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當期目錄

    2017年 第50卷 第7期 刊出日期:2017-04-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    玉米主要植株性狀的雜種優勢位點分析
    劉曉陽,衛曉軼,陳浩,劉坤,謝惠玲,郭戰勇,付志遠,李衛華
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1179-1188.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.001
    摘要 ( 367 )   HTML ( 4 )   PDF (371KB) ( 713 )   收藏
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    【目的】鑒定玉米株高等植株性狀的雜種優勢位點為優良玉米新品種選育提供重要的理論依據。【方法】利用一套以綜3為供體,許178為受體的單片段代換系群體及其與輪回親本許178的測交群體,于2014年在河南浚縣、新鄉、長葛3個試點進行田間鑒定,完全隨機區組設計,3次重復,散粉后對株高、穗位高、葉片數進行測定。利用Duncan’s多重比較和t測驗分別對玉米株高、穗位高和葉片數進行QTL分析和雜種優勢位點分析。【結果】單片段代換系的測交群體在主要植株性狀上均表現出一定的雜種優勢,其中,株高在浚縣、新鄉和許昌點的中親優勢值分別為4.74%、3.61%和1.09%,穗位高的中親優勢值分別為6.06%、7.77%和7.51%,葉片數的中親優勢相對較小。利用SSSL群體在3個環境中定位了9個株高的QTL、10個穗位高的QTL、5個葉片數的QTL。利用測交群體定位了6個株高的雜種優勢位點,其中3個HL同時被檢測到;穗位高檢測到8個雜種優勢位點,有1個HL被同時檢測到;葉片數定位了5個雜種優勢位點,有1個HL被同時檢測到。利用SSSL及其測交群體分別檢測到3個植株性狀的24個QTL和19個HL,在5個單片段代換系同時檢測到同一性狀的QTL和HL。【結論】株高、穗位高和葉片數的雜種優勢在單片段代換系測交群體中呈:株高>穗位高>葉片數。定位到的QTL和HL中的一些在不同環境間存在保守性,且具有較大貢獻率,這些主效QTL/HL所在的染色體區域可能存在調控所對應性狀的主要基因,可作為進一步研究的依據。而且,少數染色體片段同時調控多個性狀的雜種優勢,表明所測性狀間存在相關性。此外,定位到的株高、穗位高多數HL表現出超顯性效應,而多數總葉片數相關的HL顯示出顯性效應,表明所測性狀雜種優勢主要來源于位點間的超顯性效應。所測的3個性狀間存在相關性,3個性狀間平衡是遺傳改良的重要目標。在育種實踐中,上述主效QTL和HL可通過分子標記輔助選擇,應用于理想株型育種,加快3個性狀間協同改良進程。
    油菜耐鹽相關性狀的全基因組關聯分析及其候選基因預測
    賀亞軍,吳道明,游婧璨,錢偉
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1189-1201.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.002
    摘要 ( 397 )   HTML ( 7 )   PDF (1163KB) ( 912 )   收藏
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    【目的】通過對甘藍型油菜耐鹽相關性狀進行全基因組關聯分析,尋找可能與油菜耐鹽性相關的SNP位點,發掘與油菜耐鹽性有關的候選基因。【方法】以1.2%NaCl溶液作為培養液,去離子水為對照,對307個不同品系的甘藍型油菜進行發芽試驗。播種后7 d測定幼苗根長、鮮重及發芽率,計算鹽脅迫下各性狀相對值,并作為評價耐鹽的指標。結合油菜60K SNP芯片,利用SPAGeDi v1.4軟件對該群體307份甘藍型油菜進行親緣關系分析,并計算親緣關系值的矩陣。利用軟件STRUCTURE v2.3.4對關聯群體進行了群體結構分析。為有效排除假關聯的影響,將群體結構和材料間的親緣關系考慮進關聯分析中,同時進行了PCA+K模型、Q+K模型以及K模型3種混合線性模型分析和比較,根據所有SNP的–lg(P)觀察值和期望值,確定每個性狀GWAS分析的最優模型。采用TASSEL 5.0軟件,在最優模型下對307份材料耐鹽各性狀的相對值分別與SNP標記進行全基因組關聯分析。利用油菜基因組數據庫,在顯著SNP位點側翼序列200 kb范圍內提取基因。根據擬南芥中已經明確功能的耐鹽相關基因,篩選出目標基因組區段內與耐鹽相關的油菜同源基因。【結果】全基因組關聯分析共檢測到164個與根長顯著關聯的SNP位點,23個與鮮重顯著關聯的SNP位點,38個與發芽率顯著關聯的SNP位點。其中與根長、鮮重、發芽率最顯著關聯的SNP位點分別位于染色體A08、A02和A06,貢獻率分別為23.84%、18.59%和31.81%。在這些顯著SNP位點側翼序列200 kb范圍內發掘出可能與油菜耐鹽性有關的50個候選基因。這些候選基因主要包括轉錄因子MYB、WRKY、ABI1、bZIP、ERF1、CZF1、XERICO等以及一些下游受轉錄因子調控的不同功能基因NHX1、PTR3、CAT1、HKT、CAX1、ACER、STH、STO等。在根長和發芽率2個不同耐鹽性狀的分析結果中均篩選出位于A03染色體上的耐鹽基因BnaA03g14410D。另外,這些耐鹽候選基因中包含兩組串聯重復基因,分別是位于A03染色體上的BnaA03g18900D和BnaA03g18910D,位于C09染色體上的BnaC09g19080D、BnaC09g19090D和BnaC09g19100D。除此之外,耐鹽候選基因中還包含2個距離非常近(中間只間隔2個基因)的重復基因BnaC02g39600D和BnaC02g39630D。【結論】共檢測到225個與耐鹽性狀顯著關聯的SNP位點,篩選出50個可能與油菜耐鹽性有關的候選基因。
    不同抗倒伏能力甜蕎品種莖稈木質素及其單體合成特征
    佘恒志,聶姣,李英雙,劉星貝,胡丹,馬珊,次仁卓嘎,汪燦,吳東倩,阮仁武,易澤林
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1202-1209.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.003
    摘要 ( 203 )   HTML ( 5 )   PDF (957KB) ( 596 )   收藏
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    【目的】研究不同抗倒伏能力甜蕎品種在不同生育時期莖稈木質素、總木質素單體及G型、S型和H型木質素單體含量的變化,探討甜蕎莖稈木質素及其單體合成特征。【方法】選用酉蕎2號(高抗倒伏、YQ2)、信農1號(中抗倒伏、XN1)和烏克蘭大粒蕎(易倒伏、UD)為試驗材料,試驗采用隨機區組設計,3次重復。分別于分枝期、盛花期和乳熟期測定其莖稈抗折力、倒伏指數、木質素含量(溴乙酰法)、總木質素單體及S型、G型和H型木質素單體含量(GC-MS法)。【結果】相同生育時期,與XN1和UD相比,YQ2莖稈抗折力大、倒伏指數小;分枝期到乳熟期,莖稈抗折力先增大后減小,在盛花期達到最大值;倒伏指數的變化存在品種差異,分枝期到乳熟期,YQ2和UD倒伏指數先增大后減小,盛花期達到最大值,XN1倒伏指數逐漸增加,乳熟期達到最大值。莖稈木質素和木質素單體含量從分枝期到乳熟期逐漸增加,YQ2木質素和木質素單體含量高于XN1和UD;在相同生育時期,S型木質素單體含量均最高,G型木質素單體次之,H型木質素單體含量均最低;分枝期到乳熟期,S和G型木質素單體含量逐漸增加,H型木質素單體逐漸降低。隨著生育時期,S/G(S型木質素單體含量/G型木質素單體含量)的比率逐漸降低,G型木質素單體占總木質素單體的比例逐漸升高。【結論】甜蕎莖稈木質素單體主要為S-G型。高抗倒伏品種木質素及其單體的合成特征表現為:各生育時期木質素、總木質素單體、G型、S型和H型木質素單體含量高于中抗倒伏和易倒伏品種;分枝期大量積累S型木質素單體,分枝期到乳熟期主要積累G型木質素單體。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    耕地集約化評價指標體系與評價方法研究進展
    石淑芹,曹玉青,吳文斌,楊鵬,蔡為民,陳佑啟
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1210-1222.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.004
    摘要 ( 199 )   HTML ( 1 )   PDF (584KB) ( 441 )   收藏
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    耕地集約化是社會經濟發展、土地面積約束、人口增長與技術進步等壓力作用下人類土地利用的必然選擇。作者在論文中從耕地集約化、農業可持續利用、生態保護及糧食安全的互動框架切入,對現有耕地集約化評價指標體系進行了系統梳理,構建了基于互動框架的耕地集約化評價指標體系,并對現有技術、方法及相關成果分別評述,提出了下一步的研究要點及發展方向。研究認為耕地集約化、農業可持續、生態環境及糧食安全之間主要存在正負雙重及互相促進作用。目前評價指標體系主要從頻度、投入、產出、潛力、增產、綜合指標體系、集約度及能值等多個方面考慮。基于互動框架的耕地集約化評價指標體系包括地均勞動力投入、地均化肥、農藥投入及灌溉指數等基本指標,糧食安全系數、非農指數和人均耕地面積等表征農業可持續的指標,地下水礦化度、生物多樣性和碳排放等影響生態保護的指標,以及復種指數、穩產指數、糧食單產和地均產值等與糧食安全密切的指標;具體評價時還需依據不同研究區、研究尺度進行針對性選擇和修訂。研究方法中,頻度指標是遙感技術在耕地集約化領域的重點關注熱點之一;潛力指標以模型模擬為主;增產指標中,產量差研究成果豐富,收獲面積差所受關注較少;集約度綜合測度模型也是較為常用的方法。此外,還可引入其他相關成果開展評價。今后耕地集約化指標類型呈多樣化態勢,需推動新方法與新技術手段的綜合集成。
    不同銨硝配比條件下BPDS-Fe(Ⅱ)對玉米幼苗耐低鐵脅迫差異的影響
    徐健欽,陳旭蕾,于福同
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1223-1233.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.005
    摘要 ( 145 )   HTML ( 1 )   PDF (1474KB) ( 259 )   收藏
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    【目的】作物生產中缺鐵問題十分普遍,篩選耐低鐵品種具有重要意義。文中采用BPDS(4,7-diphenyl- l,10-phenanthroline disulfonic acid)專性螯合Fe(Ⅱ),探究BPDS-Fe(Ⅱ)對2種玉米自交系表型特征與生理特性的影響,旨在解析2個自交系耐低鐵脅迫差異及其可能機制,為篩選耐低鐵品種提供理論依據。【方法】選用2個玉米自交系Wu312與Ye478,以銨硝比1﹕1與1﹕7為供氮條件,分別設置14與10個不同的BPDS-Fe(Ⅱ)濃度,觀察植株表型特征,測定葉片SPAD值、地上部與根系干物重、根冠比,測定地上部鐵、錳、銅、鋅濃度以及新葉活性鐵濃度。利用SPAD-502 plus葉綠素儀測定新葉SPAD值;將烘干樣品剪碎后,用HNO3-H2O2溶液消煮,經密閉微波消煮后,用ICP-AES測定消煮液中的微量元素;取新葉尖端剪碎,稱2.00 g鮮樣,按照1﹕10比例加入1 mol·L-1鹽酸,震蕩5 h后過濾,用ICP-AES進行測定。【結果】在銨硝比1﹕1的供氮條件下,根系產生根系分泌物,根際pH在24 h內從6.0顯著下降至約4.0;與對照處理(不供鐵)相比,當BPDS-Fe(Ⅱ)濃度為40 μmol·L-1時,Wu312的地上部干物重顯著下降了31%,Ye478則顯著下降了64%;Wu312根系干物重無顯著變化,但Ye478顯著下降了63%;二者的根冠比均已超出正常范圍(正常值:0.20—0.28),地上部與根系生長受到抑制。調整銨硝比為1﹕7后,當BPDS-Fe(Ⅱ)濃度為40 μmol·L-1時,Wu312地上部干物重是對照幼苗的8倍,Ye478則接近10倍,植株生長恢復正常;Ye478的葉片SPAD值、地上部與根系干物重、新葉活性鐵濃度均顯著高于Wu312,表現出生長與保綠性方面的顯著優勢;當BPDS-Fe(Ⅱ)濃度為0.1 μmol·L-1時,Wu312被競爭致死,無法發育出第五片葉,Ye478仍能維持生長,發育至第五片葉,葉片返綠明顯;地上部鐵濃度在不同自交系間無顯著差異;植株地上部鐵含量與錳、銅、鋅濃度呈顯著負相關。【結論】降低NH4+-N的供應比例有利于改善根際pH,減少根系分泌物;Ye478為耐低鐵品系,Wu312為鐵敏感品系;Ye478與Wu312在0.1 μmol·L-1濃度條件下表型出現最顯著差異;地上部與根系生物量、葉片SPAD值是表征玉米幼苗耐低鐵脅迫差異的最佳指標,根冠比以及新葉活性鐵濃度是良好指標;玉米幼苗耐低鐵脅迫的可能機制包括根系分泌質子,地上部將光合作用產物優先分配給根系,以及鐵在植物體內的轉運與再分配。
    植物保護
    玉米大斑病菌分生孢子形成的影響因素及GATA 轉錄因子家族的表達分析
    馮勝澤,劉星晨,王海祥,趙潔,趙立卿,鄭亞男,鞏校東,韓建民,谷守芹,董金皋
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1234-1241.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.006
    摘要 ( 176 )   HTML ( 1 )   PDF (433KB) ( 526 )   收藏
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    【目的】玉米大斑病(northern leaf blight of corn)是由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的一種威脅玉米生產的重要葉部病害。本研究旨在確定影響玉米大斑病菌分生孢子產量的主要因素;明確GATA家族成員基因在分生孢子形成時期的表達特征,為深入解析調控病菌發育及致病的分子機制打下基礎。【方法】以玉米大斑病菌野生型菌株01-23為試材,探索13種不同培養基(乳糖酪蛋白瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、玉米莖稈葡萄糖瓊脂培養基、玉米莖稈瓊脂培養基、玉米葉片葡萄糖瓊脂培養基、玉米葉片瓊脂培養基、玉米籽粒葡萄糖瓊脂培養基、玉米籽粒瓊脂培養基、玉米粉葡萄糖瓊脂培養基、玉米粉瓊脂培養基、查氏培養基、基本培養基、水瓊脂培養基)、5種碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖)、以乳糖酪蛋白瓊脂培養基為基礎培養基,以5 g·L-1的量分別添加不同的氮源(牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、KNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3)、pH(4、5、6、7、8、9)、溫度(15、20、25、30、35℃)及光照強度(1 500、3 000、6 000、9 000 lx)等條件對分生孢子產量的影響;進一步利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術,分析病菌菌絲形成時期和分生孢子形成時期GATA家族5個成員基因的表達量。【結果】利用單因素分析法確定了影響玉米大斑病菌分生孢子產量的主要因素,發現產孢量最大的培養條件為玉米葉片葡萄糖瓊脂培養基,碳源為乳糖,培養溫度為25℃,pH 8,光照條件為光暗交替各12 h,光照強度為6 000 lx。另外,還發現在培養基中添加KNO3可顯著提高分生孢子產量。對GATA家族5個基因的相對表達水平分析表明,與菌絲時期相比,在分生孢子形成時期GATA2的表達量明顯上調,其他基因(GATA1GATA3GATA4GATA5)表達量均顯著下調。【結論】利用單因素分析法確定了影響玉米大斑病菌分生孢子產量的最佳培養條件;根據GATA家族5個基因相對表達分析結果,推測GATA2可能參與了玉米大斑病菌的分生孢子形成。
    番茄抗性相關基因SlHin1的克隆、表達與抗病毒功能
    彭浩然,潘琪,魏周玲,蒲運丹,張永至,吳根土,青玲,孫現超
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1242-1251.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.007
    摘要 ( 192 )   HTML ( 1 )   PDF (2479KB) ( 416 )   收藏
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    【目的】克隆番茄抗性相關基因SlHin1(harpin-induced gene 1),分析其生物信息學特征、組織表達和亞細胞定位情況,研究其在抗煙草花葉病毒侵染、移動中的作用,為番茄抗性育種提供理論依據。【方法】通過RT-PCR及基因克隆方法,從番茄總RNA中克隆得到基因SlHin1;應用生物信息學方法分析其DNA序列及其編碼的蛋白序列特性,使用MEGA6.0對SlHIN1氨基酸序列及其同源序列進行多序列比對,并構建同源物種間系統進化樹;將該基因片段通過Sal I和Bam HI雙酶切連接至熒光表達載體pCV-mGFP-C1,采用GFP標記的方法進行亞細胞定位檢測,分析編碼蛋白表達位置;利用實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析該基因在番茄不同組織的表達量水平;將該基因片段通過Nco I和Bam HI通過雙酶切連接至植物表達載體pFGC5941,用土壤農桿菌EHA105瞬時過表達該基因并接種標記有綠色熒光的煙草花葉病毒侵染性克隆,以檢測植株對病毒的抗性變化,間接ELISA法檢測病毒的含量,探究該基因的抗病毒功能。Western blot驗證SlHIN1蛋白在本氏煙內的表達情況。【結果】利用RT-PCR方法從番茄材料(Solanum lycopersicon cv. Ailsa Craig)的葉片組織中克隆得到全長為675 bp的番茄抗性相關基因SlHin1,將序列分別提交至GenBank,得到序列號KU195820。序列比對及生物信息學分析表明,其基因預測編碼225個氨基酸,分子量為26.1 kD,理論等電點為9.35,結構上具有LEA-14保守結構域,不具有跨膜區段,并且位于番茄基因組10號染色體上(Solyc10g081980);多序列比對及進化樹分析表明,該基因編碼的蛋白與茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0%以上而與水稻、高粱單子葉植物的親緣關系較遠;亞細胞定位顯示定位在細胞膜上與PSORT Prediction預測的亞細胞定位最高概率一致;qRT-PCR結果分析表明該基因具有組織特異性,表達量在根、葉、莖間依次降低;在本氏煙中瞬時過表達SlHIN1并在表達部位接種標記有綠色熒光的煙草花葉病毒侵染性克隆,處理組本氏煙在接種病毒4 d后沒有任何熒光出現,而對照組出現綠色熒光。隨著接種時間推移,接種7 d后處理組葉片上零星熒光有略微的擴大,而對照組的綠色熒光已經擴散至心葉。間接ELISA檢測病毒含量較對照組少,處理組的病毒擴散受到抑制。Western blot分析結果表明,顯色后的硝酸纖維素膜上約在26 kD處有一特異條帶,而空載體的對照無相應條帶,說明SlHIN1蛋白在注射部位成功表達。【結論】Hin1在供試科植物中均存在,其中SlHin1定位在細胞膜,過表達該基因可抑制病毒擴散,推測其可能參與茄科植物對煙草花葉病毒的抗性反應,使植株獲得抗性。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    東北黑土區旱田改稻田后土壤有機碳、全氮的變化特征
    賈樹海,張佳楠,張玉玲,黨秀麗,范慶鋒,王展,虞娜,鄒洪濤,張玉龍
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1252-1262.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.008
    摘要 ( 219 )   HTML ( 1 )   PDF (397KB) ( 376 )   收藏
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    【目的】分析東北黑土區旱田改稻田后土壤有機碳、全氮含量及其密度和13C、15N自然豐度值的動態變化,探討旱田改稻田后土壤有機碳(氮)的固定能力及其穩定性,揭示旱田改稻田后土壤有機碳(氮)的演變規律,為東北黑土的合理利用和培肥提供理論依據。【方法】結合野外實地調查,選擇典型黑土區旱田土壤(種植大豆年限大于60年)和改種不同年限的稻田土壤(3、5、10、17、20和25年,旱田改稻田前種植歷史基本相同,均為大豆),利用穩定同位素分析技術,研究旱田改稻田后土壤有機碳、全氮的動態變化特征。【結果】旱田改稻田25年間,在0—60 cm土層,土壤有機碳和全氮含量的變化趨勢均表現為:在改種的前3年迅速下降,降幅分別為13.60%—43.27%和10.40%—40.60%,在3—25年間隨改種年限延長呈逐漸增加的趨勢,且在20—60 cm土層出現累積,但在3—5年期間增加幅度較大,在5—25年期間增加較為緩慢,在改種17—25年期間,稻田土壤有機碳和全氮含量均高于旱田土壤;0—60 cm土層土壤有機碳和全氮密度的變化趨勢與其含量的變化趨勢大致相同,在改種的3年間0—60 cm土層土壤有機碳和全氮密度分別降低了26.53%和21.89%,在改種5—25年間0—60 cm土層稻田土壤有機碳和全氮密度均大于旱田土壤,增幅分別為9.87%—21.48%和10.2%—19.3%;旱田改稻田后,土壤全氮與有機碳的變化密切相關,土壤全氮與有機碳的含量、密度之間均呈顯著線性正相關關系(P<0.01)。在0—60 cm土層,土壤δ13C值在改種的3年間明顯上升,在3—25年間隨改種年限延長呈逐漸下降趨勢,且大于5年的稻田土壤δ13C值均低于旱田土壤,而土壤δ15N值在改種的25年間隨改種年限延長呈逐年下降趨勢,各年限稻田土壤δ15N值均低于旱田土壤,相同年限土壤的δ13C值和δ15N值均隨著土層加深而增大;0—40 cm土層土壤δ13C值與土壤有機碳含量之間呈顯著線性負相關關系(P<0.01),但各土層土壤δ15N值與土壤全氮含量之間則無顯著相關性。【結論】東北黑土區旱田改稻田大于5年后,稻田土壤具有明顯的固碳(氮)能力,穩定性碳(氮)在20—60 cm土層累積;改種稻田年限小于5年,應注重有機碳(氮)的補充,以維持和提高土壤有機碳(氮)水平。
    基于根微形態測定土壤Zn對大麥的毒性閾值及其預測模型
    何俊,田昕竹,王學東,劉彬,李寧,鄭涵,孟楠,陳世寶
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1263-1270.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.009
    摘要 ( 144 )   HTML ( 8 )   PDF (488KB) ( 214 )   收藏
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    目的】隨著對污染土壤管理要求的不斷提高,受污染土壤生態風險評價的內容也在不斷深入。目前,污染土壤風險評價毒性測試逐漸由單物種測試為基礎的生態風險評價發展為基于物種敏感性分布的區域種群毒性測試;毒性中除了要包含測試物種的整個生命周期,還需要增加不同敏感的測試終點。基于不同測試終點的毒理學數據對于評價污染土壤中Zn的環境風險具有重要意義。根系生態是基于生態效應法推導土壤中重金屬生態風險閾值的重要組成部分,論文中以大麥根尖數、總根長、根表面積和根平均直徑為評價終點,研究污染土壤中Zn對大麥根微形態的毒性閾值及其與土壤性質間的量化關系,以期為中國Zn污染土壤的環境風險評價提供科學依據。【方法】采集了8種不同性質的農田土壤,外源添加不同濃度Zn后進行盆栽試驗,利用STD1600 Epson根系掃描儀測定不同根微形態指標,結合Log-logistic劑量-效應曲線測定基于不同根微形態為終點的毒性閾值(EC10,EC50),建立基于土壤性質的Zn毒性預測模型。【結果】土壤Zn污染對不同根微形態指標的毒性閾值存在較大差異,基于大麥根尖數、總根長、根表面積和根平均直徑的有機碳(EC10)和陽離子交換量EC50均值分別為228、295、335、261 mg·kg-1702、779、837、739 mg·kg-1,以根尖數測定的EC值最低,根表面積的EC值最高,即根尖數指標對土壤Zn毒性最敏感。不同土壤中,EC10值的變異系數(34.1%)大于EC50(21.6%),而4種不同測試指標中,基于大麥根表面積測定的變異系數最大,EC10和EC50的變異系數分別達到43.4%和23.2%。土壤pH、有機碳(OC)、陽離子交換量(CEC)與Zn的毒性閾值ECxx=10,50)呈正相關關系,其中pH的相關系數達到極顯著水平(P<0.01)。【結論】不同的根微形態指標中,土壤Zn污染對大麥根尖的毒性最敏感;基于pH、CEC、OC的預測模型可以很好地預測土壤中Zn的大麥毒性閾值。
    大豆連作條件下施肥對東北黑土細菌群落的影響
    高圣超,關大偉,馬鳴超,張偉,李俊,沈德龍
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1271-1281.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.010
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    【目的】表征大豆連作條件下不同施肥處理土壤細菌的群落結構特征和組成差異,并側重分析接種根瘤菌處理的不同之處;與土壤化學性質進行關聯分析,探討引起黑土細菌菌群變化的主效環境因子,為進一步了解連作條件下東北耕地土壤中細菌群落結構的變化以及大豆的高效種植和氮肥減施提供理論支持。【方法】依托5年大豆連作定位試驗,選取不施肥(CK)、磷鉀肥(PK)、氮磷鉀肥(NPK)、磷鉀肥+接種根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum 5821)處理(PK+5821)共4個處理的耕層土壤為研究對象,采用高通量測序(Illumina HiSeq)和real-time PCR技術,以16S rRNA基因V4區為分子標靶,解析不同施肥處理土壤細菌的菌群變化,并對細菌群落結構與環境因子進行相關性分析。【結果】與CK相比,施肥明顯增加了大豆的產量和土壤養分的含量,但單施化肥降低了土壤的pH。接種B. japonicum 5821顯著增加了土壤細菌的基因拷貝數,提高了土壤細菌的豐度。細菌門水平和綱水平的群落分析發現,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)為土壤中的3大優勢菌群,占所有優勢菌門的70%以上;施肥明顯降低了土壤中放線菌門的相對豐度,這與細菌綱水平的分析一致。多樣性分析發現,CK處理與3個施肥處理的豐富度和多樣性指數不同,且主坐標分析(PCoA)顯示,3個施肥處理的細菌群落結構在PC1軸上聚在一起,而與CK處理是分開的,表明施肥明顯改變了土壤細菌的群落構成。冗余分析(RDA)顯示,全氮(F=3.2,P=0.002)對土壤細菌群落結構的影響最大,解釋了24%的群落變化,各因子的貢獻率依次為全氮>有效磷>速效鉀>有機質>pH;Spearman相關性分析也表明,5項土壤化學指標均與不同優勢菌門存在密切的相關關系。【結論】施肥改變了大豆連作條件下土壤細菌的群落結構。全氮是影響土壤細菌群落結構變化的主效環境因子。接種根瘤菌明顯提高了大豆產量,同時保持了良好土壤化學性狀和土壤菌群結構,很大程度地減少了化學氮肥的施用,對大豆的高效種植和氮肥減施具有重要意義。
    園藝
    基于CAPS標記的西瓜果實與種子相關性狀QTL分析
    遲瑩瑩,高鵬,朱子成,欒非時,李桂英,于鵬
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1282-1293.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.011
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    【目的】基于西瓜全基因組重測序數據,挖掘SNP位點并將其轉變為CAPS標記,構建遺傳連鎖圖譜,對西瓜果實與種子相關性狀進行QTL分析,為西瓜果實與種子相關性狀主效基因精細定位及克隆奠定理論基礎。【方法】以普通栽培西瓜品系(Citrullus lanatus ssp. vulgaris)‘W1-1’和黏籽西瓜品系(Citrullus lanatus ssp. mucosospermus)‘PI186490’為親本雜交獲得F1代,以‘W1-1’為輪回親本,構建BC1P1群體。采摘成熟果實,對每個西瓜果實中心及邊緣可溶性固形物、中心及邊緣果肉硬度、種子百粒重、種皮底色進行調查及數據分析。對親本材料進行覆蓋度約為20×的全基因組重測序,用BWA、SAMTOOLS及VCFTOOLS等軟件比對并檢測親本材料在全基因組范圍內的SNP位點。運用SNP2CAPS軟件選擇7種在西瓜基因組上具有豐富酶切位點的限制性內切酶,對包含SNP位點的序列進行酶切位點分析,轉化CAPS標記。選取全基因組范圍內均勻分布的450個CAPS分子標記,篩選多態性CAPS標記,對BC1P1群體內225株分別進行基因分型,使用QTL IciMapping及Windows QTL CartographerV2.5等軟件進行遺傳圖譜的構建和西瓜果實與種子相關性狀的QTL分析。【結果】在兩親本間共獲得SNP位點751 532個,根據7種限制性內切酶位點信息共開發了450個CAPS分子標記,篩選出其中具有多態性的200個CAPS標記,在225株BC1P1群體構建一張包含11個連鎖群(分別對應11條染色體)的遺傳連鎖圖譜,覆蓋長度1 376.95 cM,標記間的平均遺傳距離為6.88 cM。QTL分析定位到與果實與種子相關性狀QTL位點15個,其中包括中心可溶性固形物含量相關位點3個(CTSS2.1CTSS2.2CTSS8.1);邊緣可溶性固形物含量相關位點1個(ETSS2.1);中心果實硬度相關位點3個(CFF6.1CFF6.2CFF8.1);邊緣果實硬度相關位點2個(EFF6.1EFF6.2);種皮底色相關位點4個(SCC8.1SCC8.2SCC8.3SCC8.4);種子百粒重相關位點2個(SHW6.1SHW9.1)。15個QTL位點的貢獻率范圍為5.25%—74.59%,貢獻率大于15%的位點有5個(CTSS8.1SCC8.1SCC8.2SCC8.3SCC8.4)。【結論】共開發出SNP位點751 532個,QTL分析檢測到西瓜果實與種子相關性狀QTL位點15個,其中主效QTL位點5個,分別為果實中心可溶性固形物及種皮底色相關位點(CTSS8.1、SCC8.1SCC8.2SCC8.3SCC8.4),為進一步精細定位及克隆西瓜果實與種子優良性狀基因奠定了基礎。
    香蕉CRISPR/Cas9基因編輯技術體系的建立
    胡春華,鄧貴明,孫曉玄,左存武,李春雨,鄺瑞彬,楊喬松,易干軍
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1294-1301.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.012
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    【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因編輯技術體系,為在香蕉上利用CRISPR/CAS9技術開展香蕉基因功能研究和香蕉育種工作開辟新的路徑。【方法】根據香蕉A基因組八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因組序列,利用在線工具ZiFiT Targeter Version 4.2確定合適的CRISPR/Cas9靶標序列,選擇其中一個位點作為靶標位點,設計包含靶標基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶點載體系統,以pYLgRNA-LacZ-U6a質粒為模版,Overlapping PCR法構建U6a-sgRNA表達盒,再利用Golden Gate Cloning法將U6a-sgRNA表達盒克隆到pYLCRISPR/Cas9載體中,構建以MaPDS為靶標基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA載體。構建的質粒含Cas9psgRNA表達盒,其中Cas9pPUbi啟動子驅動,sgRNA水稻來源的RNA啟動子U6a驅動。將構建好的載體轉入農桿菌EHA105,轉化香蕉主栽品種巴西蕉胚性細胞懸浮系,獲得抗性再生植株。設計PCR引物擴增包含靶標序列的MaPDS序列片段,檢測和分析再生植株MaPDS被編輯的情況。【結果】試驗選擇MaPDS作為CRISPR/Cas9靶標基因,設計一個靶標位點,利用Overlapping PCR法獲得了U6a-sgRNA表達盒,利用Golden Gate Cloning法將其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位點,成功構建了針對MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA載體。經過農桿菌浸染、抗性篩選、抗性胚誘導、萌發及生根,最終獲得抗性獨立轉化株系129個。其中,71個株系出現白化表型,產生白化表型的幾率達55%。失綠突變體的出現意味著MaPDS蛋白功能喪失。隨機取轉化株系中的白化表型株系33個和正常表型株系14個,提取其葉片基因組DNA,擴增含有MaPDS的靶位點片段,序列分析結果表明,白化表型株系的MaPDS靶位點序列發生了基因編輯。主要是在靶位點附近增加1個堿基T或A,或是在靶位點附近或下游發生堿基顛換或轉換,出現非靶標位點突變。這些突變形式均能導致MaPDS蛋白翻譯錯誤,從而使MaPDS蛋白喪失功能,表現為白化。轉化株系中表型正常植株的MaPDS靶位點序列與野生型一致,未檢測到變異。【結論】成功在香蕉體內實現了對內源MaPDS的定點敲除,獲得了基因定點敲除的突變體株系,為進一步利用基因編輯技術在香蕉上的應用奠定了基礎。
    電阻抗斷層成像評價豐花月季抗寒性
    焦美玲,弓瑞娟,錢稷,張鋼
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1302-1316.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.013
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    【目的】研究電阻抗斷層成像(electrical impedance tomography,EIT)技術評價豐花月季抗寒性的可行性,為快速、非破壞性地檢測觀賞植物抗寒性提供新的可借鑒方法。【方法】以3個多年生豐花月季(Rosa hybrida Hort.Floribunda’)品種‘紅帽’(Hongmao)、‘柔情似水’(Rouqingsishui)、‘仙境’(Xianjing)為試材,測定當年生莖段在自然低溫以及人工冷凍處理下EIT圖像和電阻抗圖譜(electrical impedance spectroscopy,EIS)參數的變化,并與傳統電導法(electrolyte leakage,EL)測定的抗寒性進行相關分析。同時,對自然低溫下3個豐花月季品種莖的胞外電阻率re、胞內電阻率ri、弛豫時間t和弛豫時間分布系數y四個EIS參數與EIT重構值進行相關性分析。【結果】3個豐花月季品種在最冷月抗寒性順序為:‘仙境’>‘柔情似水’>‘紅帽’;各個品種不同溫度下的莖段都可以得到清晰的EIT圖像,且EIT重構值隨溫度降低呈減小的趨勢,通過EIT重構值計算的抗寒性與電導法求得的抗寒性有極顯著的相關性(r=0.92),但較EL法測得的抗寒性低。抗寒鍛煉期間,EIS參數均發生變化,總體上,胞外電阻率re呈上升趨勢,弛豫時間t呈下降的趨勢;自然低溫下,‘紅帽’和‘仙境’的胞外電阻率re與EIT重構值正相關(r>0.72),‘柔情似水’和‘仙境’的弛豫時間t同樣和EIT重構值正相關(r0.63),說明EIT重構值、ret可以表征細胞、組織的狀態。【結論】冷凍處理下,豐花月季枝條受到凍害以后,EIT圖像重構值顯著降低,可以通過重構值用Logistic方程擬合計算,得到抗寒性,但是所得抗寒性較EL法低。未經冷凍處理的胞外電阻率re和弛豫時間t兩個EIS參數與EIT重構值有一定的相關性。樣本經冷凍處理后,可以用莖的電阻抗斷層成像(EIT)圖像重構值評價豐花月季的抗寒性。
    食品科學與工程
    消費者膳食中二氧化硫殘留的累積性風險評估
    胡桂仙,賴愛萍,袁玉偉,張志恒,趙首萍,朱加虹,王強
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1317-1325.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.014
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     【目的】明確不同食物源中的二氧化硫殘留累積暴露風險,為硫磺或亞硫酸鹽類(以二氧化硫殘留計)在水果、蔬菜等產品中的使用及其二氧化硫殘留限量的制定提供科學依據。【方法】采集生產及流通環節的各類食品(包括農產品),共計3 299個樣品,參照GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的測定》方法進行二氧化硫殘留量檢測。結合文獻資料中淀粉、酒類、食用菌及藻類罐頭等408個樣品的二氧化硫殘留數據,基于殘留均值、人均消費量及體重數據,采用點評估方法評估中國不同人群的二氧化硫累積性膳食暴露風險。【結果】在27種食品中,腌漬的蔬菜、蔬菜罐頭(僅限竹筍、酸菜)、水果干類及食用淀粉的殘留均值分別為148.92、147.36、191.21和41.57 mg·kg-1,均超過了GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中允許的最大使用量,其中蔬菜罐頭(僅限竹筍和酸菜)的殘留均值是允許使用量的2.9倍,水果干類是1.9倍,腌漬的蔬菜是1.5倍,食用淀粉是1.4倍。通過風險評估可知,由于這4類食品的消費量較低,其風險程度均在人體可接受范圍內;盡管蔬菜中二氧化硫的膳食暴露風險商高于其他食物類別,但其風險商僅為0.124,仍小于1,處于安全水平,不會對消費者產生健康風險;從平均殘留水平得到的風險商來看,不同年齡段人群的風險商均小于1,而P95和P97.5位點值時,2—3歲、4—6歲、7—10歲和11—13歲4個年齡組的膳食風險商已大于或近似于1,說明在該年齡段,二氧化硫的膳食風險對健康造成了一定威脅。【結論】建議消費腌漬蔬菜、蔬菜罐頭(僅限竹筍、酸菜)、水果干類及食用淀粉的人群適當控制這4類食品的攝入量;對二氧化硫的膳食高風險人群(2—13歲)應控制其飲食中二氧化硫的攝入量,尤其是減少腌菜類食品的消費量,降低膳食風險;建議對未做明確使用規定的農產品尤其是部分新鮮蔬菜,開展二氧化硫殘留的安全性再評價,結合產業需求、產品本底等客觀因素,系統性修訂二氧化硫的限量標準或增加食品添加劑的使用范圍。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    外源蛋白酶對肉雞飼糧體外干物質消化率和酶水解物能值的影響
    張立蘭,陳亮,鐘儒清,張宏福
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1326-1333.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.015
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    【目的】研究外源蛋白酶對肉雞飼糧體外干物質消化率(DMD)和酶水解物能值(EHGE)的影響,并使用仿生法獲取飼糧中外源蛋白酶的最適添加量,為飼用酶制劑效價快速評價方法的建立提供理論參考。【方法】試驗采用單因素完全隨機設計,對照組分別為肉雞前期和后期基礎飼糧(粗蛋白質水平分別為:24.29%和21.72%,干物質基礎),試驗組分別在肉雞前期和后期基礎飼糧中添加0、15 000、75 000和150 000 PROT·kg-1的外源蛋白酶,試驗共8種飼糧樣品,每種飼糧樣品設5個重復,每個重復1根仿生消化管,使用單胃動物仿生消化系統(SDS-II)分別模擬飼糧在雞的胃和胃—腸道的消化過程,測試并計算飼糧樣品的DMD、體外能量消化率(GED)和EHGE,分別建立DMD和EHGE與蛋白酶添加量(protease supplementation, PS)的回歸方程,并分析DMD和EHGE與PS的相關關系。【結果】隨著外源蛋白酶添加劑量的增加,肉雞前期和后期基礎飼糧全消化道DMD、GED和EHGE也隨之增加(P<0.01)。隨著在肉雞后期基礎飼糧中外源蛋白酶添加劑量的增加,胃消化階段的DMD和GED隨之降低(P<0.01)。而在肉雞前期基礎飼糧中添加外源蛋白酶,對胃消化階段的DMD、GED和EHGE影響不顯著(P>0.05)。肉雞前期基礎飼糧全消化道DMD (%)和PS (g·kg-1)的關系為:DMD (%) =2.56 PS-0.82 PS ×PS+73.90 (R2=0.82, RSD = 0.42, P<0.001);EHGE (MJ·kg-1)和PS (g·kg-1) 的關系為:EHGE (MJ·kg-1) = 0.75 PS - 0.30 PS × PS + 15.02 (R =0.89, RSD=0.07, P<0.001);當外源蛋白酶添加劑量為112 500 PROT·kg-1時,肉雞前期基礎飼糧全消化道EHGE達到最大值。肉雞后期基礎飼糧全消化道DMD (%)和PS (g·kg-1)的關系為:DMD (%) = 3.56 PS-1.46 PS ×PS+75.20 (R2 = 0.70, RSD = 0.60, P<0.001);EHGE (MJ·kg-1)和PS (g·kg-1)的關系為:EHGE (MJ·kg-1) = 0.61 PS-0.30 PS×PS + 15.67 (R2 = 0.79, RSD = 0.06, P<0.001),當外源蛋白酶添加劑量為91 800 PROT·kg-1時,肉雞后期基礎飼糧全消化道的EHGE達到最大值。【結論】玉米-豆粕基礎飼糧中添加外源蛋白酶,可顯著提高肉雞基礎飼糧體外全消化道DMD、GED和EHGE。但外源蛋白酶的添加劑量對不同消化道階段和不同營養指標消化率的影響并不呈單純一致的劑量反應規律。本試驗條件下,肉雞前期和后期基礎飼糧中分別添加112 500和91 800 PROT·kg-1的蛋白酶時EHGE提升效果最好。
    GPNMB通過調控MITF下游色素相關基因表達影響黑色素細胞色素的生成
    趙兵令,李亞楠,陳天直,劉穎,常露程,范瑞文,薛霖莉,王海東,董常生
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1334-1342.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.016
    摘要 ( 126 )   HTML ( 1 )   PDF (2418KB) ( 525 )   收藏
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    【目的】探究GPNMB是否會通過調控MITF及其下游色素相關基因的表達來影響黑色素細胞中色素的生成,為進一步闡明GPNMB對黑色素細胞中色素生成的具體機制提供理論依據。【方法】首先對小鼠GPNMB核酸序列進行檢索,通過對GPNMB和慢病毒表達載體序列分析來篩選出合適的酶切位點,在此選取SalⅠ和XbaⅠ作為酶切位點。并對GPNMB基因序列設計含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位點的全長引物,克隆GPNMB基因全長序列,將含有酶切位點的GPNMB基因片段與T載體進行連接,送華大基因測序。將構建成功的T載體提取質粒,雙酶切后將其與含有綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒表達載體相連接,送華大基因進一步測序確認。使用質粒中提試劑盒獲得大量去內毒素的GPNMB慢病毒真核表達載體。通過體外培養小鼠黑色素細胞,選擇細胞對數生長期利用細胞轉染技術過量表達GPNMB。觀察轉染后黑色素細胞形態特征變化和綠色熒光蛋白的表達量,收集黑色素細胞,并對其進行轉染效率驗證,黑色素含量進行測定,以及經Real-time PCR和Western blot檢測轉染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表達量。【結果】與正常組(Control)相比試驗組(Vector-GFP-GPNMB)、空載組(Vector-GFP)中黑色素細胞的形態特征無明顯變化,并且試驗組、空載組的綠色熒光蛋白表達量顯示5 μg DNA/孔轉染效率最高。相對于空載組和正常組,試驗組的GPNMB mRNA和蛋白水平都顯著的升高(P<0.01)。與空載組相比,試驗組黑色素含量升高1.34倍,差異顯著(P<0.01)。Real-time PCR檢測結果顯示,MITF mRNA顯著降低2.25倍(P<0.01);PMEL mRNA顯著升高1.59倍(P<0.05);TYRP1 mRNA顯著升高2.35倍(P<0.01);TYRP2 mRNA顯著升高1.60倍(P<0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但變化不明顯。Western blot檢測結果顯示,MITF蛋白顯著降低1.59倍(P<0.01);TYR蛋白顯著升高1.23倍(P<0.01);TYRP2蛋白顯著升高4.35倍(P<0.01);OA1蛋白顯著升高1.31倍(P<0.05);TYRP1蛋白升高1.05 倍,但變化不明顯。【結論】 GPNMB過量表達使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表達量增加,卻使MITF的表達量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF調控路徑調節PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表達,從而影響黑色素的生成。
    研究簡報
    甜橙和柚中CTV強弱毒株系p20的遺傳變異
    王亞飛,阮濤,周彥,王雪峰,吳根土,孫現超,周常勇,青玲
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1343-1350.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.017
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    【目的】對7個柑橘衰退病毒(CTV)株系進行遺傳變異研究,明確寄主甜橙和柚中CTV強弱毒株系p20的變異水平。【方法】運用RT-PCR、克隆及測序等技術建立CTV p20種群,并借助MEGA6構建單倍型系統發育樹,運用軟件DNAStar對兩種寄主中CTV強弱毒種群的遺傳結構、變異水平進行分析,運用DnaSP軟件對各種群進行單倍型多樣性、核苷酸多樣性分析和中性檢驗分析。【結果】構建了7個CTV p20種群,由162條序列構成,包含11個單倍型,單個種群有1個或更多單倍型出現。序列分析發現,來自不同種群的單倍型對應的原始核苷酸序列一致性為88.2%—100.0%,對應的氨基酸序列的一致性為92.3%—100.0%,最低的氨基酸序列一致性發生在CT23-1和CT9-2之間;其中單倍型PeraIAC-4、CT22和CT9-1共有50條序列,對應的原始核苷酸序列一致性為100.0%,屬優勢單倍型,與標準株系T36親緣關系較近;單倍型多樣性最豐富的是甜橙種群PeraIAC,單倍型多樣性為0.800,而單倍型多樣性最低的是柚種群CT22,單倍型多樣性為0.170;相比柚種群的單倍型多樣性(0.170—0.552)和核苷酸多樣性(0.00032—0.05919),甜橙種群具有更為豐富的單倍型多樣性(0.513—0.800)和核苷酸多樣性(0.04208—0.05677)。系統發育樹分析表明,來自甜橙的分離株種群結構復雜,甜橙種群中檢測到的單倍型與標準株系T30、T36、VT和T3均有相關性;與標準株系T3相距很近的CT31-2與優勢單倍型在系統發育樹上距離最遠,對應的原始核苷酸序列一致性僅為88.3%。中性檢驗結果表明,CTV甜橙種群趨于平衡或收縮狀態,而CTV柚種群除CT23外則趨于擴張狀態;其中TR-514Y、CT31和CT23種群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均為正值且達到顯著水平,而CT9種群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均為負值且達到顯著水平。運用DnaSP軟件對各種群進行重組分析表明,在各種群中均未檢測到重組事件發生。種群變異分析發現,各種群突變克隆百分比在0—30.8%,堿基突變頻率在0—7.706×10-4,其中CTV甜橙強毒種群有最高的突變克隆百分比(30.8%),最高的堿基突變頻率(7.706×10-4),最多的堿基突變數量(11個)和最多的突變位點(7個);CTV甜橙弱毒種群的突變克隆百分比和堿基突變頻率均明顯低于甜橙強毒種群,CTV柚弱毒種群的突變克隆百分比和堿基突變頻率略低于柚強毒種群。堿基突變類型分析發現堿基突變以堿基替代為主,其中A→G突變為優勢類型,僅在柚強毒種群CT3的156和157位點間檢測到一個堿基插入突變類型,為堿基A插入,未檢測到堿基缺失突變類型。【結論】在寄主甜橙和柚中CTV強弱毒p20種群結構及變異存在差異,CTV甜橙種群有著更復雜的種群結構和更高的種群變異水平,且CTV強毒種群變異更大。
    棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表達及多克隆抗體的制備
    魏原杰,王亞美,黃麗娜,劉寧,趙潔,艾新宇,劉小寧
    中國農業科學. 2017, 50(7):  1351-1360.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.018
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    【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii) P450 CYP6CY3,將其開放閱讀框(ORF)在原核細胞中進行表達,純化融合蛋白,多次免疫小鼠獲得CYP6CY3多克隆抗體,為進一步分析CYP6CY3在棉蚜不同組織部位的分布及其在抗性中的作用打下基礎。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技術克隆獲得CYP6CY3ORF,并對其進行生物信息學及系統進化分析。構建重組質粒pET32a-CYP6CY3,轉化大腸桿菌transetta(DE3)進行原核表達,利用切膠回收法獲得純化的融合蛋白,繼而用純化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制備鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗體;ELISA檢測鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗體的效價,并通過western blot及免疫組化檢測該抗體特異性。【結果】棉蚜CYP6CY3不含有信號肽序列,屬親水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5個P450家族的特征基序。 ORF長1 266 bp,編碼421個氨基酸,預測蛋白分子量為48.8 kD,理論等電點為8.99,通過NCBI Blastx進行同源序列的比對分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列與豌豆長管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,達到81%,與麥雙尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性為79%,與桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性為76%,4種蚜蟲的氨基酸序列都含有位于螺旋K中參與穩定核心結構的E××R完全保守序列及P450基因標志性的F××G×××C×G(358—367)血紅素結合位點的共有序列。使用MEGA5軟件構建系統進化樹,顯示棉蚜、豌豆長管蚜、麥雙尾蚜及桃蚜聚為一類,親緣關系較近。通過原核表達得到的CYP6CY3融合蛋白的相對分子量約為66 kD,基于純化的CYP6CY3重組蛋白多次免疫昆明白小鼠制備多克隆抗體,ELISA檢測獲得的鼠抗CYP6CY3抗體效價達到1﹕409 600。Western blot和免疫組化進一步證實,該抗體既能與異源表達的CYP6CY3蛋白特異性結合,也能與棉蚜組織中存在的天然CYP6CY3蛋白特異性結合,具有較好的免疫反應特異性。【結論】利用3′-RACE技術克隆獲得CYP6CY3的開放閱讀框,并用異源表達的蛋白免疫昆明白小鼠制備了高滴度、特異性強的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗體,可用于進一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗藥性方面的作用。
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