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當期目錄

    2016年 第49卷 第14期 刊出日期:2016-07-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    酵母耐鹽相關基因HAL1在棉花中的功能表達
    穆 敏,舒 娜,王 帥,郭麗雪,樊偉麗,陰祖軍,王俊娟,王德龍,葉武威
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2651-2661.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.001
    摘要 ( 331 )   HTML ( 1 )   PDF (6543KB) ( 821 )   收藏
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    【目的】克隆釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)耐鹽基因HAL1(halotolerance)并轉化棉花,探究該基因在棉花中的功能,進一步探究酵母耐鹽相關基因在高等植物中的具體功能。【方法】根據NCBI核酸數據庫中酵母耐鹽基因HAL1的mRNA全長序列信息,利用RT-PCR技術從釀酒酵母As2.375中克隆該基因。選擇酶切位點XbaⅠ和SmaⅠ對表達載體pBI121::GFP進行雙酶切,采用In-Fusion技術構建pBI121-ScHAL1::GFP融合表達載體。以自發熒光較弱的陸地棉品種Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉為材料,用基因槍轟擊棉花花粉進行瞬時表達研究。采用基因槍活體轉化技術將外源基因表達載體pBI121-HAL1::GFP轉化棉花鹽敏感材料中s9612,獲得T0棉花轉基因種子。用100 mmol·L-1 NaCl鹽溶液對轉基因T0種子進行耐鹽性發芽試驗,并進行分子檢測,對鑒定出的轉基因植株進行葉盤耐鹽性分析。【結果】從釀酒酵母As2.375中克隆耐鹽基因ScHAL1,基因全長885 bp,共編碼294個氨基酸。對其序列進行分析,發現HAL1蛋白中絲氨酸所占比例最大,整個蛋白呈堿性且帶正電,屬于親水性蛋白。根據蛋白二級結構預測結果,推測該蛋白的結構功能域可能主要由無規則卷曲和β-折疊片構成。棉花花粉瞬時表達結果表明,轉化HAL1后,3種陸地棉花粉的綠色熒光現象都明顯增強,說明該基因可以在這3種陸地棉的花粉中表達。用100 mmol·L-1 NaCl鹽溶液對轉基因棉花T0種子和受體材料中s9612自交種進行脅迫,發現轉基因種子萌發能力明顯強于受體材料,表明HAL1可以提高種子耐鹽性。根據基因核苷酸序列設計2對引物對T0轉基因棉花幼苗進行分子檢測,將純化后的PCR產物進行直接測序,測序結果證明轉基因成功。對鑒定出的轉基因植株進行葉盤耐鹽性分析發現,在600 mmol·L-1 NaCl和400 mmol·L-1 NaCl鹽脅迫下轉基因植株葉盤葉綠素含量均高于對照植株,且在600 mmol·L-1 NaCl溶液脅迫后,轉HAL1植株葉綠素含量反而高于400 mmol·L-1 NaCl溶液處理后的葉盤。【結論】成功從釀酒酵母中克隆基因HAL1,酵母HAL1對提高棉花耐鹽性具有重要作用。
    甘蔗獨腳金內酯生物合成基因ScCCD8的克隆與表達分析
    吳轉娣,劉新龍,劉家勇,昝逢剛,趙培方,林秀琴,陳學寬,蘇火生,劉洪博,吳才文
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2662-2674.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.002
    摘要 ( 321 )   HTML ( 4 )   PDF (6809KB) ( 798 )   收藏
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    【目的】克隆甘蔗的ScCCD8,分析其序列特征并預測其功能,研究在甘蔗不同組織部位、不同脅迫處理條件以及不同生長時間點ScCCD8的表達情況,為該基因在甘蔗基因工程育種中的應用提供理論支撐。【方法】以NCBI中檢索的甘蔗CCD8同源片段EST序列為模板設計引物,擴增甘蔗CCD8的片段,采用RACE和RT-PCR技術分別從甘蔗品種新臺糖22號中克隆CCD8的5′、3′目的片段和全長cDNA序列,以生物信息學方法對序列進行預測分析,利用qRT-PCR方法分析CCD8在不同組織、不同逆境脅迫條件下和不同生長時間點的表達特性。【結果】克隆獲得甘蔗CCD8,命名為ScCCD8,GenBank登錄號為KP742973.1。該cDNA全長2 016 bp,含有1個1 623 bp的完整開放閱讀框(ORF),編碼540個氨基酸,編碼的蛋白質分子量為59.534 kD。生物信息學分析表明ScCCD8編碼的蛋白是定位于葉綠體上的非分泌性蛋白,不是典型的跨膜蛋白,沒有信號肽位點。存在著多個糖基化位點和磷酸化位點等活性位點。序列分析表明,ScCCD8與其他植物的CCD8蛋白有很高的相似性。系統進化樹分析顯示,甘蔗ScCCD8與高粱的CCD8蛋白親緣關系較近。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,ScCCD8的表達具有組織特異性,在根中的表達量最高,是老葉中表達量的18倍。其在模擬重度干旱脅迫(20% PEG)、鹽脅迫(200 mmol·L-1 NaCl)、磷缺乏(1/8 mmol·L-1)和營養缺乏(純水培養)4種脅迫處理下,莖尖中的ScCCD8均被誘導表達,且在處理24 h以后,ScCCD8的表達量增加較為明顯。在不同生長時期,ScCCD8在甘蔗不同生長時期的莖尖中均有表達,且在幼苗期的表達量高于萌芽期和分蘗期。【結論】從甘蔗品種ROC22中克隆獲得的甘蔗獨腳金內酯生物合成關鍵基因ScCCD8是CCD8基因家族成員,推測ScCCD8可能與甘蔗SLs響應逆境脅迫有關。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    微噴補灌對冬小麥旗葉衰老和光合特性及產量和水分利用效率的影響
    徐學欣,王東
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2675-2686.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.003
    摘要 ( 296 )   HTML ( 1 )   PDF (503KB) ( 617 )   收藏
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    【目的】探明微噴補灌對冬小麥開花后旗葉衰老和光合特性、籽粒灌漿速率、產量和水分利用效率的影響,為小麥節水高產提供重要技術支持。【方法】于2011—2013年冬小麥生長季,選用高產冬小麥品種濟麥22,設置全生育期不灌水(W0)、微噴補灌(W1)和傳統畦灌(W2)處理,研究小麥開花后旗葉水勢、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活性、葉綠素熒光參數、群體光合速率和籽粒灌漿速率等的差異。W1與W2處理的灌水時期一致,均于小麥拔節期和開花期各灌水1次。W1處理采用小麥專用微噴帶(ZL201220356553.7)補充灌溉,灌水前測定土壤含水量。兩年度小麥拔節期均設定0—140 cm土層土壤目標相對含水量為70%,第一年和第二年小麥開花期設定0—140 cm土層土壤目標相對含水量分別為70%和65%,根據灌水定額公式計算所需補灌水量。W2處理采用傳統畦灌方式灌溉,改口成數為90%,即當水流前鋒到達畦長長度的90%位置時停止灌水,用水表計量實際灌水量。W1與W2處理試驗小區的規格一致,畦寬(左側畦梗中心線至右側畦梗中心線的垂直距離)2 m,畦梗寬0.4 m,畦長60 m,面積120 m2。小區間設1.0 m保護行。每小區等行距種植8行小麥,實際行距22.9 cm。W1處理的每個試驗小區在自邊行向內數第4行與第5行小麥之間沿小麥種植行向(畦長方向)鋪設一條專用微噴帶。微噴帶進水端裝有壓力表、水表和閘閥,進水端水壓設為0.02 MPa。灌溉水水源為井水,從水源至微噴帶和畦田進水端采用PVC水龍帶輸水。畦灌的單寬流量為4.6—5.2 L·m-1·s-1。【結果】兩年度微噴補灌處理在小麥拔節期和開花期的補灌水量分別為21.3—96.0 mm和29.0—38.5 mm,灌水分布均勻系數達87.9%—97.0%,不低于傳統畦灌處理,而全生育期總灌水量比傳統畦灌處理減少33.2—70.8 mm,節水21.0%—54.2%。微噴補灌處理開花后旗葉水勢、SOD和CAT活性、丙二醛含量、旗葉最大光化學效率、實際光化學效率,及群體光合速率和籽粒灌漿速率、籽粒產量均與全生育期灌2水的傳統畦灌處理無顯著差異,但水分利用效率提高2.1—2.9 kg·hm-2·mm-1,達21.6—23.2 kg·hm-2·mm-1。【結論】小麥拔節期和開花期微噴補灌可以根據灌水前的降水量和土壤含水量狀況及時調節補灌水量,并實施精確、均勻灌溉,適量供給小麥高產生理需水,挖掘出小麥節水的更大潛力。
    不同氮肥水平下玉米根際土壤特性與產量的關系
    張學林,徐 鈞,安婷婷,侯小畔,李潮海
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2687-2699.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.004
    摘要 ( 417 )   HTML ( 1 )   PDF (819KB) ( 867 )   收藏
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    【目的】明確不同生育時期根際土壤特性與玉米籽粒產量之間的關系,能夠為生產上合理施肥、提高氮素利用效率和減輕環境污染提供理論依據。【方法】2012年大田設置5個氮肥梯度固定施肥樣地(對照、180 kg·hm-2、240 kg·hm-2、300 kg·hm-2和360 kg·hm-2,分別簡寫為CK、N180、N240、N300和N360),并于2012、2013和2014年連續3年在玉米拔節、吐絲、成熟3個關鍵生育時期測定玉米根際和非根際土壤銨態氮、硝態氮、脲酶、過氧化氫酶、pH,同時測定玉米根系和地上部生物量及其氮素累積量,重點分析CK、N240和N360 3個處理根際土壤特性以及植株氮素累積量與玉米籽粒產量之間的關系。【結果】與CK相比,4個施肥處理(N180、N240、N300和N360)3年產量的平均值分別增加了23.85%、36.40%、39.87%和34.78%;其地上部不同階段氮素累積量均顯著高于CK(2012年播種—拔節除外),并隨施肥量增加呈先增加后降低趨勢。與CK相比,4個施肥處理根際土硝態氮含量分別增加23.38%、57.13%、57.87%和69.74%,非根際土壤硝態氮分別增加59.49%、92.01%、132.08%和179.35%。隨施氮量的增加根際土銨態氮含量顯著增加;與CK相比,4個施肥處理3年的非根際土壤銨態氮含量分別增加4.27%、3.51%、5.04%和26.26%。根際土壤pH和非根際土壤pH均隨著氮肥施用量的增加而降低,其中根際土壤和非根際土壤pH的變化范圍分別為4.5—6.7和5.5—7.2。與非根際土pH相比,根際土壤pH平均降低5%。根際土壤脲酶活性隨氮肥用量的增加呈先增加后降低趨勢。與對照相比,4個施氮處理3年非根際土壤脲酶活性平均值分別增加了4.02%、14.73%、24.55%和19.64%。根際土和非根際土過氧化氫酶活性均隨氮肥用量的增加而降低,與CK相比,4個施氮處理3年的非根際土壤過氧化氫酶活性平均值分別降低了3.03%、5.09%、8.24%和12.67%。CK、N240和N360 3個處理不同生育時期玉米根際土壤特性以及植株氮素累積量與籽粒產量之間的相關分析結果表明,拔節期根際土壤硝態氮含量連續3年均與產量呈顯著正相關。吐絲期玉米根際和非根際土壤硝態氮、根際土壤銨態氮和非根際土pH均與籽粒產量呈顯著正相關;其中2013和2014年根際脲酶活性和根際土壤pH與產量的相關性也達到顯著水平。2013和2014年成熟期根際和非根際土硝態氮含量也與玉米產量呈顯著相關。主成分分析表明,玉米籽粒產量與拔節期土壤硝態氮含量、根際過氧化氫酶、地上部生物量和氮素累積量相關性較強;與吐絲期根際和非根際土壤硝態氮含量、根際土壤銨態氮含量和土壤pH以及地上部生物量及氮素累積量、根系生物量相關性較強;與成熟期地上部生物量和氮素累積量相關性較強。【結論】根據不同生育時期玉米根際土壤特性與籽粒產量之間的關系,進行合理施肥,能夠保證玉米根際養分的有效供應,營造良好的根際土壤環境,提高氮素利用效率、增加玉米籽粒產量。
    植物保護
    8%甲氰菊酯·丁氟螨酯納米乳劑的研制及其性能
    趙恒科,藍 月,南 燦,胡 月,饒 萍,田 亞,嚴 偉,錢 坤,何 林
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2700-2710.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.005
    摘要 ( 306 )   HTML ( 1 )   PDF (1479KB) ( 372 )   收藏
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    【目的】農藥復配可擴大防治譜、降低單劑用藥量和生產成本,延長藥劑使用壽命。開發能耗低、穩定性好的納米乳劑,使農藥有效成分可以通過劑型加工更好地發揮其生物效果,提高藥效。【方法】采用藥膜法測定兩種殺蟲殺螨劑甲氰菊酯、丁氟螨酯對朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)的毒力,采用共毒因子法評價兩個藥劑的增效作用,共毒系數法進行復配農藥最佳配比篩選,最后對配比與共毒系數進行數學模型方程擬合對最佳配比進行篩選;并在獲得最佳配比的基礎上采用低能乳化法加工成8%甲氰菊酯·丁氟螨酯納米乳劑,根據聯合國糧農組織納米乳劑特性及基本要求,進行8%甲氰菊酯·丁氟螨酯納米乳劑質量控制指標檢測;并通過接觸角和黏附功的測定初步探究納米乳劑的性能。【結果】藥膜法測定甲氰菊酯、丁氟螨酯處理朱砂葉螨雌成螨24 h后LC50分別為711.62、4.32 mg·L-1,共毒因子法測定結果表明,甲氰菊酯和丁氟螨酯復配在質量比18﹕1和165﹕1之間具有增效作用,增效配比區間較寬,兩者復配可行。共毒系數法結果表明,甲氰菊酯與丁氟螨酯的質量比為50﹕1時,共毒系數(CTC)最高,CTC=209.96。通過方程擬合,甲氰菊酯·丁氟螨酯配比與共毒系數的數學模型為y=-216.86x2+19201x-424807,R2=0.864,理論最佳配比約為39﹕1(質量比),CTC=211.91,進一步通過共毒系數法對理論最佳配比驗證得:甲氰菊酯﹕丁氟螨酯=39﹕1時,毒力回歸方程為y=0.66x+3.8,r=0.9757,LC50=60.96 mg·L-1,共毒系數(CTC)高達215.36。由以上結果可知理論最佳配比與實際最佳配比增效作用基本一致,說明篩選的甲氰菊酯和丁氟螨酯最佳配比具有實際可靠性。最終確定39﹕1(甲氰菊酯﹕丁氟螨酯質量比)為最佳配比進行納米乳劑的研制。通過溶劑、乳化劑、水質的篩選,得到8%甲氰菊酯·丁氟螨酯納米乳劑的最佳制劑配方,優化配方為:甲氰菊酯7.8%,丁氟螨酯0.2%,溶劑10%(溶劑油S-150#﹕二甲苯=4﹕1),乳化劑9%—11%(十二烷基苯磺酸鈣﹕聚氧乙烯脂肪酸酯=2﹕3),丙三醇2%,水補足至100%。所研制8%甲氰菊酯·丁氟螨酯納米乳劑外觀呈透明均相液體,乳液穩定性、低溫穩定性、熱貯穩定性、經時穩定性等指標均合格,稀釋200倍呈淡藍色均相透明液體且分散性良好。8%甲氰菊酯·丁氟螨酯納米乳劑與兩種單劑相比接觸角更小,黏附功大,納米乳液霧滴與靶標結合得更加牢固,藥液不容易從靶標上灑落,更有利于植物對藥液的吸收,可提高藥效。【結論】采用共毒因子法、共毒系數法與擬合方程相結合進行最佳配比的篩選,其結果可以更全面、客觀地反映出二元復配劑的增效情況,對農藥復配有一定的指導價值,同時納米乳劑的引入對于改善當前農藥劑型結構具有重要意義。
    西瓜花葉病毒(WMV)單克隆抗體的制備及其應用
    陳 浙,宋 革,周雪平,吳建祥
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2711-2724.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.006
    摘要 ( 180 )   HTML ( 1 )   PDF (2456KB) ( 336 )   收藏
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    【目的】制備抗西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)的特異性單克隆抗體,并以其為核心建立能快速有效地檢測WMV的血清學方法,從而為中國田間西瓜花葉病毒病的診斷和檢測、預測預警及科學防控體系的建立提供物質和技術支撐。【方法】用提純的WMV病毒粒子免疫BALB/c小鼠,經細胞融合和細胞培養、抗體篩選和細胞克隆等雜交瘤細胞技術,獲得能穩定分泌抗WMV單克隆抗體的雜交瘤細胞株,將雜交瘤細胞注射入BALB/c小鼠腹腔制備其單抗腹水,并以制備的單抗為核心建立能準確、特異、靈敏地檢測田間植物中WMV的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法,以及能檢測單頭傳毒介體蚜蟲體內WMV的dot-ELISA方法。【結果】3株能穩定分泌WMV單克隆抗體的雜交瘤細胞株(2C8、15A8和16C12)及其單抗腹水被制備,3株雜交瘤細胞分泌的單抗腹水的間接ELISA效價均達到了10-6以上,抗體類型及亞類均為IgG1、kappa輕鏈。Western blot分析發現,這3個單抗均與WMV的外殼蛋白亞基有特異性反應。靈敏度分析結果表明,ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR方法檢測WMV病葉的靈敏度分別達到1﹕163 840、1﹕327 680、1﹕5 120和1﹕1 310 720倍稀釋(w/v,g/mL)。特異性分析結果表明,以這3個單抗為核心建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR 5種血清學檢測方法均能與感染WMV的病葉發生特異性免疫反應,而與感染小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的植物樣品、健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草的植物組織均呈陰性反應,且dot-ELISA方法還能特異性地檢測單頭蚜蟲體內的WMV,而在檢測無毒蚜蟲時呈陰性反應。利用建立的血清學檢測方法對采自浙江省、江蘇省、山東省和海南省的275株葫蘆科疑似病株進行檢測,結果發現187株植物感染WMV,發病率達68%,說明WMV在中國田間葫蘆科植物中廣泛流行發生,且血清學方法的檢測結果與RT-PCR方法的檢測結果完全一致,將部分PCR產物進行核酸測序和序列比對分析,結果表明這些PCR產物是WMV CP基因片段,證明血清學方法檢測陽性的樣品確實感染WMV。【結論】獲得了3株特異、靈敏的WMV單克隆抗體,以其為核心建立的5種血清學方法能準確、靈敏、可靠地應用于田間樣品中WMV的檢測,從而為中國WMV田間樣品的大規模快速檢測和診斷、該病害預報預警和科學防控提供物質和技術支撐。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    氮肥管理和秸稈腐熟劑對15N標記玉米秸稈氮有效性與去向的影響
     
    丁文成,李書田,黃紹敏
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2725-2736.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.007
    摘要 ( 279 )   HTML ( 1 )   PDF (370KB) ( 493 )   收藏
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    【目的】研究氮肥用量、有機無機配合和添加秸稈腐熟劑對秸稈氮當季有效性、后效及去向的影響,為秸稈還田條件下的氮肥管理提供理論依據。【方法】運用15N同位素示蹤技術,采用盆栽試驗連續種植一季冬小麥和兩茬玉米,研究15N標記玉米秸稈(15N-秸稈)氮的生物有效性和對土壤氮庫的貢獻。試驗推薦施氮量210 kg N·hm-2,約0.1 g N·kg-1土,秸稈粉碎后按3.0 g·kg-1土摻入每盆中。設4個氮水平:不施氮;100%化肥氮;80%化肥氮;有機無機配施(80%化肥氮+20%腐熟豬糞氮)。各施氮水平下設添加和不添加秸稈腐熟劑2種情況,腐熟劑用量為0.1 g·kg-1土。【結果】冬小麥吸氮量來自15N-秸稈氮的比例(%Ndfs)為6.30%—14.25%,施氮比不施氮減少%Ndfs,有機無機配施比單施氮肥提高%Ndfs,添加腐熟劑不影響冬小麥的%Ndfs。第一茬和第二茬玉米吸收氮的%Ndfs分別為1.13%—3.73%和1.67%—5.97%,不施氮高于施氮處理,施氮處理間無顯著差異,添加腐熟劑降低%Ndfs。冬小麥對15N-秸稈氮的當季利用率為7.14%—10.32%,第一茬玉米和第二茬玉米對殘留15N-秸稈的利用率分別為3.75%—5.51%和2.28%—3.18%。三茬后作物對15N-秸稈氮的利用率為13.13%—18.60%,土壤殘留率55.63%—69.16%,損失率17.26%—26.09%。三茬中施氮比不施氮提高15N-秸稈氮的利用率,不同氮肥管理不影響當季利用率和第二茬后效,氮肥減量(80%推薦氮)降低15N-秸稈氮第一茬后效和總利用率,但若配施有機肥則提高利用率。添加腐熟劑提高15N-秸稈氮當季、第一茬玉米和三茬總利用率,降殘留率和損失率。冬小麥和兩茬玉米收獲后土壤礦質氮和微生物量氮含量變化較大,但其來源于15N-秸稈氮的比例都小于3%,施氮處理的影響不明顯,而添加腐熟劑增加冬小麥和第一茬玉米收獲后土壤礦質氮%Ndfs,減少土壤微生物量氮%Ndfs,不影響第二茬玉米收獲后土壤礦質氮和微生物量氮%Ndfs。三茬收獲后殘留的15N-秸稈氮中礦質氮和微生物量氮也小于3%,說明殘留在土壤中的15N-秸稈氮主要以有機態氮存在。【結論】在秸稈還田條件下,采用化肥氮與有機肥氮配施并結合施用秸稈腐熟劑是提高秸稈氮素轉化和有效性的有效措施。
    局部恢復水氮供應對玉米根系氮素吸收與分配的影響
    牛曉麗,胡田田,張富倉,王 麗,劉 杰,馮璞玉,楊碩歡,宋 雪
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2737-2750.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.008
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    【目的】水分或養分脅迫后恢復供應能顯著提高根系吸收能力,且局部水分或氮素供應可以有效刺激供應區根系吸收的補償效應,進一步揭示水氮雙重脅迫后局部恢復供應條件下影響根系氮素吸收能力的因素以及玉米各器官氮素分配狀況有重要意義。【方法】采用分根技術,水培模擬局部根區水氮同時恢復供應,其中以聚乙二醇6000(PEG 6000)模擬營養液的滲透勢,并用相應的供氮水平模擬氮素脅迫。試驗設置4個水氮雙重脅迫(也即4個局部恢復供應)處理:正常供應水氮、輕度水氮脅迫、中度水氮脅迫和重度水氮脅迫。雙重脅迫6 d后一半根區恢復正常供應,于處理后0、1、3、5、7、9 d連續動態監測各根區根系氮素吸收速率、含氮量以及氮素累積量。【結果】水氮雙重脅迫后局部恢復供應,持續脅迫區根系吸收速率、含氮量以及氮素累積量均顯著小于恢復供應區(P<0.05)。1—3 d時,輕度和中度脅迫處理持續脅迫區根系氮素吸收速率比恢復供應區分別減小38.2%和48.7%;7—9 d時分別減小84.9%和86.4%。對于恢復供應區,局部水氮同時恢復供應1 d內,根系氮素吸收速率較前期脅迫明顯增大,且在0—1 d和7—9 d時,經中度及其以下脅迫程度時,根系氮素吸收速率顯著大于對照(P<0.05),產生根系氮素吸收能力的補償效應,但3—7 d 時消失。而且,恢復供應區根系含氮量和氮素累積量分別于1 d和5 d后恢復到對照水平,導致植株氮素生產效率最終與對照無顯著差異。另外,各處理地上部氮素來自15N肥料的分配比例顯著小于對照(P<0.05),且隨脅迫程度而逐漸減小,恢復供應區根系則有相反的規律,持續脅迫區根系表現為,輕度脅迫與對照無明顯差異(P>0.05),中度和重度脅迫顯著大于對照和輕度脅迫(P<0.05),且3—9 d時,中度和重度脅迫間無明顯差異(P>0.05)。【結論】前期中度以下程度(水分−0.4 MPa+氮素1 mmol·L-1)的水氮雙重脅迫后局部恢復供應,恢復供應區根系氮素吸收速率在時間和空間上均可得到恢復,產生根系氮素吸收的部分補償效應,但這種補償效應與恢復供應的時間有關(輕度脅迫為1 d,中度脅迫為7 d);玉米各器官氮素分配比例與脅迫程度和局部恢復供應時間有關。該研究可為調節植物與土壤環境的相互作用,充分挖掘植物自身對環境變化的適應潛力提供理論依據。
    河套灌區春小麥生產水足跡影響因子敏感性及貢獻率分析
    孫世坤,劉文艷,劉 靜,王玉寶,陳帝伊,吳普特
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2751-2762.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.009
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    【目的】農業水資源高效利用是保障國家糧食和水資源安全的重要途徑,作物用水評價是農業用水管理的主要研究課題之一。水足跡為農業用水評價提供了新的指標體系,對作物生產水足跡影響因素進行定量評價有助于進行水足跡調控,實現農業水資源高效利用。【方法】以河套灌區為研究區域,基于水足跡概念體系,利用改進的水足跡量化方法對河套灌區春小麥生產水足跡進行量化并分析其在研究時段內的演變特征;利用單因素輪換(One-At-A-Time,OAT)敏感性分析方法和貢獻率分析方法探究氣候、農業生產投入因子和水資源利用效率對春小麥生產水足跡變化的驅動力。【結果】春小麥生產水足跡在研究時段內呈顯著下降趨勢,從1981年的4.71 m3·kg-1,下降到2010年的1.52 m3·kg-1;同時年際變化呈現出較為明顯的階段性特征,可劃分為波動性下降期(1981—1987年)、快速下降期(1988—1995年)、緩慢下降期(1996—2010年),該變化規律與灌區農業生產和灌溉水平的發展特征基本一致;從水足跡的藍、綠水構成來看,河套灌區春小麥生產水足跡中藍水足跡比例超過90%,而綠水足跡比例不足10%,這與灌區農業生產用水特征相一致。敏感性分析顯示,水足跡對各個因子的敏感性差別十分顯著,日照時數、相對濕度、降水量、灌溉水利用系數和單位面積化肥用量在±20%波動的情況下,春小麥生產水足跡的波動范圍分別為±30%、±24%、±2%、±63%和±4%,春小麥生產水足跡對灌溉水利用系數、日照時數和相對濕度的敏感性較高,對其余影響因子的敏感性較低。貢獻率分析顯示,研究時段內相對濕度的減少和降水量的增加促使春小麥生產水足跡的增加。而日照時數的下降、化肥使用量以及灌區用水效率的提高促使了春小麥生產水足跡的降低。定量分析結果顯示,化肥和灌溉水利用系數對春小麥生產水足跡變化的貢獻率分別為-36.89%和-39.42%,而氣候因子的綜合貢獻率僅為2.80%,對研究時段內春小麥生產水足跡下降貢獻率最大的是灌溉水利用系數,其次為單位面積化肥用量,而相對濕度、日照時數和降水量三者的貢獻率相近,貢獻率最小的是日照時數,這主要是因為日照時數在研究時段內的變率較小。【結論】氣候、農業生產資料投入和水資源利用效率是影響作物生產水足跡的主要因素,就河套灌區而言,農業生產資料投入和水資源利用效率的提高是促使灌區春小麥生產水足跡下降的主要因素,而氣候因子在研究時段內對春小麥生產水足跡的影響較小。該研究結果可為水足跡調控提供理論依據與實踐參考。
    園藝
    CBF冷應答途徑基因在熱處理誘導的香蕉果實抗冷性中的作用
    王海波,李璐,蘇新國,張昭其,龐學群
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2763-2771.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.010
    摘要 ( 231 )   HTML ( 1 )   PDF (789KB) ( 329 )   收藏
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    【目的】探討CBF/DREB(C-repeat binding transcription factor/dehydrate responsive element binding factor)冷應答途徑在熱處理誘導香蕉抗冷性中的作用,為研究香蕉果實中CBF冷應答途徑的信號轉導過程提供參考依據。【方法】從香蕉基因組數據庫(http://banana-hub.southgreen.fr/)中挑選CBF冷應答途徑的7個基因序列,分別設計特異引物,利用實時熒光定量 PCR分析這7個基因在熱處理誘導的香蕉抗冷性中的表達模式。【結果】香蕉果實MaICE在7℃處理1 h時,表達迅速升高并達到最大值,DREB類基因(MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G和MaDREB3)在7℃處理1 h時,均存在一個表達高峰,MaCOR413在7℃下4 h時有一個表達高峰。這些結果表明,香蕉果實中在7℃低溫脅迫下中存在CBF冷應答途徑,即ICE(inducer of CBF expression)-CBF-COR(Cold-regulated genes)通路。香蕉果實CBF冷應答途徑的7個基因表達均在熱處理(52℃,3 min)后0.5 h迅速達到最大值,進一步研究發現,香蕉果實經熱處理后于7℃低溫貯藏5 d時,MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413的表達均強于對照。【結論】7℃低溫脅迫下MaICE、DREB類基因、MaCOR413表達依次增強,說明低溫下香蕉果實中存在CBF冷應答途徑。CBF冷應答途徑相關基因表達增強可能參與了熱處理誘導采后香蕉果實的抗冷性。
    基于SSR標記的255個棗品種親緣關系和群體遺傳結構分析
    劉秀云,李慧,劉志國,趙錦,劉孟軍
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2772-2791.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.011
    摘要 ( 321 )   HTML ( 2 )   PDF (3158KB) ( 574 )   收藏
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    【目的】棗原產中國,種質資源豐富。對來自中國22個省區不同用途的255個棗品種進行SSR分析,揭示這些不同產地來源的棗種質資源之間的親緣關系和群體遺傳結構,為棗種質資源的科學管理和分子標記輔助育種提供參考。【方法】利用改良CTAB提取供試棗種質的基因組DNA,以前期棗基因組測序挖掘出的SSR引物為基礎,進行高效率引物篩選,并利用SSR分子標記技術對255份棗種質資源的基因組DNA進行PCR擴增,然后利用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染后顯色。根據條帶有無統計數據,計算出多態性位點百分率(PIC),用NTSYS軟件進行UPGMA聚類分析;利用Structure軟件分析群體遺傳結構,計算出最適群體數目,構建遺傳結構圖。【結果】從64對SSR引物中篩選出23對高效率SSR引物,在供試材料中共檢測出117個多態性位點,各引物擴增的多態性位點數為2—10條,每對引物平均擴增多態位點數為5.09個,PIC值變幅為0.359—0.727,平均為0.548,這些多態性引物可應用到其他棗種質資源的研究中;建立了只需1—2個標記就可鑒別出來的部分棗品種的SSR指紋,可用于這些品種的快速分子鑒定;255個棗品種的聚類分析將所有棗品種分為15個亞類,包括4個大類和11個小類,不同品種間的相似系數范圍0.71—1.00,其中北京花生棗單獨聚為一類,與其他棗品種關系較遠;‘奉節雞蛋棗’和‘溆浦雞蛋棗’、‘陜西奶棗’和‘天津大馬牙棗’的相似系數均為1.00;結合聚類圖、供試品種的用途和原產地分析,不同棗品種間的親緣關系與品種原產地有一定相關性,但和品種用途沒有顯著相關性。群體結構分析中,通過繪制K與ΔK的關系圖,K=15時,ΔK最大,據此將255個棗品種也同樣劃分為15個群體,與聚類分析結果基本一致;進一步分析表明,各群體中大部分品種血緣關系比較單一,較少品種含有其他類群的遺傳成分。總體看,山西或陜西的棗品種出現在絕大部分居群中,說明這兩個省的資源在不同群體間的基因交流中發揮了重要作用;南方栽培區域中來自湖南的棗品種形成了相對獨立的居群,可能是其起源相對單一,且在長期栽培過程中和其他產地棗品種間基因交流較少所致。上述結果表明,供試棗品種中與來源區域相關性明顯的品種由相同地域內棗品種演化而來,而另一部分與來源產地相關性不明顯的品種則是由不同區域間品種經過頻繁的基因交流和重組選育而來,融合了不同區域品種的特點,從而沒有了明顯的區域特征。【結論】不同地理環境在棗品種的群體進化中發揮了較重要的作用,影響了不同產地間棗種質資源的遺傳結構組成。
    獸醫
    水禽傳染病專題導讀:加強水禽傳染病的防控技術研究和技術儲備
    劉月煥
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2792-2795.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.012
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        中國是世界水禽生產和消費大國,20世紀80年代以來,水禽產業發展速度較快,飼養量平均每年以5%—8%的速度遞增[1],產肉量、產蛋量和產絨量均居世界第一,是中國畜牧業的重要組成部分及農民增收的重要經濟來源之一。截止2014年,中國鴨、鵝存欄量分別為6.56億只和 2.73億只,分別占世界鴨、鵝總存欄量的58%和 83%,占中國家禽存欄量的12%和5%[2]
        隨著產業結構的調整,國內水禽業得到蓬勃發展,但同時由于集約化飼養、飼養水平參差不齊、管理經驗缺乏和防疫技術滯后等原因,舊病如鴨瘟(鴨病毒性腸炎)、小鵝瘟和新發鴨坦布蘇病毒病,鴨呼腸孤病毒病等疫病成為了制約產業健康發展的瓶頸。鴨瘟于1957年在中國首次報道[3],可感染鴨、鵝和其他雁形目禽類,主要造成水禽血管損傷、組織出血、消化道黏膜損傷、淋巴器官受損和實質性器官退行性病變,死亡率高,導致重大經濟損失[4]。小鵝瘟主要感染雛鵝和雛番鴨,被感染的水禽主要表現為精神委頓、食欲廢絕、下痢,有時出現神經癥狀,發病率和死亡率可高達100%。常引起雛鵝大批死亡,對養鵝業的發展影響極大[5]。鴨坦布蘇病毒病于2010年首次在國內發現,造成產蛋鴨產蛋急劇下降,由于繼發感染和飼養管理不當等因素可致死亡率達到15%—20%[6-7]。呼腸孤病毒病多發生于幼齡水禽,以肝臟和脾臟等組織出現壞死性病變為特征。2005年以來,出現了新型鴨呼腸孤病毒,病變又發生了新的變化,肝臟出現不規則塊/斑塊壞死和出血灶[8]
        為減少水禽疫病的危害,了解和掌握病原的生物學特性,快速和準確診斷,提供有效和經濟的免疫接種用疫苗,科研人員在這些方面開展了大量的研究,并取得了一定的成果。本期(49卷14期)刊登的“水禽病研究專題”,收集有7篇論文,3篇與鴨腸炎病毒(duck enteritis virus,DEV)相關,包括重組活載體疫苗的構建和膠體金快速診斷方法的建立;3篇與鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)相關,分別是鴨坦布蘇病毒病卵巢病理變化規律的研究、滅活疫苗母源抗體消長規律的研究,以及1株雞胚致弱疫苗株選育的研究;1篇是鴨呼腸孤病毒(duck reovirus,DRV)人工感染SPF雞胚的病理學研究。雖然研究內容不盡相同,但最終目的都是為有效控制水禽傳染病提供科學依據和理論基礎,為通過疫苗免疫防控水禽疫病做好技術儲備。
        鴨瘟(鴨病毒性腸炎),是鴨、鵝、天鵝的一種急性、熱性、敗血性傳染病,病死率高,對養鴨業危害嚴重。快速診斷是控制鴨瘟的有效措施之一,趙丹丹等[9]研究制備的DPV-gB蛋白單克隆抗體特異、穩定,建立的DPV膠體金檢測技術相比PCR、ELISA、間接免疫熒光技術、微量中和試驗等檢測鴨瘟的方法[10],具有速度快、無需特殊儀器設備、操作簡單等優點,為基層臨床檢測提供了一種快速簡便的方法。目前預防鴨瘟的主要措施為疫苗免疫接種。常用的疫苗有雞胚化弱毒活疫苗和滅活疫苗,活載體疫苗因為具有活疫苗的免疫效力高、成本低及滅活疫苗的安全性好等優點,而備受關注。鴨瘟病毒作為疫苗活載體的研究取得了顯著的進展[11-14]。本專題中,孫瑩等[15]成功構建的表達綠色熒光蛋白重組鴨腸炎病毒,將GFP-gpt表達盒插入到UL2基因,通過重組病毒生物學特性的研究證明UL2基因缺失后不影響DEV的免疫原性,是一個比較穩定的外源基因插入位點,為DEV活載體疫苗研究奠定了基礎。而陳柳等[16]構建了表達鵝細小病毒VP2蛋白的重組鴨瘟病毒,重組病毒細胞生長特性與親本毒株基本一致,且重組病毒在感染細胞中能表達外源蛋白VP2,接種雛番鴨能誘導VP2特異性抗體生成,為研制小鵝瘟-鴨瘟二聯活載體疫苗奠定了基礎。
        鴨坦布蘇病毒病自從2010年流行以來,已經成為中國養鴨業的主要疾病之一。國內多家單位和科研人員[17-23]進行了DTMUV滅活疫苗、弱毒活疫苗和載體疫苗的研究,并取得了良好的進展。鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(HB株)和活疫苗(WF100株)先后獲得國家一類新獸藥注冊證書。本專題中于可響等[24]通過雞胚連續傳代成功獲得了1株安全性高、免疫原性好的鴨坦布蘇病毒雞胚弱化毒株,為鴨坦布蘇病活疫苗的研發奠定了基礎。但不論是滅活疫苗、活疫苗還是基因工程疫苗,都需要建立疫苗的效力檢定方法,其對疫苗質量控制至關重要。林健等[25]通過系統研究DTMUV人工感染產蛋鴨的卵巢病變產生時間、病變檢查內容和判定標準,在利用卵巢病變評價疫苗的效力時,為確定疫苗效力檢驗何時檢查卵巢病理變化和如何判定病變卵巢提供了科學依據。韓春華等[26]通過鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體效力和消長規律的研究,給出了合理的鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗的首免日齡。
    關于在2003年開始流行于中國的鴨呼腸孤病毒,劉曉麗等[27]利用分離的毒株建立了SPF雞胚DRV感染模型,證明其能夠在SPF雞胚中復制增殖,并使雛雞產生明顯的病理變化,對雞場DRV感染的防控提出了積極有效的意見。
        水禽疫病的防控形勢越來越嚴峻,過去認為水禽抵抗力強、疫病少的觀點需要改變。在注重和加強生物安全措施的同時,免疫預防是防控疫病的重要措施,有效的疫苗是關鍵,但目前國內水禽專用疫苗種類有限。部分病原出現變異毒株或新的血清型,致病力改變,臨床癥狀非典型化,原有疫苗的免疫保護效果不佳。還有一些新疫病尚無商品化疫苗可用。因此,加強水禽疫病診斷、防控技術研究和技術儲備,特別是利用生物學技術開發的基因工程疫苗研究,可為有效控制水禽疫病提供科學合理的理論依據和切實可行的實施方案。
    鴨瘟病毒單抗的制備及膠體金試紙條檢測方法的建立
    趙丹丹,楊國平,刁有祥,陳 浩,提金鳳,張 璐,張 英,李川川
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2796-2804.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.013
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    【目的】鴨瘟(DP)是由鴨瘟病毒(DPV)引起的一種急性、敗血性傳染病,以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黃白色潰瘍,頭頸部皮下有黃白色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發生,發病急、死亡快、死亡率高,對養鴨業危害嚴重。快速診斷是控制鴨瘟的重要措施之一,可以及時確定病原,以便采取有效的防制手段。試驗旨在建立鴨瘟病毒(DPV)膠體金快速檢測方法。【方法】利用生物學軟件Protean分析,選擇鴨瘟病毒抗原表位較多的一段序列設計引物,PCR擴增目的基因。連接到載體pMD-18T上,測序正確后再連接到原核表達載體pET-28a上。將獲得的重組質粒轉化至Rosetta感受態細胞中進行誘導表達。表達的蛋白經純化后測其濃度并經Western blotting鑒定分析。以表達的DPV-gB蛋白作為抗原,免疫7周齡BALB/c小鼠,取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,經間接ELISA篩選及亞克隆,獲得DPV-gB特異性單克隆抗體。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,以制備的 H6F6單抗作為標記抗體(標記的最適pH為8.0—8.5,最佳標記濃度為15倍原液稀釋),將純化的A8D7單抗(濃度為2倍原液稀釋)和羊抗鼠IgG(濃度為10倍稀釋)包被在硝酸纖維素膜(NC)上,分別作為檢測線和質控線,經條件優化建立了鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測方法。【結果】共獲得4株能穩定分泌抗DPV-gB蛋白抗體的雜交瘤細胞株,命名為A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。間接ELISA檢測腹水效價分別為1:103、1:103、1:105、1:103。亞類鑒定結果分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,輕鏈均為kappa鏈。Western blotting結果顯示4株單抗均能與DPV-gB蛋白特異性結合。IFA結果顯示制備的4株單抗是針對DPV產生的。建立的膠體金試紙條方法能夠特異性地檢測鴨瘟病毒,與鴨坦布蘇病毒、H9N2亞型禽流感病毒、呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒無反應。陽性尿囊液稀釋50倍后用該試紙條檢測依然為陽性;用不同批次的試紙條重復檢測,結果無差異。利用制備的膠體金試紙條和PCR方法對38份臨床樣品進行檢測比較,結果顯示兩者符合率為91.6 % 。【結論】本研究建立的試紙條檢測方法具有良好的特異性、敏感性、重復性和穩定性,可用于DPV的快速檢測。
    表達綠色熒光蛋白重組鴨腸炎病毒構建
    孫瑩,李俊平,黃小潔,李嶺,曹明慧,李啟紅,李慧姣,楊承槐
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2805-2812.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.014
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    【目的】鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株間存在明顯差異,DEV疫苗株的UL2基因195bp后連續缺失528bp,導致第65位氨基酸后連續缺失176aa[1]。將綠色熒光蛋白(GFP)基因插入DEV UL2基因中,獲得表達綠色熒光蛋白的重組病毒,以研究UL2基因對DEV生物特性的影響和探討DEV作為載體表達外源基因的可行性。【方法】以實驗室保存的DEV細胞適應株DNA為模板,利用PCR技術擴增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T載體;以UL2基因作為外源基因插入靶點及同源重組臂,將CMV啟動子控制的含有GFP-gpt基因表達盒克隆入DEV UL2基因中,構建含GFP基因的轉移質粒載體pT-UL2-GFP-gpt;用脂質體將其與DEV細胞適應株共轉染CEF細胞,待80%細胞出現病變后,凍融3次,接種到新鮮CEF細胞單層的6孔培養板中,用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養液覆蓋,在熒光顯微鏡下挑取單個有綠色熒光的蝕斑,再接到新的細胞上,重復蝕斑篩選、純化表達綠色熒光蛋白的重組病毒;利用PCR、基因測序技術鑒定重組病毒;重組病毒接種CEF(moi=0.01),每12h取出1瓶接毒細胞,分別收集上清和細胞,測量其病毒含量,繪制一步生長曲線;重組病毒在CEF中連續傳代20次,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況,并用PCR檢測GFP的傳代穩定性;重組病毒免疫4周齡SPF鴨后14d,肌肉注射接種DEV強毒(CVCC AV1221),觀察免疫保護情況。【結果】經雙酶切鑒定,成功構建了含綠色熒光蛋白報告基因的轉移質粒載體pT-UL2-GFP-gpt,將其與DEV共轉染CEF細胞后8h,即可見轉染細胞中有帶有綠色熒光的梭形細胞,經過8輪蝕斑篩選,獲得純化的重組病毒rDEV-△UL2-GFP-gptPCR鑒定及基因測序結果顯示,GFP標記基因成功地插入到DEV基因組中,替換了DEV UL2基因的196—723位核苷酸;一步生長曲線結果顯示,重組病毒在細胞和上清中的病毒含量分別在36h和72h達到峰值,為106.2TCID50/0.1mL、105.5TCID50/0.1mL,與親本毒無明顯差異;重組病毒在CEF中連續傳代,1—5代可以穩定表達GFP基因,第6代起,開始出現少量沒有熒光的細胞病變,15—20代中絕大部分細胞病變無綠色熒光,GFP在細胞連續傳代過程中容易出現突變;重組病毒以103.0TCID50/只免疫麻鴨,免疫后14d能完全抵抗DEV強毒株的攻擊,與親本毒免疫原性一致。【結論】成功構建了表達綠色熒光蛋白的DEV,首次證實UL2基因缺失不影響其在細胞中的復制,也不影響其免疫原性,為DEV UL2基因功能、活載體疫苗研究奠定了基礎。
    表達小鵝瘟病毒VP2蛋白重組鴨瘟病毒的構建及其生物學特性
    陳柳,余斌,倪征,華炯鋼,葉偉成,云濤,張存
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2813-2821.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.015
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    【目的】鴨瘟和小鵝瘟是番鴨和鵝的兩種重要傳染病,鴨瘟最主要的防治措施是定期接種鴨瘟病毒減毒活疫苗。根據2012年國際病毒分類委員會(ICTV)的報告,DEV被歸為皰疹病毒科的α皰疹病毒亞科馬立克氏病毒屬。皰疹病毒如偽狂犬病毒、馬立克氏病毒、火雞皰疹病毒等已廣泛用于病毒活載體的研究,而近幾年也有關于鴨瘟病毒(DEV)作為疫苗活載體的報道。為了為免疫防控鴨瘟和小鵝瘟提供新手段,本研究擬在鴨瘟病毒疫苗株感染性克隆的基礎上,構建表達小鵝瘟病毒(GPV)主要免疫原蛋白VP2的重組病毒rDEV-VP2,并研究其生物學特性,進而探討重組病毒rDEV-VP2作為防治DEV和GPV的二聯重組活載體疫苗的可能性。【方法】將密碼子優化的GPV VP2基因通過常規基因克隆的方法插入轉移載體pEP-BGH-end,構建含有GPV VP2表達框pCMV-VP2-BGH-pA的重組表達質粒。在鴨瘟病毒(DEV)疫苗株細菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎上,通過“Red E/T”兩步重組法將GPV VP2基因表達框插入到DEV US7和US8基因之間構建了突變體克隆pDEV-VP2。利用磷酸鈣法轉染雞胚成纖維細胞(CEFs)拯救獲得重組病毒rDEV-VP2和刪除Bac質粒序列的rDEV-VP2-Cre,并對重組病毒細胞體外生長曲線、蝕斑大小和VP2蛋白表達情況進行測定。將rDEV-VP2接種番鴨,在不同時間采集血清,采用間接ELISA法檢測血清中GPV VP2抗體產生情況。【結果】間接免疫熒光檢測和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs細胞成功表達。病毒生長曲線和蝕斑大小測定結果顯示,rDEV-VP2在CEFs細胞上的增殖滴度與親本株相比無顯著差異,表明外源基因VP2的插入不影響rDEV重組病毒的增殖。動物試驗結果表明,7日齡雛番鴨接種rDEV-VP2可以誘導產生針對GPV VP2的抗體,免疫后3周抗體陽性率為50%(4/8)。【結論】本實驗將小鵝瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因組的US7和US8基因間構建了表達該免疫原性基因的重組鴨瘟病毒細菌人工染色體,繼而在雞胚成纖維細胞(CEFs)上拯救獲得了重組病毒rDEV-VP2,病毒細胞生長特性與親本株基本一致,且能誘導鴨體產生GPV VP2特異性的抗體。該研究為研制DEV-GPV二聯重組活載體疫苗奠定了基礎。
    鴨坦布蘇病毒雞胚弱化毒株的選育
    于可響,馬秀麗,袁小遠,劉存霞,胡峰,凌紅麗,李玉峰,黃兵
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2822-2829.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.016
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    【目的】將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株在SPF雞胚上進行連續傳代致弱,旨在選育安全性高、免疫原性好的活疫苗候選毒株。【方法】以SPF雞胚為增殖宿主,將BZ_2010株連續傳代,直至第120代,以1日齡雛鴨和30周齡的產蛋種鴨為試驗對象,對第120代次毒株(命名為VC2)的安全性進行評價;以1d雛鴨為試驗對象,對VC2株的返強情況進行評價;以18周齡的種鴨為試驗對象,對VC2株免疫后的中和抗體進行監測;以25周齡的種鴨為試驗對象,對VC2株免疫后的保護效果進行評價;利用RT-PCR方法分別擴增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因,進行測序分析。【結果】傳代病毒對雞胚的平均死亡時間逐漸縮短,而病毒毒價有逐漸提高的趨勢,ELD50由第20代的10-5.3/0.1mL提高到第120代的10-5.8/0.1mL,而且第80代之前提高較快,后期基本穩定。將VC2株通過頸部皮下接種1d雛鴨和肌肉接種30周齡產蛋種鴨,接種后試驗鴨無異常臨床表現,肝臟也無明顯病理變化,這說明VC2株具有良好的安全性。將VC2在1d雛鴨進行連續5次傳代,未發現試驗鴨有任何異常癥狀,將第5代組織懸液接種1d雛鴨,采集肝臟進行病理切片觀察,發現無明顯病理變化,這說明VC2株具有良好的穩定性。基因測序分析結果顯示,VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸發生改變,而NS4A蛋白只有一個氨基酸發生突變,即第54位氨基酸由F變為L。VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快,第4周即可達到高峰,并且維持較長時間;VC2免疫后于第2周和第50周利用強毒株進行攻毒試驗,結果VC2免疫組在攻毒后未出現異常癥狀,糞便正常,產蛋率保持正常,這說明VC2株免疫可對強毒株的攻擊產生完全保護。【結論】本研究通過雞胚連續傳代成功獲得了一株安全性高、免疫原性好的鴨坦布蘇病毒雞胚弱化毒株。VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快,可維持較長時間。攻毒試驗結果表明,VC2株免疫可對強毒株的攻擊產生完全保護。
    鴨坦布蘇病毒病卵巢病變標準的判定
    林健,楊志遠,何平有,段會娟,鄒立宏,楊保收,趙際成,潘潔,王小蕾,劉立新,劉月煥
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2830-2836.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.017
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    【目的】了解產蛋鴨感染鴨坦布蘇病毒后卵巢病變產生的進程和卵巢病變規律,為采用產蛋鴨卵巢病理變化檢查法進行疫苗效力檢驗提供依據。【方法】70只260日齡產蛋櫻桃谷鴨,以0.5mL/只(含100DID50)的劑量經胸部肌肉接種鴨坦布蘇病毒(HB株)強毒。觀察試驗鴨的臨床癥狀,統計每日產蛋數和采食量。攻毒后2 d,每只鴨經翅靜脈采血,分離血清,經卵黃囊途徑接種5枚6日齡SPF雞胚,每胚0.1mL。接種后置37℃條件下繼續孵化,24 h死亡雞胚棄去。采用RT-PCR方法測定24—72 h死亡雞胚的DTMUV核酸,將1/5或以上雞胚死亡且DTMUV核酸陽性的鴨判為DTMUV感染鴨。攻毒后4—10 d,每日剖殺10只鴨,觀察和分析生殖系統病變。統計病變率,檢查輸卵管內是否有蛋,卵泡是否變形、出血和破裂,依據病變率和病變,確定檢查內容和病變卵巢的判定時間和標準。【結果】(1)攻毒后3、4、5、6 d,鴨幾乎不采食,產蛋數明顯下降。攻毒后7 d,鴨精神狀況好轉;攻毒后8 d,采食量開始回升。(2)70只鴨中,除1只鴨的病毒分離結果為陰性外,其余69只鴨的病毒分離結果均為陽性,病毒分離陽性率為98.6%(69/70)。(3)攻毒后4—10 d,共64只產蛋期鴨的生殖器官可以判定。(4)攻毒后4、5、6、7、8、9和10 d,卵巢病變率分別為66.7%(6/9)、100%(10/10)、100%(10/10)、100%(9/9)、100%(9/9)、100%(9/9)和100%(8/8)。(5)除攻毒后4 d有2只鴨輸卵管中有蛋外,其余62只鴨輸卵管中均無蛋,無蛋率為96.9%(62/64)。(6)攻毒后4—10 d,96.9%(62/64)鴨的卵泡變形,96.9%(62/64)鴨的卵泡出血,95.3%(61/64)鴨的卵泡變形和出血,34.4%(22/64)卵泡破裂。【結論】(1)確定卵巢病理變化檢查時間為攻毒后7—8 d;(2)具有變形或出血病變之一,判病變卵泡。輸卵管內無蛋且有3個及以上病變卵泡,判為病變卵巢。
    鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(HB株)母源抗體的消長規律
    韓春華,趙際成,段會娟,林健,楊志遠,謝佳,潘潔,王小蕾,劉立新,劉月煥
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2837-2843.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.018
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    【目的】評價鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體的效力,制定疫苗的最小免疫日齡。【方法】隨機采集鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(HB株)二免后135日櫻桃谷種鴨的種蛋孵化,隨機取5、7、10和15日齡免疫種鴨后裔雛鴨10只和相對應日齡非免疫種鴨后裔雛鴨5只,采血,分離血清,測定母源抗體,并以0.1mL/羽(含100DID50)的劑量經腿部肌肉攻毒。觀察雛鴨攻毒后的臨床表現(采食量、糞便、精神和死亡情況),觀察至攻毒后10d。攻毒后2d經頸靜脈采血,分離血清進行病毒分離。每份血清接種5枚6日齡SPF雞胚,0.1mL/枚,37℃孵化,24h以內死亡雞胚視為非特異死亡,孵化至168h。只要有1枚及以上雞胚死亡則判該鴨感染。計算母源抗體雛鴨組的攻毒保護率和無母源抗體組的發病率。攻毒后5d,分別稱量雛鴨的體重,計算平均日增重。對成對樣本進行T檢驗,分析母源抗體對雛鴨增重的影響。通過試驗鴨中和抗體、增重變化和病毒分離的方法評價母源抗體的效力。【結果】(1)1日齡雛鴨的母源抗體陽性率最高,1、5、7、10和15日齡雛鴨的母源抗體陽性率分別為56.1%(37/66)、40%(4/10)、50%(5/10)、30%(3/10)和0%(0/10),5—7日齡抗體陽性率處于平臺期,15日齡時母源抗體降低至全陰性;(2)攻毒后對照鴨表現精神沉郁(20/20)、仰翻和側翻等神經癥狀(6/20)及死亡(2/20),有母源抗體的雛鴨臨床癥狀明顯輕于對照組。(3)5、7、10和15日齡免疫種蛋孵化雛鴨攻毒后5d平均增重115.5、142.8、177.8和162.2g。5、7、10和15日齡非免疫種蛋孵化雛鴨攻毒后5d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g。(4)5、7、10和15日齡免疫種蛋孵化雛鴨的攻毒保護率分別為50%(5/10)、60%(6/10)、20%(2/10)和0%(0/10); 5、7、10和15日齡非免疫種蛋孵化雛鴨的發病率均為100%。(5)5和7日齡雛鴨平均增重和攻毒保護率最高,分別為50%(5/10)和60%(6/10),10和15日齡雛鴨的母源抗體盡管低(20%和0%)或陰性,仍然有明顯的保護作用。【結論】(1)鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體能夠保護10日齡內雛鴨;(2)疫苗首次免疫的時間以7—10日齡為最佳。
    鴨呼腸孤病毒人工感染SPF雞胚的病理學研究
    劉曉麗,劉婷,劉波,程國富,谷長勤,張萬坡,胡薛英
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2844-2849.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.019
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    【目的】前人研究表明禽呼腸孤病毒可以經卵垂直傳播, 禽呼腸孤病毒能引起雛禽的病毒性關節炎、呼吸道和腸道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以實驗室分離的鴨呼腸孤病毒HP080421株為研究對象,該毒株引起病變主要以鴨軟腳為主要臨床特征,病鴨肝臟和脾臟表面有大量的白色壞死灶、腎臟腫大、出血為主要病變特點。研究了鴨呼腸孤病毒對雞胚的致病性,通過雛雞的病理變化特點,探討所分離的HP080421鴨呼腸孤病毒株是否也可感染雞群,旨在為雞場鴨呼腸孤病毒感染的防控提供理論依據。【方法】運用華中農業大學獸醫病理學實驗室分離鑒定的HP080421株鴨呼腸孤病毒通過尿囊腔接種SPF雞胚,建立SPF雞胚鴨呼腸孤病毒感染模型,培養雞胚至雛雞出殼,運用臨床觀察、病理剖檢、H.E染色和免疫組織化學染色等病理組織學檢查方法,對鴨呼腸孤病毒感染SPF雞胚進行病理學研究和致病性分析。【結果】研究發現病毒感染雞胚孵化培養至22—23日齡均啄殼,但不能自主出殼,需人工剝殼。病理剖檢可見雛雞的肝臟、脾臟腫脹質脆,表面及實質分布有黃白色壞死灶;腦部組織腫脹,并可見出血點和出血斑。H.E染色的組織病理學觀察可見接毒組雛雞肝臟、脾臟的壞死灶周圍有大量淋巴細胞浸潤;法氏囊的濾泡髓質部和胸腺的髓質部淋巴細胞減少、缺失;腦、肺臟、腎臟存在不同程度的淤血、出血和水腫;免疫組織化學染色結果表明:病毒陽性信號主要分布于肝臟、脾臟、肺臟和法氏囊等器官,并且位于上皮細胞和巨噬細胞的細胞質和胞核內。【結論】鴨呼腸孤病毒株HP080421 能夠在SPF雞胚中復制增殖,并使雛雞主要器官發生明顯的病理變化,病理變化主要集中在肝臟和淋巴器官,因此鴨呼腸孤病毒可通過垂直傳播感染雞群,還可導致雛雞免疫抑制。本研究通過SPF雞胚鴨呼腸孤病毒感染模型,闡述了鴨呼腸孤病毒感染雞群的可能性,因此在實際養殖過程中,養殖戶要防止鴨呼腸孤病毒對雞胚的污染,切斷傳播途徑,以達到預防雞群感染鴨呼腸孤病毒的目的。
    研究簡報
    不同番茄品種對番茄黃化曲葉病毒的抗病性分析
    田兆豐,劉偉成,厚凌宇,謝華,羅晨,柴敏
    中國農業科學. 2016, 49(14):  2850-2856.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.020
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    【目的】番茄黃化曲葉病毒病 (Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV) 是一種影響全世界番茄生產的病害,培育抗病品種是最有效、經濟和持久的防控手段。目前生產上應用的抗病品種繁多,但存在對TYLVC不同抗性基因的抗性水平研究甚少、了解不夠全面的問題。為了解帶有不同抗性基因的番茄品種對番茄黃化曲葉病毒病的抗性,對北京市農林科學院蔬菜中心培育的番茄品種抗病性進行檢測,并利用半定量RT-PCR方法分析抗病基因和抗病蛋白的表達水平。【方法】選取攜帶有Ty3a/Ty3a的番茄材料秋光285(Ty3a 純合)、棚137×246(Ty3a 雜合),攜帶Ty1+Ty3a純合的秋光120、攜帶Ty1+Ty3a雜合的秋光81和感病對照M82為試驗材料,觀察番茄植株自然條件下發病情況。通過調查發病率和病情指數,考查這些番茄品種的抗病性,并利用RT-PCR方法分析抗病基因Ty1Ty3a以及病程相關蛋白葡聚糖酶和幾丁質酶基因的表達水平。【結果】攜帶抗性基因的雜合體、純合體抗病性差異不明顯,含有兩個抗性基因和含有單一抗病基因品種的抗病性稍有差異,但差異不顯著。半定量RT-PCR結果顯示不同番茄品種在感染TYLCV后,體內抗性基因表達量隨著發病時間的增加,Ty-3aTy-1的表達量逐漸增強。Ty-3a在4個番茄品種中表達水平由弱到強依次為秋光285(Ty-3a純合)、棚137×246(Ty-3a雜合)、秋光120(Ty-1+Ty-3a純合)和秋光81(Ty-1+Ty-3a雜合),Ty-1在秋光81中的表達顯著高于在秋光120中的表達。同時,植株體內葡聚糖酶和幾丁質酶基因表達量均比對照顯著增加,并隨著發病時間的增加逐漸增強。在發病20 d和30 d后,攜帶Ty-1+Ty-3a雜合的秋光81的葡聚糖酶基因表達顯著強于其他幾個品種。【結論】幾個番茄材料對TYLCV的抗性由弱到強依次為秋光285(Ty3a 純合)、棚137×246(Ty3a雜合)、秋光120(Ty1+Ty3a純合)和秋光81(Ty1+Ty3a雜合)。不同番茄抗病品種感染TYLCV后,體內抗性基因表達量隨發病時間增加而增強,葡聚糖酶和幾丁質酶基因表達量均比感病對照顯著增加,表明番茄抗病品種在感染TYLCV后的抗病性除了與抗性基因的表達有關外,同時也與抗病相關蛋白表達增強有關。
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