同序列即TATAAAA,經Promoter Scan分析發現F4序列中含有C/EBPβ、GATA、HSF、CAP等多個轉錄因子的結合位點,這些位點利于K10在角化細胞中表達;pGL0-F4-CDK5轉染角化細胞后,通過熒光蛋白的表達檢測載體上GFP報告基因的表達,發現pGL0-F4-CDK5轉染角化細胞后引起GFP的表達量明顯強于pGL0-basic-CDK5轉染組;同時用熒光素酶活性檢測pGL0-F4-CDK5在角化細胞中的啟動效果,結果發現pGL0-F4-CDK5轉染組的熒光比值明顯高于對照組,差異顯著(P<0.01);經實時熒光定量PCR檢測CDK5的表達變化,結果發現pGL0-F4-CDK5轉染角化細胞后引起CDK5 mRNA表達量明顯高于對照組,差異呈極顯著(P<0.01)。上述結果說明F4具有較強的啟動子活性,是K10啟動子的核心區。【結論】成功篩選了K10的核心啟動子區域F4,在角化細胞里具有啟動目標基因CDK5表達的功能,因此,F4可作為黑色素細胞與角化細胞相互作用過程中基因功能研究的特異性啟動子,為研究K10基因功能提供理論依據。
    牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測方法的建立
    王 芳,馮 宇,張 閣,蔣 卉,朱良全,丁家波
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1818-1825.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.018
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    【目的】建立高通量牛布魯氏菌間接ELISA診斷方法,為科學高效診斷牛布魯氏菌病提供技術手段。【方法】以提純的豬布魯氏菌S2株脂多糖(LPS)作為包被抗原,采用棋盤滴定法確定了抗原包被濃度、包被液、抗原包被時間、封閉液、樣品稀釋液、血清稀釋倍數、兔抗牛酶標抗體稀釋液、兔抗牛酶標抗體稀釋濃度、最佳TMB底物反應時間等參數,初步建立了牛布魯氏菌間接ELSIA方法。并用上述條件初步建立的方法對176份牛布魯氏菌病陽性血清和132份牛布魯氏菌病陰性血清進行檢測。檢測結果經SPSS17.0軟件分析,構建受試者工作特征曲線(ROC)及曲線下面積,確定敏感性和特異性;通過Youden指數確定陰陽性判定的臨界點。使用質控陰、陽性血清評價試劑盒的批內和批間重復性。用本研究建立的ELISA試劑盒及商品化試劑盒同時對臨床上1 200份牛血清樣本進行比對檢測,比較其符合率。【結果】通過棋盤法確定的試劑盒中各組分的最佳條件為:抗原包被濃度為10 μg·mL-1,最適包被液為碳酸鹽緩沖液,最佳包被時間為2—8℃、16 h,最適血清稀釋度為1﹕50,最佳封閉液為含有3%明膠的PBST,最佳樣品稀釋液為含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶標抗體稀釋液為含有5%馬血清的PBST,最佳兔抗牛酶標抗體工作濃度為1﹕20 000,最佳TMB底物反應時間為15 min。按上述條件建立的間接ELISA方法檢測176份牛布魯氏菌病陽性血清和132份牛布魯氏菌陰性血清,并統計結果后使用SPSS17.0軟件分析該方法受試者工作特征曲線(ROC)線下面積為0.98。最佳判定臨界點為樣本OD值/陽性OD值(S/P)×100%=20%。在此臨界值上時,敏感性為97.7%,特異性為95.5%。對1 200份臨床樣本的比對檢測顯示,本研究建立的間接ELISA方法與進口商品化試劑盒的總符合率為96.25%。【結論】建立了特異性和敏感性良好的牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測方法。
    研究簡報
    放牧強度對高寒草地不同類群土壤動物的群落結構和多樣性的影響
    武 崎,吳鵬飛,王 群,文勇立,高艷美,張榮芝,龍 偉
    中國農業科學. 2016, 49(9):  1826-1834.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.019
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    【目的】明確放牧強度對高寒草地生態系統中不同類群土壤動物群落結構和多樣性的影響。【方法】2014年9月在川西北紅原縣的西南民族大學“青藏高原生態保護與畜牧業高科技研究示范基地”內選取輕度放牧(light grazing,LG,15 sheep/hm2)、中度放牧(medium grazing,MG,22 sheep/hm2)、重度放牧(heavy grazing,HG,36 sheep/hm2)及無放牧(對照)(no grazing,NG) 4個樣地。使用Vortis便攜式吸蟲器采集地表小型節肢動物;用環刀采集0—5、5—10和10—15 cm層土樣,每層采2份,分別用干漏斗法(Tullgren)和濕漏斗法(Baermann)分別分離土壤節肢動物和土壤線蟲。【結果】主成分(PCA)分析結果表明,無放牧處理與其他放牧處理樣地間的3類土壤動物群落結構均存在明顯差異,說明放牧對土壤動物群落結構具有顯著影響;而土壤線蟲群落結構在3種放牧強度之間的差異最明顯,其次是地表節肢動物,土壤節肢動物群落結構在3中放牧強度間的差異相對最小。3種放牧強度樣地中的土壤節肢動物及土壤線蟲的群落密度均顯著高于無放牧處理樣地(P<0.01),而地表節肢動物群落密度則以輕度放牧樣地最低。地表節肢動物的類群數隨放牧強度增加而增加,但不同放強度間無顯著差異(P>0.05);Shannon多樣性指數和Pielou均勻度指數均隨放牧強度的增加呈先下降后增加的變化趨勢,且以無放牧處理最高,中度放牧處理最低,不同放牧強度間具有顯著差異(P<0.05)。土壤節肢動物的類群數和Shannon多樣性指數均呈先增加后下降的變化趨勢,且均是中度放牧強度樣地的多樣性顯著高于其他放牧強度樣地(P<0.05);而Pielou 均勻度指數無明顯變化趨勢(P>0.05)。土壤線蟲的類群數以輕度放牧最高,Shannon多樣性指數則是隨放牧強度增加而下降,Pielou均勻度指數呈先下降后增加的趨勢,以中度放牧最低,無放牧處理最高;單因素方差分析結果表明土壤線蟲的多樣性指數在各放牧處理間均有顯著差異(P<0.05)。多元回歸分析結果表明地表和土壤節肢動物的密度和多樣性指數與土壤化學性質呈顯著相關(P<0.05或P<0.01),土壤線蟲群落密度和多樣性指數與土壤化學性質和放牧強度呈顯著相關(P<0.01)。【結論】不同類群土壤動物對放牧強度的響應不同,重度放牧有利于地表節肢動物,中度放牧利于土壤節肢動物,輕度放牧利于土壤線蟲。因此在評價放牧對草地生態系統的影響時選取合適的土壤動物類群非常關鍵。
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