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當期目錄

    2016年 第49卷 第10期 刊出日期:2016-05-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    水稻穗退化突變體spd11的遺傳分析及候選基因鑒定
    鐘萍,陳璞睿,王遷,肖富良,張寬,馬芙蓉,黃美菱,王平榮,鄧曉建,孫昌輝
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1835-1843.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.001
    摘要 ( 482 )   HTML ( 2 )   PDF (4612KB) ( 567 )   收藏
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    【目的】對水稻穗退化突變體spd11進行遺傳分析及候選基因鑒定,以便了解水稻穗發育的調控機制。【方法】用化學誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理粳稻品種中花11的直立密穗突變體dep2,從突變體庫中篩選到一份穗退化突變體spd11。觀察該突變體表型,并調查其主要農藝性狀。由于突變體不能結實,將可分離出spd11突變植株的株系分單株收種、種植,并對后代株系的分離情況進行調查統計,分析該突變性狀的遺傳行為。將spd11雜合植株與岡46B雜交的F2后代作為定位群體,對spd11突變體進行基因定位,遴選候選基因并進行DNA測序驗證;同時,對不同物種中spd11候選基因的同源基因所編碼蛋白進行進化樹和序列比對分析。【結果】與其對照親本相比,spd11植株劍葉長度增加23%;穗部一次枝梗明顯縮短,且一次枝梗數量減少58%。小穗幾乎完全退化為白色絮狀物,偶爾可見個別退化不完全的穎花著生,且該穎花僅由一個完全閉合的穎殼組成,不能正常結實。除此以外,spd11的分蘗數及劍葉寬等農藝性狀無顯著差異。遺傳分析表明,在可分離出spd11突變株的后代中,一部分株系無分離,全部植株均為正常株,而另一部分株系有突變株分離,并且正常植株與突變植株分離明顯,分離比例經卡方(χ2)測驗符合3﹕1,表明spd11的突變性狀由一對隱性核基因控制。利用分子標記將該突變基因定位于第1染色體長臂2個In/Del標記ch1-2295和ch1-2299之間約43.2 kb的區域內,遺傳距離分別為0.23 cM和0.46 cM,該區間內共有8個預測基因。測序分析發現,spd11突變體中OsLOG編碼區第116位堿基G突變為堿基A,造成編碼蛋白的第39位半胱氨酸(C)突變為酪氨酸(Y)。同源蛋白比對和系統進化分析表明LOG蛋白在不同物種中都是高度保守的,并且spd11的突變發生在非常保守的氨基酸上。對已報道的多個log等位突變體的突變位點和突變表型嚴重程度的比對分析表明,spd11突變位點可能處于OsLOG蛋白功能的關鍵位點。【結論】SPD11可能是細胞分裂素激活酶基因OsLOG的等位基因,spd11在OsLOG外顯子上一個關鍵位點發生了突變,導致OSLOG蛋白功能受損,使細胞分裂素的活化進程受阻,從而產生了穗退化的突變表型。
    芝麻AQP家族的全基因組序列鑒定及其特征分析
    吳向陽,程朝澤,呂高強,王心宇
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1844-1858.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.002
    摘要 ( 325 )   HTML ( 2 )   PDF (1766KB) ( 638 )   收藏
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    【目的】從芝麻全基因組中分離鑒定水通道蛋白AQP(aquaporin)家族基因,并進行系統進化關系、連鎖群定位、基因結構、跨膜結構域和亞細胞定位預測、保守性氨基酸殘基以及青枯雷爾氏菌誘導表達分析,為芝麻AQP的功能研究與利用奠定基礎。【方法】通過生物信息學手段,結合芝麻基因組注釋信息,鑒定芝麻AQP家族成員序列信息,并用InterPro逐一進行驗證。利用ClustalW2對芝麻、擬南芥和水稻的AQP以及馬鈴薯的XIPs進行多序列比對,用MEGA6.0構建進化樹。通過MapInspect和Gene Structure Display Server 2.0進行連鎖群定位和基因結構分析。采用ProtParam、WoLF PSORT和TMHMM Server v.2.0在線工具預測芝麻水通道蛋白的分子質量和等電點、亞細胞定位及跨膜結構域。通過芝麻、擬南芥和水稻AQP及馬鈴薯XIPs的蛋白多序列比對結果推測NPA基序、ar/R濾器及P1—P5的氨基酸殘基。利用前期研究獲得的轉錄組測序結果進行青枯雷爾氏菌誘導表達分析,并通過qRT-PCR技術對差異表達較為明顯的12個芝麻AQP進行驗證。【結果】系統分析鑒定了36個芝麻AQP家族基因,根據多序列比對及系統進化分析將其分為5個亞家族:13個質膜內在蛋白(PIP)、12個液胞膜內在蛋白(TIP)、8個類NOD26膜內在蛋白(NIP)、2個膜內在小分子堿性蛋白(SIP)和1個未知內在蛋白(XIP),其中有34個基因定位在12個連鎖群上。同一亞家族成員在基因結構、蛋白序列、亞細胞定位預測及保守性氨基酸殘基等方面都較為相似。青枯雷爾氏菌誘導表達分析顯示,NIPs、SIPs和XIPs表達無明顯變化,部分PIPs和TIPs能夠響應青枯菌誘導。SiPIP1;2、SiPIP1;3、SiPIP2;3和SiPIP2;4受青枯菌誘導后表達上調,SiPIP1;3和SiPIP2;3為持續上調,而SiPIP1;2和SiPIP2;4的表達先下調后上調;與之相反,表達下調較為顯著的有SiPIP1;4、SiPIP2;1、SiPIP2;6、SiTIP1;1、SiTIP1;3、SiTIP2;1及SiTIP2;2。上述差異表達基因的qRT-PCR驗證結果與轉錄組測序結果一致。【結論】通過全基因組分析,在芝麻中鑒定出36個AQP家族基因,分為5個亞家族,分布于12個連鎖群上,大部分基因具有1—4個內含子(除SiNIP1;2有7個內含子外)。根據ar/R濾器和P1—P5氨基酸殘基組成類型,預測不同亞家族AQP可能識別的底物。青枯菌誘導表達分析表明,部分PIPs和TIPs成員的表達發生了顯著變化。
    耕作栽培·生理生化
    全球氣候變暖對中國種植制度可能影響Ⅻ. 氣候變暖對黑龍江寒地水稻安全種植區域和冷害風險的影響
    王曉煜,楊曉光,呂 碩,陳 阜
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1859-1871.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.003
    摘要 ( 293 )   HTML ( 1 )   PDF (2148KB) ( 564 )   收藏
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    【目的】以1981年為時間節點,將1961—2010年劃分為2個時段,結合未來不同升溫情景,定量分析歷史和未來氣候變暖對黑龍江寒地水稻安全種植區域影響以及由此帶來的冷害風險。【方法】利用積溫帶劃分標準和農業氣候指標,結合ArcGIS方法,對比分析歷史和未來黑龍江積溫帶及寒地水稻安全種植區界限的空間變化特征。基于氣象行業標準中水稻冷害標準分析寒地水稻安全種植北界變化敏感區域的延遲型冷害及障礙型冷害變化特征,評估氣候變暖背景下水稻種植北界敏感地區冷害風險特征,并預估未來不同升溫情景下冷害風險演變趨勢。【結果】與1961—1980年相比,研究區域內1981—2010年積溫帶發生了明顯的北移東擴,平均北移1.19個緯度,位移最大的是第五積溫帶和第六積溫帶,面積增加最多的是第二積溫帶,幾乎覆蓋了整個松嫩平原。未來不同升溫情景下各積溫帶北擴趨勢明顯,面積增加最多的是第一積溫帶。1981—2010年寒地水稻安全種植北界相對于1961—1980年北移121 km,水稻安全種植北界北移至嫩江中部-五大連池-遜克北部一線。未來升溫1—3℃情景下,寒地水稻安全種植北界向北移動410.5—545 km,向北擴展至黑龍江省呼瑪以北地區,溫度升高3℃時,除漠河地區外都可種植寒地水稻。比較寒地水稻種植界限敏感區域和非敏感區冷害風險可見,敏感區域冷害風險明顯高于非敏感區域,其中障礙型冷害風險高于延遲型冷害,寒地水稻種植區嚴重冷害出現頻率最高,其次是輕度冷害,中度冷害最低。1981—2010年敏感區域嚴重和輕度延遲型冷害較非敏感區域顯著增加,中度延遲型冷害風險在敏感區域和非敏感區域均較低,敏感區域的各級障礙型冷害較非敏感區域明顯增加;未來升溫情景下敏感區域的各級冷害均高于非敏感區域。【結論】氣候變暖背景下黑龍江積溫帶及寒地水稻安全種植北界發生了明顯北移,未來升溫情景下仍呈北移趨勢。寒地水稻種植敏感區域的冷害風險明顯高于非敏感區域,隨著未來溫度升高,冷害有不同程度的減輕,但仍需進一步關注寒地水稻種植區北緣北擴后的冷害風險,采取改進栽培技術與選育抗寒早熟品種等低溫冷害防御措施,同時避免水稻種植區域的盲目擴大和品種越區種植,加強冷害防御能力。
    不同地力下基蘗肥運籌比例對水稻產量及氮肥吸收利用的影響
    范立慧,徐珊珊,侯朋福,薛利紅,李剛華,丁艷鋒,楊林章
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1872-1884.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.004
    摘要 ( 447 )   HTML ( 1 )   PDF (477KB) ( 469 )   收藏
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    【目的】研究不同地力條件下,水稻基蘗肥運籌比例對水稻產量、氮素利用率及群體質量的影響,并探明水稻高產適宜的基蘗肥運籌比例以及其是否受土壤地力條件的影響。【方法】選用武運粳23號為供試品種,采用大田小區試驗,考察了5種基蘗肥運籌比例R1(10﹕0)、R2(7﹕3)、R3(5﹕5)、R4(3﹕7)、R5(0﹕10)在2種地力水平(高地力、低地力)下對水稻產量及產量構成因素、氮素吸收利用及轉運和群體質量的影響。【結果】低地力土壤下,隨著蘗肥比例的增加,分蘗速度先增加后減少,高峰苗數降低,干物質積累、氮素利用率及產量均呈現先增加后減少的趨勢,基蘗肥比例在施氮量300 kg·hm-2時以3﹕7最佳,施氮量240 kg·hm-2時以5﹕5最佳,此時產量及氮素農學利用率分別可達13.12、13.16 t·hm-2及27.00、29.28 kg·kg-1,顯著高于其他處理。在高地力土壤中,隨著蘗肥比例的增加,穗數先增加后減少,穗粒數呈現增加的趨勢,產量、氮素農學利用率及偏生產力呈現減少趨勢,但處理間差異不顯著。高地力條件下的分蘗發生速率大于低地力條件,達到高峰苗時間縮短,高峰苗數高于低地力條件。高地力條件下抽穗期至成熟期的干物質積累量較高,有利于后期向籽粒中轉運光合產物,因此結實率和千粒重要高于低地力條件,從而導致高地力條件下產量整體高于低地力。在2種地力條件下,不施基肥(R5)處理的分蘗數及高峰苗數最低,分蘗發生時間推遲,表明基肥對于水稻實現分蘗快發、早發具有一定的促進作用;隨著基肥用量的增加,分蘗發生時間縮短,緩苗加快,但是蘗肥期氮素供應不足,分蘗速率降低,使得群體到達有效穗數的時間延長。合理協調基肥和蘗肥的比例,低地力條件下基肥用量以50—60 kg·hm-2、基蘗肥比例為1﹕1時,可保證高產的同時減少總氮肥用量(從300 kg·hm-2 降低到240 kg·hm-2)。【結論】基蘗肥運籌比例對產量及氮素利用率的影響因地力水平的差異而不同,并受總施氮量的影響。在低地力下要保證高產并減少氮肥用量,必須注重基蘗肥的合理運籌,保證一定量的基肥投入,并調整好基蘗肥比例。
    植物保護
    鏈格孢菌蘋果致病型的ATMT轉化體系的建立
    顧雪迎,施文驍,王洪凱,郭慶元
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1885-1891.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.005
    摘要 ( 280 )   HTML ( 7 )   PDF (1043KB) ( 302 )   收藏
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    【目的】鏈格孢菌(Alternaria alternate)蘋果致病型是蘋果上的重要致病菌,可以侵染蘋果葉片和果實。論文旨在建立農桿菌介導的鏈格孢菌蘋果致病型高效穩定的分子轉化體系,為在分子水平上研究鏈格孢蘋果致病型病菌的致病機制提供技術支持。【方法】質粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架為基礎構建的穿梭質粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位點上插入了綠色熒光蛋白基因,這個質粒在大腸桿菌和農桿菌細胞中都能夠穩定地復制繁殖。將質粒pKO1-HPH采用凍融法轉化到農桿菌菌株AGL1中,然后與鏈格孢蘋果致病型菌株XP-1的分生孢子在誘導培養基上共培養進行基因轉化,轉化子在含有潮霉素的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行篩選;在含有50 μg·mL-1潮霉素的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上檢測轉化子細胞中抗性基因在轉化子中的表達情況;用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白基因在轉化子細胞中的表達情況。在初步確認可以將綠色熒光蛋白和潮霉素B磷酸轉移酶基因轉入鏈格孢蘋果致病型菌株中后,對菌落培養時間、轉化前分生孢子的預處理方法對轉化效率的影響進一步優化。轉化子的穩定性采用分生孢子5次繼代培養后,能否在含有潮霉素的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上穩定生長來檢測;采用PCR方法檢測綠色熒光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸轉移酶基因是否存在于轉化子基因組中;用Southern雜交檢測外源基因在轉化子基因組中插入的拷貝數;在蘋果果實和葉片上接種檢測轉化子致病性的變化。【結果】將100 μL孢子懸浮液(含105孢子)涂布于馬鈴薯-胡蘿卜-瓊脂平板上菌落培養36—48 h后,鏈格孢蘋果致病型菌株XP-1可以產生足量的孢子用于農桿菌介導的分子轉化。將分生孢子用無菌水洗下,在4℃處理6 h,再與含質粒pKO1-HPH的農桿菌進行誘導共培養,轉化子在含有50 μg·mL-1潮霉素的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行篩選,轉化效率較好,107個分生孢子轉化可獲得約200個轉化子。轉化子經過5次繼代培養,對潮霉素B的抗性沒有改變。特異性引物PCR檢測表明外源基因能夠成功地整合到供試菌株的基因組中;Southern雜交表明外源基因多以單拷貝形式隨機插入到鏈格孢蘋果致病型菌株XP-1細胞的基因組中;轉化子的菌絲和分生孢子在熒光顯微鏡下可以觀察到明顯的綠色熒光,說明熒光蛋白基因在菌絲及孢子中均能夠成功表達。通過部分轉化子的致病性試驗,篩選獲得數個在蘋果果實和葉片上致病性都顯著降低的菌株。【結論】建立了農桿菌介導的鏈格孢菌蘋果致病型穩定高效的分子轉化體系,為進一步開展此病菌與其寄主的分子互作研究打下基礎。
    避雨栽培對葡萄霜霉病菌孢子囊飛散時空動態的影響
    于舒怡,劉長遠,王 輝,劉 麗,關天舒
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1892-1902.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.006
    摘要 ( 265 )   HTML ( 1 )   PDF (515KB) ( 378 )   收藏
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    【目的】葡萄霜霉病是葡萄生產上最重要的病害之一,在多雨潮濕地區常造成嚴重的產量損失。研究旨在明確避雨栽培對葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)孢子囊飛散的影響,確定孢子囊飛散與病情變化之間關系,揭示避雨栽培對病菌數量的控制作用,推測避雨栽培下霜霉病的初侵染來源,為葡萄霜霉病的科學防控提供理論依據。【方法】2013年生長季7—9月份,分別對沈陽地區露地和避雨栽培小區內葡萄霜霉病發病情況進行定株定枝系統調查,統計得到病葉率和病情指數。應用SPSS19.0中回歸曲線估計程序構建葡萄霜霉病流行時間動態模型,獲得能描述不同栽培模式下葡萄霜霉病發病動態的模型參數,并推導2種栽培模式下霜霉病流行時期和流行速率。通過對田間小區內的孢子囊飛散進行定期監測,對比不同栽培模式下孢子囊飛散時間動態差異,探索關鍵流行時期內病害流行速率與捕孢量之間的關系。對比分析避雨栽培對葡萄霜霉病孢子囊水平、垂直方向飛散的影響,明確關鍵流行時期內孢子囊的主要來源和孢子囊飛散的主要影響因素。【結果】避雨和露地栽培下葡萄霜霉病的季節流行曲線趨勢一致,均表現為典型的S形曲線。應用SPSS19.0軟件分析,明確了Logistic模型能夠反映沈陽地區葡萄霜霉病流行時間動態情況。露地和避雨栽培下病害流行時期:指數增長期分別為7月5—23日和8月18—30日,邏輯斯蒂增長期分別為7月23日至8月19日和8月30日至9月17日,衰退期分別為8月19日至葡萄生育末期和9月17日至葡萄生育末期。露地栽培下整個生長季孢子囊飛散表現為多峰曲線,當日降雨對孢子囊飛散有顯著的沖刷作用。沈陽地區露地和避雨栽培下孢子囊飛散盛期分別為7—8月和8—9月。避雨栽培可明顯降低空中孢子囊數量,從而減少孢子囊與避雨設施內葡萄葉片的接觸概率,達到降低菌源基數的作用。避雨設施邊行最早捕獲孢子囊,且數量最多,隨著逐漸向中心靠近,首次捕孢時間逐漸推遲,數量逐漸降低。葡萄葉幕對于孢子囊水平方向的飛散具有顯著的阻隔效應。不同栽培模式下均以接近地面處的捕孢量最大,且隨著高度增加,捕孢量逐漸減少。避雨設施對于接近棚頂處的孢子囊飛散有著顯著的遮蔽作用。【結論】避雨栽培可推遲葡萄霜霉病始發時間和首次捕孢時間,縮短病害流行過程和孢子囊飛散周期,顯著降低病害流行程度和孢子囊飛散數量。孢子囊飛散受到葡萄葉幕和避雨設施顯著的阻隔效應。避雨栽培下葡萄霜霉病的初侵染主要為本地露地栽培下葡萄霜霉病病株上的病斑產生的孢子囊。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    長期施肥對黃壤性水稻土磷平衡及農學閾值的影響
    劉彥伶,李渝,張雅蓉,張文安,蔣太明
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1903-1912.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.007
    摘要 ( 261 )   HTML ( 1 )   PDF (451KB) ( 714 )   收藏
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    【目的】研究長期施肥條件下土壤有效磷(Olsen-P)的演變特征及土壤磷素的累積狀況,分析土壤磷素累積與土壤有效磷的響應關系,明確Olsen-P的農學閾值及合理磷肥施用量,為西南黃壤地區科學施用磷肥提供理論依據。【方法】以貴州黃壤肥力與肥料長期定位試驗為平臺,選擇試驗中6個處理分別是不施肥(CK)、偏施氮鉀肥(NK)、常量氮磷鉀肥(NPK)、常量有機肥(M)、減1/2有機肥+減1/2氮磷鉀肥(1/2 M +1/2 NPK)和常量有機肥+常量氮磷鉀肥(MNPK)。分析西南黃壤性水稻土19年(1995—2013)土壤Olsen-P含量與植株吸磷量,研究土壤Olsen-P的變化規律及土壤累積磷盈虧狀況,通過Mitscherlich方程模擬作物相對產量對土壤Olsen-P的響應關系,明確西南黃壤性水稻土的農學閾值,并分析Olsen-P與施肥量之間的關系。【結果】長期施用磷肥處理可顯著提高土壤Olsen-P含量,各施磷處理Olsen-P年增長速率在0.72—2.47 mg·kg-1·a-1,其中MNPK處理Olsen-P增長速率最大,NPK處理最小,主要與施肥量的高低有關;有機肥配施化學磷肥比單施化學磷肥和單施有機肥更能有效地促進作物對磷素的吸收;不施磷處理土壤磷素一直處于虧缺狀態,施磷處理土壤磷素盈余量為176—1 200 kg·hm-2,其中MNPK處理磷素盈余量最高;土壤累積磷盈余量與土壤Olsen-P增量呈顯著線性相關,土壤中磷素每盈余100 kg·hm-2,NPK、M、1/2M+1/2NPK、MNPK處理Olsen-P含量分別提高4.0、2.0、3.2和2.0 mg·kg-1;土壤每年磷盈虧和Olsen-P含量與磷肥施用量呈極顯著正相關關系,磷肥用量(純P)17.4 kg·hm-2時土壤磷盈虧呈持平狀態,西南黃壤性水稻土Olsen-P的農學閾值為15.8 mg·kg-1;對應的施肥量(純P)為每年37.2 kg·hm-2·a-1。【結論】土壤有效磷隨土壤磷素盈余而變化,同時與磷素投入量密切相關,當磷肥用量(純P)為17.4 kg·hm-2·a-1土壤磷素呈持平狀態。當磷肥用量(純P)為37.2 kg·hm-2·a-1時,可獲得較高作物產量,磷肥當季利用率高,且磷素在土壤中累積較少。當磷肥用量(純P)大于37.2 kg·hm-2·a-1時,作物產量對磷肥用量無響應,大量磷素累積在土壤中,增加土壤磷素的流失風險。土壤中累積磷盈余量一定的情況下,西南黃壤性水稻土長期單施化學磷肥提升土壤Olsen-P的速率大于施用有機肥處理。
    長期玉米連作下黑土各組分有機質化學結構特征
    張福韜,喬云發,苗淑杰,韓曉增
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1913-1924.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.008
    摘要 ( 315 )   HTML ( 2 )   PDF (633KB) ( 511 )   收藏
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    【目的】研究玉米連作24年前后黑土有機質紅外光譜特征,探明長期玉米連作對黑土各團聚體及密度組分中有機質結構的影響,完善長期連作下土壤有機質化學結構動態變化理論。【方法】以中國科學院海倫農業生態試驗站長期定位試驗為研究平臺,選取24年玉米連作下耕層(0—20 cm)土壤為研究對象,以試驗設置前土樣為對照,根據團聚體和密度大小,將土壤有機質進行分級,分別用元素分析儀和傅里葉紅外光譜儀測定原土、各粒級團聚體及密度組分中的碳含量和有機質的紅外光譜,對比分析玉米連作24年前后土壤有機質含量及紅外光譜特征。【結果】玉米連作24年后,全土中碳含量降低5.3%,2—0.25 mm團聚體中碳含量顯著降低,其他粒級團聚體中有降低的趨勢;LF(游離態輕組)中碳含量增加32.74%,OF(閉蓄態輕組)中減少16.72%,MF(礦質結合態組分)中沒有顯著變化。土壤有機質中脂肪族-CH、多糖C-O、酚醇-OH吸收峰相對強度增強,芳香族C=C和羧基C=O吸收峰相對強度降低,脂肪族-CH/芳香族C=C比值增加。在各粒級團聚體中,-CH/C=C比值增加主要表現在>2 mm團聚體中,主成分分析也表明>2 mm團聚體中有機質結構變化最大,該粒級團聚體中3個密度組分LF、OF和MF有機質-CH/C=C比值增加,且LF中增加程度最大;在其他粒級中的3個密度組分有機質-CH/C=C比值有增加的趨勢。【結論】長期玉米連作,黑土大粒級團聚體和各密度組分中有機質結構趨于脂肪化、簡單化,團聚體和礦物質結合對有機質的保護作用降低,黑土有機質穩定性下降。
    基于可見/近紅外光譜的黃河口區土壤鹽分及其主要離子的定量分析
    劉亞秋,陳紅艷,王瑞燕,常春艷,陳哲
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1925-1935.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.009
    摘要 ( 267 )   HTML ( 1 )   PDF (579KB) ( 394 )   收藏
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    【目的】定量、準確地監測鹽漬土,對其防治和農業可持續發展至關重要,論文旨在明確黃河口區土壤鹽分及其主要離子的特征光譜,建立適用于該區域的土壤鹽漬化定量分析模型,提高其定量分析的精度和穩定性。【方法】首先以山東省墾利縣為研究區,于2014年10月 5—9日野外采集代表性土樣96個,對土樣風干后,采用土壤化學分析方法室內分析鹽分及其主要離子(Cl-、Na+、Ca2+)含量,并采用美國ASD Fieldspec 3光譜儀測定土樣可見/近紅外高光譜數據,對光譜反射率進行去噪、一階導數變換等預處理;然后基于鹽分及其主要離子不同含量的樣本光譜分析鹽分及其主要離子的光譜響應,在此基礎上,對樣本的土壤鹽分及其主要離子含量與反射率的一階導數光譜進行逐波段的相關分析,按照相關系數高且顯著的原則,選取各自的敏感波段,再根據敏感波段的交叉情況選取集中波段為特征波段,進而選取特征波段中具有極值相關系數的波段作為顯著特征波段,綜合確定表征土壤鹽分及其主要離子(Cl-、Na+、Ca2+)的特征光譜;最后分別采用多元線性回歸(multiple linear regression,MLR)、支持向量機(support vector machine,SVM)和隨機森林(random forest,RF)方法構建土壤鹽分及其主要離子的定量高光譜分析模型。【結果】研究區土壤鹽分及其主要離子(Cl-、Na+、Ca2+)含量的光譜曲線形狀和走勢整體一致;土壤鹽分及其主要離子(Cl-、Na+、Ca2+)的光譜響應譜區為1 320—1 495、1 790—1 920、2 120—2 290 nm;基于相關分析的土壤鹽分及其主要離子的敏感譜區為1 490—1 520、1 890—1 930 nm;最后綜合光譜響應及相關分析確定土壤鹽分及其主要離子的特征波段為1 493、1 801、1 911和2 289 nm,顯著特征波段為1 493和1 911 nm。模型結果顯示基于2個顯著特征波段反射率一階導數的模型精度均與4個特征波段的模型精度相當,表明顯著特征光譜作為鹽分及其主要離子的特征光譜進行其定量分析的有效性。比較3種建模方法,RF模型的預測效果最好,SVM模型次之,而MLR模型精度最低;對于鹽分、Cl-和Na+,3種方法構建的模型均可有效地用于其定量分析,精度較高且穩定,然而Ca2+預測精度還有待提高。通過綜合比較分析,基于顯著特征波段(1 493和1 911 nm)反射率一階導數構建的隨機森林(RF)模型對鹽分、Cl-和Na+均具有較好的估測精度和穩定性,也可用于Ca2+的定量估測。【結論】基于光譜響應及相關分析綜合確定鹽分及其主要離子的顯著特征光譜(1 493和1 911 nm反射率一階導數),進而采用隨機森林方法構建鹽分及其主要離子的定量估測模型,適用于黃河口區土壤鹽漬化信息的有效提取。
     
    園藝
    三種類型柑橘成熟果實表面蠟質分析
    王金秋,何義仲,徐坤洋,羅 懌,盛 玲,羅 燾,劉 歡,程運江
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1936-1945.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.010
    摘要 ( 278 )   HTML ( 8 )   PDF (2333KB) ( 723 )   收藏
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    【目的】分析中國主栽柑橘類型(‘鄂柑一號’椪柑(Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan)、尤力克檸檬(C. limon cv Eureka cv. Lemon)和沙田柚(C. grandis Osbeck cv. Shatian Yu)成熟期果實表面蠟質,建立中國柑橘果實蠟質基礎數據,為科學指導柑橘采后生產提供依據。【方法】以3種類型柑橘的成熟果實為材料,采用掃描電鏡觀察果實表面蠟質晶體結構;用GC-MS測定果實表面蠟質成分及含量;用定量PCR檢測蠟質相關基因在不同類型柑橘果皮表達特性。【結果】掃描電鏡結果顯示沙田柚蠟質晶體呈較大的倒伏片狀,椪柑片狀晶體較小,檸檬介于上述兩者之間。GC-MS分析表明,3種類型柑橘果實表面外蠟中脂肪族物質主要組成成分相同,分別為:脂肪醛、飽和游離脂肪酸、飽和正鏈烷烴和伯醇,但品種之間各組分比例及碳原子分布有一定差異。椪柑、檸檬以及沙田柚外蠟含量分別為1.1、2.2和9.3 μg·cm-2。椪柑外蠟中醛、脂肪酸、烷烴和伯醇所占比例為50%、16%、28%和6%;檸檬中各個成分比例分別為42%、30%、18%和11%;沙田柚中則分別為50%、31%、12%和7%。椪柑中26醛和28醛含量最高;檸檬中碳原子數分配比較均勻,沒有絕對占主導的成分;沙田柚脂肪族物質中高碳原子數所占比例比其他柑橘類型果實蠟質中高,尤其是32酸、31和33烷烴含量很高。椪柑和檸檬總蠟含量分別為4.3和4.6 μg·cm-2。椪柑總蠟中醛、脂肪酸、烷烴和伯醇與外蠟各成分所占比例相似,分別為57%、14%、23%和4%;檸檬總蠟各成分所占比例則分別為53%、15%、19%和8%。總蠟不同種類脂肪族物質碳原子數分配與外蠟基本相同。萜類物質種類和含量在不同品種類型之間存在較大差異:檸檬中主要的三萜類成分是軟木三帖酮(friedelin)、羽扇豆醇(lupeol)、α-香樹精(α-amyrin)和β-香樹精(β-amyrin);椪柑中主要含有后3種,沒有檢測到軟木三帖酮;角鯊烯和法尼醇為緊皮柑橘(柚和檸檬)特有。定量表達分析表明,超長鏈脂肪酸輔酶A合成酶KCS6在不同柑橘類型之間的表達趨勢與其對應的物質含量比較吻合,推測該基因造成了這些柑橘類型蠟質含量的差異。酰基轉移酶CER2在沙田柚中表達量最高,推測該基因則導致了沙田柚中大于30碳原子數的蠟質成分在不同柑橘類型中占據最高比例。3種類型柑橘果實表面總蠟和外蠟中脂肪族物質均以醛為主,烷烴或酸次之,伯醇最少。總蠟和外蠟物質分配存在差異,其中伯醇和超長鏈脂肪酸在外蠟中占據比例更高,烷烴則是在外蠟中占據比例較低。萜類物質中三萜類和淄醇僅在總蠟中可以測定出,而角鯊烯和法尼醇則在外蠟和總蠟中都含有。【結論】蠟質成分在柑橘果實中受遺傳背景和果皮結構共同影響。寬皮柑橘與緊皮柑橘具有不同的蠟質特征,本研究結果對寬皮柑橘和緊皮柑橘品種特異性的果蠟配方研發具有重要參考價值。
    草莓果實不同發育時期的蛋白磷酸化水平
    呂曉蘇,李宇軒,苗 英,陳良珂,沈元月,秦 嶺,邢 宇
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1946-1959.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.011
    摘要 ( 322 )   HTML ( 1 )   PDF (521KB) ( 446 )   收藏
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    【目的】通過分析草莓果實生長發育過程中蛋白磷酸化水平的變化以期揭示蛋白磷酸化在果實生長發育成熟衰老過程中的作用。【方法】以iTraq(isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白質組學結合LC-MS/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)的方法對草莓果實的5個不同發育時期(小綠果時期、大綠果時期、白果時期、果實成熟期、果實成熟后期)的蛋白磷酸化水平進行綜合分析,并對這些鑒定到的磷酸化蛋白進行生物過程分類、亞細胞定位分類和分子功能分類。通過綜合分析多個數據庫的比對結果,對所鑒定的磷酸化蛋白進行功能的預測。【結果】不同發育時期的磷酸化蛋白有所差異,并且在大綠果時期到果實成熟期磷酸化差異蛋白總數比其他時期顯著增加,其中,多數的磷酸化蛋白參與生長發育調控。生物過程分類結果顯示,這些磷酸化蛋白多數集中在植物信號轉導途徑和糖代謝途徑中,其中,參與信號轉導途徑的有17個,參與糖代謝生物過程的有8個。屬于MAPK級聯途徑的有MAPKKK家族的101308592、MAPK家族的470122684和596127083。596127083的磷酸化水平在各個發育時期較為穩定,101308592隨發育時期磷酸化水平逐漸升高,而470122684的磷酸化水平從軟果期開始急劇下降。亞細胞定位分類結果顯示,多數磷酸化蛋白定位在細胞核和細胞質中。分子功能分類結果顯示,多數磷酸化蛋白具有轉錄調節和磷酸化去磷酸化的分子功能,鑒定出與生長發育調節相關的磷酸化蛋白有24個。其中,具有轉錄調控功能的有4個,參與細胞分裂的有6個,還有一部分磷酸化蛋白與調控生長發育的激素的響應有關,除此之外,還鑒定到3個與果實的成熟軟化相關的磷酸化蛋白。另外,一部分蛋白有多種磷酸化修飾方式,其中,SNF1相關蛋白激酶β亞基有3種磷酸化修飾,且其磷酸化水平各不相同。【結論】同種蛋白可能同時存在不止一種磷酸化修飾方式。不同的磷酸化修飾方式的作用不盡相同。不同的時期占主導地位的修飾方式也不盡相同。磷酸化蛋白不僅參與轉錄調節和細胞分裂分化,還參與果實發育過程中對植物激素的響應和糖的代謝積累,甚至參與果實成熟軟化的調節。另外,101308592和470122684可能參與果實生長發育的調控。總之,蛋白磷酸化修飾在草莓果實生長發育過程中起重要的調控作用。
    貯藏·保鮮·加工
    添加不飽和脂肪酸對釀酒酵母胞內脂肪酸成分和葡萄酒香氣的影響
    段亮亮,潘秋紅,王亞欽,葉冬青,段長青,燕國梁
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1960-1978.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.012
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    【目的】研究葡萄汁中不飽和脂肪酸(Unsaturated fatty acids,UFAs,包括油酸、亞油酸和α-亞麻酸)含量同時變化對葡萄酒發酵過程中釀酒酵母胞內脂肪酸成分和釀酒香氣的影響,為提高葡萄酒品質提供參考。【方法】選用‘美樂’葡萄(Vitis vinifera L.)汁為培養基,試驗設置對照組(不添加UFAs,CK)、低濃度UFAs添加組(LFG)和高濃度UFAs添加組(HFG),比較葡萄酒酒精發酵過程中3個處理組間酵母(Saccharomyces cerevisiae EC1118)生長(OD600)、細胞內脂肪酸成分以及釀酒香氣成分的差異。【結果】提高UFAs濃度能夠促進酵母細胞生長以及對UFAs的吸收,使胞內UFAs含量迅速增加,但抑制飽和脂肪酸(C4:0—C24:0)的合成。分析UFAs對葡萄酒香氣物質的影響發現,高濃度UFAs能夠促進酵母高級醇和乙醇酯類(包括己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯)香氣的產生,但抑制了中短鏈脂肪酸(medium-chain fatty acids,MCFAs,C4:0—C12:0)的產生,對來源于葡萄果實的醛類、單萜和降異戊二烯香氣的影響較小。【結論】提高葡萄汁初始UFAs含量能夠促進細胞生長,提高葡萄酒發酵速度,有利于乙醇酯類香氣物質的合成,從而增強葡萄酒的果香、花香和甜香特征。因此,調控葡萄或葡萄汁中不飽和脂肪酸濃度可以作為調控葡萄酒香氣品質的一種重要手段。
    不同乳酸菌發酵對桂圓肉中酚類物質及抗氧化活性的影響
    賴婷,劉磊,張名位,張瑞芬,張雁,魏振承,鄧媛元
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1979-1989.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.013
    摘要 ( 314 )   HTML ( 1 )   PDF (403KB) ( 509 )   收藏
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    【目的】比較不同乳酸菌種發酵對桂圓肉(干制的龍眼果肉)中游離態、結合態酚類物質含量和單體酚組成及其抗氧化活性的影響,為開發營養保健的乳酸菌發酵龍眼新產品提供參考。【方法】將桂圓肉打漿(料水比為1﹕1.5)后作為發酵基質,進行高溫濕熱滅菌,再分別接入7種不同乳酸菌(植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、戊糖片球菌、明串珠菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和干酪乳桿菌,菌濃度:8.0—9.0 lg CFU/mL),接種量為1%,在30℃下靜置發酵48 h(pH 4.0—4.2),然后對發酵前后桂圓肉中游離態和結合態總酚、總黃酮含量的變化進行分析,采用高效液相色譜法分析其單體酚類的組成及含量的變化,采用鐵離子還原能力(ferric reducing abi1ity of plasma,FRAP)和氧自由基吸收能力(oxygen radical absorption capacity,ORAC)兩種方法評價其體外抗氧化能力差異。【結果】7種乳酸菌發酵均能不同程度增加桂圓肉中游離態總酚和總黃酮含量,降低結合態總酚和總黃酮含量。與發酵前相比,發酵后桂圓肉游離態總酚含量增加0.4%—11.9%,結合態總酚含量下降14.4%—41.4%;游離態總黃酮含量增加2.8%—19.6%,結合態總黃酮含量下降19.6%—70.6%。但不同菌種對其影響存在差異,其中植物乳桿菌釋放桂圓肉中結合態酚類物質的能力最強,使游離酚含量增加11.9%,結合態酚含量下降41.4%,游離態總黃酮增加19.6%,結合態總黃酮下降70.6%。不同乳酸菌發酵對桂圓肉中單體酚(沒食子酸、丁香酸、表兒茶素、高兒茶酚、原兒茶酸、對香豆酸和異槲皮苷)含量影響亦存在顯著差異(P<0.05),其中發酵后的游離態的沒食子酸和高兒茶酚含量分別增加8.6%—69.8%和0.4%—29.5%,結合態的沒食子酸和高兒茶酚含量分別下降80.0%—88.3%和45.6%—73.9%。而乳酸菌發酵后,桂圓肉游離態FRAP和ORAC抗氧化能力與發酵前相比也有顯著提高(P<0.05),其中植物乳桿菌發酵后,游離態FRAP和ORAC抗氧化能力分別提高11.8%和59.1%。【結論】乳酸菌發酵能提高桂圓肉中游離態酚類物質含量,降低結合態酚類物質含量,同時提高其抗氧化能力。植物乳桿菌在發酵桂圓肉的過程中,其釋放結合態酚類物質的能力明顯優于其他乳酸菌,其發酵后桂圓肉的抗氧化能力也有明顯提高。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    山羊PRNP基因啟動子轉錄活性研究
    周榮艷,魏彥輝,錫建中,李蘭會,陳 輝,高立杰,張振紅
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1990-1997.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.014
    摘要 ( 231 )   HTML ( 1 )   PDF (2144KB) ( 347 )   收藏
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    【目的】分析山羊PRNP基因啟動子活性區域,旨在篩選調節朊蛋白表達水平的關鍵區域或轉錄因子,為闡明山羊PRNP基因的表達調控提供理論依據,并為從遺傳學角度降低朊蛋白病的發生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列(GenBank登錄號:EU870890)為模板,設計特異性引物,擴增山羊PRNP基因5′側翼區片段,并將擴增片段克隆至pEASY-T3載體,鑒定為陽性的克隆進行測序;利用生物信息學方法和在線工具進行啟動子區域和轉錄因子結合位點的預測;利用缺失突變技術擴增啟動子區不同長度的片段11個,并克隆至pEASY-T3載體后,鑒定為陽性的質粒和pGL3-Basic載體分別用限制性內切酶Mlu I和Bgl II進行酶切,并回收酶切產物;利用T4連接酶進行目的片段與pGL3-Basic連接,鑒定為陽性的熒光素酶報告基因重組質粒進行測序,并提取無內毒素質粒,用脂質體轉染法瞬時轉染至SH-SY5Y細胞,轉染48h后,利用雙熒光素酶檢測試劑盒進行各缺失突變重組質粒在細胞內的啟動活性檢測。【結果】成功克隆了山羊PRNP基因5′側翼區片段,長度為2 332 bp,且該片段含有預測的啟動子活性區域、保守的motifs和多個轉錄因子的結合位點;成功克隆了11個含有不同長度啟動子的片段,并與熒光素酶報告基因連接,并構建了目的片段與熒光素酶報告基因的重組質粒;轉染時脂質體與DNA的比例為1﹕0.5,螢火蟲熒光素酶載體與海腎熒光素酶比例為50﹕1;山羊PRNP基因5′側翼區存在著核心啟動子,啟動子活性最強的區域為-519—+82 bp,且在-220—+59 bp這一區域存在著正調控元件,外顯子1對啟動子活性中起重要的調控作用;4個motifs可能為正調控元件結合位點;在強啟動子活性區存在10個Sp1結合位點,2個AP-2 alpha結合位點和1個AP-1結合位點;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分別預測為轉錄因子Foxp3和COE 1的結合位點。【結論】確定了山羊PRNP基因啟動子的核心區域(-519—+82bp),外顯子1對啟動子活性起重要的調控作用。
    山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其組織表達
    占思遠,董 堯,李 利,仲 濤,王林杰,張紅平
    中國農業科學. 2016, 49(10):  1998-2007.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.015
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    【目的】克隆獲得南江黃羊IGFBP-2(Insulin-like growth factor binding protein -2)基因的CDS區全序列,對其進行生物信息學分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白組織表達特征,為深入研究該基因在出生后山羊生長和發育過程中的作用以及表達調控提供基礎資料。【方法】下載NCBI的GenBank數據庫中公布的綿羊(Ovis aries,NM_001009436)和牛(Bos taurus,NM_174555)的IGFBP-2基因的mRNA序列,經序列比對后采用保守區域序列并利用Primer Premier 6.0軟件設計克隆引物,經PCR擴增后采用TA克隆技術獲取含有陽性克隆子的菌液,送公司測序得到山羊IGFBP-2基因的完整編碼區序列,并利用EditSeq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和ExPASy在線平臺等軟件對CDS區序列和其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析;獲得山羊IGFBP-2基因CDS區序列后,利用該序列設計實時熒光定量PCR(Q-PCR)引物,采用Q-PCR和蛋白質免疫印跡雜交(Western blotting)方法檢測了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黃羊不同組織(心臟、肝臟、肺、背最長肌、半膜肌和臂三頭肌)和不同發育階段(3、30、60、90和120 d)的表達情況。【結果】①克隆得到954bp的南江黃羊IGFBP-2基因的CDS區全序列,堿基組成為GC含量69.39%,AT含量30.61%,共編碼317個氨基酸殘基,預測的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小為33.8808 kD,等電點為7.82,二級結構由無規卷曲(68.14%)、α-螺旋(18.30%)和延伸鏈(13.56%)三種形式組成;蛋白結構域分析發現,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB(IGFBP homologues)和TY(Thyroglobulin type Ι repeats)結構域,IB結構域位于第37—125位氨基酸處,TY結構域位于第250—302位氨基酸處;②磷酸化位點預測發現,IGFBP-2蛋白中存在Ser(5)和Thr(7)共12個磷酸化位點;糖基化位點預測發現,IGFBP-2蛋白序列中存在10個N-糖基化位點和2個O-糖基化位點;③CDS區序列相似性比較發現,山羊IGFBP-2與綿羊、牛、豬、人和小鼠的相似性分別達到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比較發現,山羊IGFBP-2與綿羊、牛、豬、人和小鼠的相似性分別達到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;④系統進化樹分析發現,山羊IGFBP-2與綿羊和牛的親緣關系最近;⑤組織表達分析表明,IGFBP-2在肝臟中的mRNA和蛋白的相對表達量均最高(P<0.01),背最長肌次之;在不同發育階段的肝臟組織中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相對表達量均呈現一直上升的趨勢;在不同發育階段的背最長肌組織中,IGFBP-2的mRNA表達水平呈現一種“上升-下降-上升”的波動平衡。【結論】獲得了山羊IGFBP-2基因完整的編碼區序列和組織表達特征,生物信息學分析發現IGFBP-2基因的編碼區序列具有物種間的保守性,肝臟是山羊IGFBP-2 的mRNA和蛋白表達的主要組織,同時在山羊不同發育階段的肝臟和背最長肌組織中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表達豐度呈現一定的規律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生長發育過程中發揮著重要的作用。
    豬圓環病毒2型誘導PK-15細胞產生IFN-β的信號通路研究
    張新晨,趙其嶺,陳萌萌,孫嘉瑞,鮑恩東,張書霞,呂英軍
    中國農業科學. 2016, 49(10):  2008-2016.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.016
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    【目的】研究豬圓環病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15細胞后調控β-干擾素(interferon-β,IFN-β)生成的信號通路,為豬圓環病毒病的發生機理和防治提供理論基礎。【方法】將PK-15細胞隨機分成5組:對照組、PCV2組、BX795(TBK1/IKKε抑制劑)組、BAY 11-7082(NF-κB抑制劑)組和BX795+BAY 11-7082(混合抑制劑)組。 BX795組、BAY 11-7082組、BX795+BAY 11-7082組分別用0.5µmol BX795、5µmol BAY 11-7082、0.5µmol BX795+5µmol BAY 11-7082預先處理1h,然后感染PCV2。于感染后3、12、24、48和72h收集細胞,提取RNA。用熒光定量PCR檢測IFN-β、模式識別受體(TLR3、TLR9、RIG-1、MDA-5、DAI)、接頭蛋白(TRIF、MyD88、Sting、MAVS、IRF3)的mRNA含量。【結果】PCV2感染PK-15細胞后,IFN-β的mRNA含量在48、72h顯著升高(P<0.01),表明PCV2感染可以誘導PK-15細胞生成IFN-β;TLR3的mRNA含量在48h顯著升高(P<0.01),TLR9的表達量在48、72h顯著升高(P<0.01);TLR3和TLR9下游的接頭蛋白MyD88和TRIF的mRNA含量在48h顯著升高(P<0.01),表明PCV2激活了Toll樣受體介導的NF-κB信號途徑;MDA-5的mRNA含量在48、72h顯著升高(P<0.01),RIG-1的mRNA含量在72h顯著升高(P<0.01),MDA-5和RIG-1下游的接頭蛋白MAVS、Sting、IRF3的mRNA含量在48h顯著升高(P<0.01),表明PCV2激活了RIG-1樣受體介導的IRF3信號途徑;DAI的mRNA含量在48、72h顯著升高(P<0.01),表明PCV2亦激活了DNA模式識別受體介導的IRF3信號途徑;分別用BX795和BAY 11-7082抑制IRF3和NF-κB介導的信號通路,結果顯示NF-κB抑制劑組的IFN-β的mRNA含量與PCV2組相比無顯著性差異(P>0.05),TBK1/IKKε抑制劑組的IFN-β的mRNA含量與PCV2組相比明顯下降(P<0.05),表明PCV2誘導IFN-β的產生主要由IRF3信號途徑調控。【結論】PCV2感染可以誘導PK-15細胞中IFN-β表達量的上調,其上調主要與IRF3信號通路有關。
    2014-2015年中國部分地區蜜蜂慢性麻痹病病毒流行病學調查及系統發育分析
    賈慧茹,吳艷艷,王強,代平禮,周婷
    中國農業科學. 2016, 49(10):  2017-2026.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.017
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    【目的】前期筆者課題組對北京地區蜂群進行了常見病毒感染情況的調查,發現蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)在病蜂群中的檢出率顯著高于在健康蜂群中的檢出率,據此推測可借助病蜂群對CBPV進行研究。鑒于目前國內CBPV流行病學數據的匱乏,論文旨在了解中國主要養蜂區病蜂群中CBPV的分布及遺傳變異情況,以期為該病的防控提供依據。【方法】2014—2015年間從四川、安徽、浙江、河南、山東、山西、黑龍江、北京8個主要養蜂省(市)共采集到136份病蜂樣品,采用RT-PCR法檢測CBPV的感染情況。每份樣品隨機選取10只蜜蜂,取其頭部,利用Trizol法提取樣品的總RNA;通過凝膠電泳及NanodropND-2000對總RNA的質量進行定性與定量檢測。以樣品總RNA為模板合成cDNA第一條鏈,而后以cDNA為模板擴增CBPV的特異性片段。所有擴增片段均進行瓊脂糖凝膠電泳,對部分陽性樣品進行測序與序列分析;通過擴增片段與陽性片段的比對確定每份樣品中CBPV的檢出情況。為研究CBPV中國分離株的系統發育特性,以樣品cDNA為模板,擴增全部陽性樣品的RdRP基因(RNA-dependent RNA polymerase)特異性片段,而后進行測序與序列分析。將序列提交至GenBank獲取基因登錄號。對獲得的分離株的RdRP基因與GenBank上發表的相應序列進行比較分析,利用CLUSTAL W軟件對全部參考序列及本研究獲得的分離株的對應序列進行同源性比對,應用軟件MEGA 6.0 中鄰接法(neighbor-joining)對所有序列繪制系統進化樹。【結果】蜜蜂頭部總RNA質量檢測結果顯示,所有樣品的總RNA相對完整,且濃度處于(980.5±37.1)ng·L-1范圍內,A260/A280 在1.92—2.24。CBPV感染率檢測結果顯示,136份病蜂樣本中共檢出120份CBPV陽性樣品,陽性率高達88.2%。全部陽性樣品的電泳結果可見與預期大小一致的特異性片段,其序列與靶序列同源性達到99%以上。RdRp基因特異性片段的序列分析表明,本研究共獲得8個CBPV中國分離株,其序列與多種其他地區的CBPV的相應序列同源性達到97%以上。中國分離株GenBank登錄號分別為KT374042—KT374049。對其系統進化樹分析后可知,世界流行的CBPV分離株可分為5個進化分支:兩個歐洲分支(European clade 1、 European clade 2),兩個中日混合分支(Chinese -Japanese clade 1、Chinese-Japanese clade 2)和一個美國分支(US clade)。獲得的8個中國分離株均存在于同一進化分支上,且與之前得到的6個江蘇分離株以及4個日本分離株共同形成兩個混合分支。【結論】進一步證實了中國病蜂群中普遍存在CBPV感染;系統進化關系表明,目前國內CBPV分離株之間的遺傳關系無明顯地域性特征,與日本分離株親緣關系較近。有關CBPV的監測工作亟需加強,且其預警作用需引起重視。
    家蠶bHLH轉錄因子Bmdimm與Bmchip的相互作用
    趙朋,王葉菁,位曙光,劉莉娜,李珍珍,趙萍,何華偉
    中國農業科學. 2016, 49(10):  2027-2038.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.018
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    【目的】bHLH轉錄因子Bmdimm是家蠶(Bombyx mori)5齡后期調控蠶絲蛋白絲素重鏈基因表達的重要轉錄因子。分析發現Bmdimm蛋白中包含有可能發生泛素化修飾的賴氨酸殘基K43,因此推測Bmdimm可能發生泛素化修飾而被降解。Bmchip屬于家蠶泛素連接酶E3家族中的U-box亞家族,在家蠶5齡期后部絲腺中有表達。論文旨在明確Bmdimm與Bmchip之間的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蠶體內的泛素化修飾及其對絲素重鏈基因轉錄調控的生物學意義。【方法】利用家蠶各組織基因芯片表達譜分析Bmdimm和Bmchip在后部絲腺中的表達情況;分別通過PCR和基因合成獲得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,將其構建到不同的原核表達載體并轉化大腸桿菌表達目的蛋白,篩選最優的表達條件;利用鎳柱親和層析純化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通過鎳柱親和層析去除融合標簽,純化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝膠過濾層析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集狀態;利用圓二色光譜研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二級結構;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在體外的相互作用;利用微量熱泳動研究Bmdimm和Bmchip結合的親和力。【結果】基因芯片表達譜揭示Bmdimm和Bmchip在家蠶5齡期后部絲腺中都有表達。構建了Bmdimm和Bmchip多種表達載體,發現ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表達載體在16℃,0.3 mmol·L-1 IPTG誘導下表達最好,并以此為基礎表達純化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝膠過濾分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚體的形式存在;圓二色光譜顯示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋結構; Far-western blotting和Pull-down結果表明Bmdimm和Bmchip可以在體外結合;利用微量熱泳動實驗計算出Bmdimm和Bmchip結合的平衡解離常數為(750±28.6)μmol·L-1。【結論】家蠶bHLH轉錄因子Bmdimm和泛素連接酶Bmchip在家蠶5齡期后部絲腺中均有表達,二者可以在體外發生瞬時相互作用,暗示了Bmdimm可能通過Bmchip介導發生泛素化修飾從而下調絲素重鏈基因的轉錄。
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