Please wait a minute...
廣告服務

當期目錄

    2017年 第50卷 第8期 刊出日期:2017-04-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    基因組編輯技術及其安全管理
    沈平,章秋艷,楊立桃,張麗,李文龍,梁晉剛,李夏瑩,王顥潛,沈曉玲,宋貴文
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1361-1369.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.001
    摘要 ( 521 )   HTML ( 3 )   PDF (392KB) ( 1218 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    基因組編輯技術利用核酸酶對生物體內的DNA雙鏈進行斷裂,并以非同源末端連接或同源重組的方式對基因組DNA特定位點進行突變、缺失或者基因的插入與替換。鋅指核酸酶、轉錄激活因子樣效應物核酸酶、成簇規律間隔短回文重復序列是目前基因組編輯技術應用中的3種關鍵核酸酶。基因組編輯技術已在植物基因功能、育種等領域廣泛應用,特別是基于成簇規律間隔短回文重復序列的基因編輯技術CRISPR-Cas9。具有優良性狀的基因組編輯大豆、玉米等產品已逐步從實驗室走向田間,基因組編輯作物展現了較傳統轉基因作物更為優越的應用前景。本文簡要概述了主要使用的3種基因組編輯技術及其原理。對這些技術的優缺點進行了分析,并依據物種分類梳理了利用上述3種技術在動物、植物中突變體建立、基因功能研究、分子育種等方面的研究進展。同時,針對基因編輯產物的產業化應用前景,討論了基因編輯技術及其產品較傳統轉基因技術產品的優勢,分析了基因編輯技術及其產品可能因脫靶效應而引發的生物安全風險,介紹了美國、歐盟等國家對基因編輯技術及其產品安全管理和商業化應用的政策。文章結合中國現行法規對轉基因生物的定義及安全評價(實質等同、個案分析)原則,討論了基因編輯技術及其產品的安全管理,初步提出了基于傳統轉基因生物安全評價框架的基因編輯產品的安全評價和管理思路。針對基因編輯產品需要按照個案原則進行評價和管理,安全評價重點開展分子特征及食用安全評價;同時需要針對基因編輯技術的特點建立更加有效、特異的檢測新方法,實現對基因編輯產品的有效監測,以促進基因組編輯產品的商業化應用。
    小麥TaLox-B等位變異對脂肪氧化酶活性和面粉色澤的影響
    張福彥,陳鋒,程仲杰,楊保安,范家霖,陳曉杰,張建偉,陳云堂,崔龍
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1370-1377.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.002
    摘要 ( 238 )   HTML ( 2 )   PDF (1232KB) ( 313 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】小麥籽粒脂肪氧化酶(Lox)與面粉色澤密切相關,研究TaLox-B位點上的不同等位變異類型對Lox活性和面粉色澤的影響,為面粉色澤的改良和相關的品質育種工作提供參考依據。【方法】選用122份河南小麥品種(系)為試驗材料,用紫外分光光度計和色差儀分別測定其Lox活性和面粉色澤,并利用控制脂肪氧化酶活性位于4BS上的TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位點上的功能標記Lox16、Lox18和Lox-B23對參試材料的Lox基因型進行鑒定。【結果】不同品種間Lox活性及其色澤性狀差異達到極顯著水平。基因型鑒定結果表明,參試材料的TaLox-B1位點存在TaLox-B1a和TaLox-B1b兩種等位變異,所占比例分別為63.9%和39.1%,TaLox-B2位點存在TaLox-B2a和TaLox-B2b兩種等位變異,所占比例分別為57.4%和42.6%,TaLox-B3位點也存在TaLox-B3a和TaLox-B3b兩種等位變異,所占比例分別為41.8%和48.2%。分析其基因型組合發現,參試材料中共有6種基因型組合類型,依次為TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b、TaLox-B1a/TaLox-B2b/ TaLox-B3b、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b和TaLox-B1b/TaLox-B2b/ TaLox-B3b,所占比例分別為41.8%、15.6%、6.6%、28.7%、5.7%和1.6%。分析不同TaLox-B位點基因與Lox活性及紅度(a*值)、黃度(b*值)、亮度(L*值)、白度(Wht值)等面粉色澤性狀的關系表明,單基因等位變異對Lox活性和面粉色澤的影響不同,3個基因等位變異a*值差異均不顯著,對Lox活性的效應,TaLox-B2a高于TaLox-B2b(P<0.05),TaLox-B3a高于TaLox-B3b(P<0.01),TaLox-B2a基因型的Wht值低于TaLox-B2b基因型(P<0.01),TaLox-B3a基因型的Wht值也低于TaLox-B3b基因型(P<0.05)。說明TaLox-B2和TaLox-B3對Lox活性和面粉色澤具有重要影響。進一步分析發現,擁有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型組合的小麥品種(系)的Lox活性和b*值最高,a*值和Wht值最低,而TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b基因型組合的小麥品種(系)的L*值、a*值和Wht值最高,其Lox活性和b*值最低。【結論】河南小麥中所發現的6種不同Lox基因型組合中,擁有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型組合的小麥品種(系)的Lox活性相對較高,Wht值相對較低(P<0.05),而擁有TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b基因型組合的小麥品種(系)的Lox活性相對較低,Wht值相對較高(P<0.05)。Lox活性的遺傳控制在面粉色澤品質改良進程中發揮著關鍵作用。
    擬斯卑爾脫山羊草的FISH核型分析
    董磊,董晴,張文利,胡曉龍,王洪剛,王玉海
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1378-1387.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.003
    摘要 ( 192 )   HTML ( 2 )   PDF (3507KB) ( 372 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】建立擬斯卑爾脫山羊草的FISH核型,分析明確不同來源擬斯卑爾脫山羊草的FISH核型特點,比較不同擬斯卑爾脫山羊草及其與普通小麥的FISH核型差異。【方法】以熒光標記的寡核苷酸Oligo-pTa535Oligo-pSc119.2為探針,利用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術分析pTa535pSc119.2在不同擬斯卑爾脫山羊草、四倍體小麥和普通小麥染色體上的雜交信號分布特點;以禾本科植物著絲粒專化寡核苷酸Oligo-CCS1為探針,明確擬斯卑爾脫山羊草的著絲粒位置,測量擬斯卑爾脫山羊草染色體相關參數;通過FISH核型比較明確不同擬斯卑爾脫山羊草及其與小麥核型的多態性差異。【結果】Oligo-pTa535主要分布在小麥的D和A組染色體上,在小麥的B組染色體上僅有零星分布,在5份擬斯卑爾脫山羊草的染色體中未顯示Oligo-pTa535雜交信號。Oligo-pSc119.2雜交信號主要分布在小麥的B組染色體上,在小麥的A、D組染色體中分布較少,但在5份擬斯卑爾脫山羊草染色體上均有廣泛分布。根據Oligo-pTa535Oligo-pSc119.2雜交信號在小麥染色體上的分布特點,可以將小麥的不同染色體相互區分開來。Oligo-pSc119.2雜交信號在不同倍性、不同品種的小麥B組染色體上的分布特點基本相似,而不同來源擬斯卑爾脫山羊草的Oligo-pSc119.2的FISH核型差異較大,甚至在同一細胞內的2條同源染色體上Oligo-pSc119.2雜交信號的分布也具有明顯差異。不同來源的擬斯卑爾脫山羊草與小麥B染色體組的FISH核型存在明顯差異。PI542238的7對染色體均為中間著絲粒染色體,核型公式為2n=14=14m。其余4份擬斯卑爾脫山羊草的4S染色體均為近中著絲粒染色體,其余染色體均為中間著絲粒染色體,核型公式皆為2n=14=12m+2sm。【結論】擬斯卑爾脫山羊草染色體上含有豐富的與pSc119.2高度同源的重復序列,不含有與pTa535高度同源的重復序列。不同來源的擬斯卑爾脫山羊草之間以及同一來源的擬斯卑爾脫山羊草的個體間甚至同一個體內的同源染色體間在pSc119.2的分布上均具有遺傳多樣性。以Oligo-pSc119.2為探針建立的擬斯卑爾脫山羊草染色體FISH核型與小麥B組染色體的核型具有顯著差異。利用熒光標記的Oligo-pTa535Oligo-pSc119.2為探針進行FISH分析,可以準確區分擬斯卑爾脫山羊草的不同染色體,并能將擬斯卑爾脫山羊草與小麥的染色體區分開來。
    酒用糯高粱資源成株期抗旱性鑒定及抗旱指標篩選
    汪燦,周棱波,張國兵,徐燕,張立異,高旭,高杰,姜訥,邵明波
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1388-1402.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.004
    摘要 ( 229 )   HTML ( 17 )   PDF (971KB) ( 372 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】干旱是影響酒用糯高粱生產的主要因素之一,鑒定酒用糯高粱資源成株期的抗旱性,篩選抗旱指標,培育抗旱品種,對高粱產業的發展具有重要意義。【方法】以50份酒用糯高粱資源為材料,于2015年和2016年設置正常灌水和干旱脅迫2個處理在旱棚內進行田間試驗,測定株高、穗長、莖粗、分蘗數、穗粒數、千粒重、單株粒重和產量,采用抗旱性度量值(D值)、綜合抗旱系數(CDC值)、加權抗旱系數(WDC)、相關分析、頻次分析、主成分分析、灰色關聯度分析、隸屬函數分析、聚類分析和逐步回歸分析相結合的方法,對其進行成株期抗旱性鑒定及抗旱指標篩選。【結果】干旱脅迫對各指標均有極顯著影響。相關分析表明,產量與分蘗數、穗粒數和單株粒重呈極顯著正相關,與穗長、莖粗和千粒重呈顯著正相關,與株高呈不顯著的正相關。頻次分析表明,各指標對干旱脅迫反應的敏感程度依次為產量、穗粒數、分蘗數、單株粒重、千粒重、莖粗、穗長和株高。主成分分析表明,5個主成分可代表酒用糯高粱抗旱性84.26%的原始數據信息量。基于D值、CDC值和WDC值的供試酒用糯高粱材料抗旱性排序相近。灰色關聯度分析表明,各指標DC值與D值間的關聯度大小依次為產量、分蘗數、穗粒數、單株粒重、千粒重、穗長、莖粗和株高,這與各指標DC值與WDC值的密切程度基本吻合。根據D值進行聚類分析,可將供試酒用糯高粱材料劃分為5個抗旱級別,其中Ⅰ級2份、Ⅱ級16份、Ⅲ級28份、Ⅳ級2份、Ⅴ級2份。除莖粗和分蘗數外,其余指標的隸屬函數值、CDC值、D值和WDC值均隨抗旱級別的升高而增大。逐步回歸分析表明,與D值密切相關的指標有分蘗數、穗粒數和單株粒重。【結論】干旱脅迫對酒用糯高粱資源成株期各指標均有極顯著影響。確定了D值為適宜的抗旱性鑒定方法。篩選出成株期抗旱性強的酒用糯高粱材料分別為粱豐141-3和粱豐247-3,可為酒用糯高粱抗旱育種、抗旱機理及干旱調控緩解機制的研究提供基礎材料。分蘗數、穗粒數和單株粒重可作為酒用糯高粱資源成株期簡單、直觀的抗旱性評價指標。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    江西雙季晚稻不同緯度產量、生育期及溫光資源利用的差異
    陳波,周年兵,郭保衛,舒鵬,張洪程,霍中洋,程飛虎,花勁,黃大山,陳忠平,陳恒,劉云發,廖世亮
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1403-1415.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.005
    摘要 ( 260 )   HTML ( 1 )   PDF (458KB) ( 645 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】研究明確江西不同緯度不同類型雙季晚稻產量、生育期及溫光資源利用差異,為江西雙季晚稻適宜粳稻品種的科學選用提供依據與參考。【方法】以秈粳雜交稻、雜交粳稻、常規粳稻、雜交秈稻(CK)4種類型品種為材料,在江西樂平市(29.00°N, 117.12°E)、上高縣(28.27°N, 115.12°E)、贛州市(25.81°N, 114.96°E)3個試驗點進行試驗,比較研究雙季晚稻不同類型品種在緯度上的產量、生育期及溫光資源利用的差異特征。【結果】隨著緯度升高,3種類型粳稻產量均增加,2013年(2014年)平均緯度每增加1°,秈粳雜交稻、雜交粳稻、常規粳稻分別增產0.36(0.32)、0.18(0.22)、0.25(0.20)t·hm-2。同一緯度下,除贛州試驗點雜交粳稻與常規粳稻的產量低于雜交秈稻外,其余各點均表現為秈粳雜交稻、雜交粳稻與常規粳稻產量顯著高于雜交秈稻。各試驗點3種類型粳稻均能安全成熟,隨著緯度升高,各類型水稻播種至拔節期顯著延長,全生育期天數增加;同一試驗點3種類型粳稻全生育期均極顯著長于雜交秈稻,主要表現在抽穗至成熟期天數的增加。3種類型粳稻光照與積溫及其利用效率表現為秈粳雜交稻>雜交粳稻>常規粳稻>雜交秈稻,在安全成熟條件下,雙季晚稻生育期越長,溫光資源利用率越高。【結論】江西不同緯度地區實行雙季晚稻“秈改粳”,可顯著提高當地溫光資源利用率與稻谷產量。與大面積種植的秈型雜交稻相比,在樂平與上高地區選種秈粳雜交稻、雜交粳稻與常規粳稻均具有顯著的產量及溫光資源利用優勢;在贛州地區選種秈粳雜交稻的優勢明顯。雙季晚稻“秈改粳”可能是提高雙季稻區水稻產量的現實途徑之一。
    測墑補灌對2個小麥品種旗葉葉綠素熒光及衰老特性的影響
    閆麗霞,于振文,石玉,趙俊曄,張永麗
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1416-1429.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.006
    摘要 ( 156 )   HTML ( 1 )   PDF (548KB) ( 349 )   收藏
    相關文章 | 多維度評價
    【目的】探討測墑補灌和定量灌溉對2個小麥品種旗葉葉綠素熒光、衰老特性及籽粒產量的影響,為小麥節水高產提供理論依據。【方法】于2013—2015兩年度,在大田條件下,選用泰農18(T18)和濟麥22(J22)2個小麥品種,設置3個水分處理:W0(全生育期不灌水)、W1(依據0—40 cm土層土壤相對含水量進行測墑補灌,拔節期和開花期目標土壤相對含水量均為65%)、W2(定量灌溉,拔節期和開花期分別灌溉60 mm),研究測墑補灌和定量灌溉對2個小麥品種旗葉葉綠素熒光特性及衰老特性的影響。【結果】W1處理通過調節拔節期和開花期灌水量,保持灌水后0—40 cm土層土壤相對含水量在65%,可防止灌水過多或過少,為小麥生長發育創造適宜的土壤水分環境。W1處理條件下,兩小麥品種開花后14、21和28 d的旗葉電子傳遞速率、光化學猝滅系數、PSⅡ實際光化學效率及旗葉蔗糖含量均顯著高于W2處理,磷酸蔗糖合成酶活性在花后14和21 d顯著高于W2處理;兩小麥品種開花后14、21和28 d的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性均顯著高于W2,但同期旗葉丙二醛含量顯著低于W2并保持較高的旗葉可溶性蛋白含量。兩年度T18和J22兩品種W1處理的籽粒產量、水分利用效率和灌溉效益均顯著高于W2品種間比較可知,T18兩灌水處理的旗葉電子傳遞速率、光化學猝滅系數、PSⅡ實際光化學效率及旗葉蔗糖含量在花后21和28 d均顯著高于J22,磷酸蔗糖合成酶活性在花后7、14和21 d亦顯著高于J22;T18開花后21和28 d的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性、可溶性蛋白含量均顯著高于J22,但同期旗葉丙二醛含量顯著低于J22。同一年度同一處理條件下,T18和J20總耗水量和水分利用效率均無顯著差異;在W0處理條件下,J22的籽粒產量顯著高于T18;但在W1和W2處理條件下,T18的籽粒產量、灌溉效益均顯著高于J22。【結論】在小麥拔節期和開花期依據0—40 cm土層土壤相對含水量進行測墑補灌至65%土壤相對含水量,是兩小麥品種同步實現高產與節水的有效措施。在灌溉條件下T18的產量潛力高于J22,但在干旱條件下,其對水分敏感,致使產量低于J22
    植物保護
    蘋果炭疽葉枯病菌GcAP1復合體β亞基基因的克隆及功能分析
    張俊祥,冀志蕊,王娜,徐成楠,遲福梅,周宗山
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1430-1439.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.007
    摘要 ( 200 )   HTML ( 2 )   PDF (2231KB) ( 312 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】明確銜接蛋白(adaptor protein)GcAP1復合體β亞基在蘋果炭疽葉枯病菌(Glomerella cingulata)生長發育和致病過程中的功能,檢測GcAP1β在該菌中的時空表達模式,并揭示其是否調控多聚半乳糖醛酸內切酶(endopolygalacturonase)基因CgPG1CgPG2、果膠裂解酶(pectin lyase)基因pnl-1pnl-2以及果膠酸酯裂解酶(pectate lyase)基因pelA和pelB的表達,為深入開展蘋果炭疽葉枯病菌銜接蛋白在致病信號傳導途徑中的分子機制研究打下基礎。【方法】通過構建GcAP1β基因敲除載體和GcAP1β-gfp融合表達載體,利用農桿菌介導的遺傳轉化技術(ATMT)獲得Δgcap1β突變體和GcAP1β恢復菌株Δgcap1β-GcAP1β,并由RT-PCR和Southern雜交分析進行鑒定。以野生型菌株W16為對照,對Δgcap1β突變體和GcAP1β恢復菌株Δgcap1β-GcAP1β的生長速度、產孢能力、分生孢子萌發率及附著胞形成率和致病性進行測定。利用生物信息學軟件ProtComp 9.0和TMHMM對GcAP1β蛋白進行結構分析,并結合GcAP1β-GFP信號觀測,進行GcAP1β的亞細胞定位。利用qRT-PCR技術,檢測GcAP1β在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵染階段的表達量,并檢測CgPG1CgPG2pnl-1pnl-2pelA和pelB在野生型菌株和Δgcap1β突變體中的表達量。【結果】GcAP1β基因全長2 321 bp,含有3個內含子,編碼720個氨基酸。與野生型菌株W16相比,Δgcap1β突變體菌落成褶皺狀,菌絲生長速度明顯減慢,而分生孢子產量、分生孢子萌發率、附著胞形成率無顯著差異。Δgcap1β致病力明顯降低,僅在蘋果葉片上引起極小的點狀斑。GcAP1β基因恢復菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修復了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷。熒光檢測顯示,融合蛋白GcAP1β-GFP分布于細胞質中。qRT-PCR檢測結果表明,GcAP1β在蘋果炭疽葉枯病菌各個發育階段都有表達,且在侵染后表達量相對最高。GcAP1β的缺失導致CgPG1表達量降低至20.3%,CgPG2表達量降低至16.5%,pnl-1表達量降低至8.2%,pnl-2表達量降低至14.4%,pelA表達量降低至4.4%,pelB表達量降至0.8%。【結論】銜接蛋白GcAP1復合體分布于細胞質中,是蘋果炭疽葉枯病菌生長發育所需要的;GcAP1調控CgPG1CgPG2、pnl-1pnl-2pelApelB的表達,是蘋果炭疽葉枯病菌一個重要的毒力因子。
    氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對甜菜夜蛾主要解毒酶活性與生長繁殖的影響
    陳羿渠,向興,貢常委,王學貴
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1440-1451.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.008
    摘要 ( 157 )   HTML ( 1 )   PDF (568KB) ( 337 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)是一種雜食性害蟲,在不同環境、藥物等選擇壓力下表現出不同的生長發育特點。氯蟲苯甲酰胺是一種新型廣譜的魚尼丁受體殺蟲劑,對鱗翅目害蟲殺蟲活性強。本研究旨在探究氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對甜菜夜蛾幼蟲3種主要解毒酶——羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFOs)活性以及對種群繁殖的影響。【方法】采用飼料混毒法測定氯蟲苯甲酰胺對SE-Lab品系、SE-Sel品系的毒力,SE-Sel品系由SE-Lab品系經亞致死劑量LC25連續汰選6代得到;通過浸葉法測定磷酸三苯酯(TPP)、順丁烯二酸二乙酯(DEM)、胡椒基丁醚(PBO)3種酶抑制劑與氯蟲苯甲酰胺協同對SE-Lab和SE-Sel品系的毒力增效作用,提前12 h讓試蟲取食浸漬過酶抑制劑的葉片,對照組取食用0.1% TritonX-100浸漬后的葉片,再分別測定氯蟲苯甲酰胺對使用酶抑制劑與未使用酶抑制劑試蟲的毒力;在冰上解剖試蟲的中腸和脂肪體,并通過離體酶活性測定,分析氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量與酶抑制劑對甜菜夜蛾體內的3種代謝解毒酶活力的影響;通過記錄試蟲各個年齡階段的生長、死亡、產卵量等數據,參照兩性生命表理論分析SE-Lab和SE-Sel品系的兩性生命表參數差異。【結果】在3種酶抑制劑中PBO增效作用最強,其對甜菜夜蛾SE-Sel品系和SE-Lab品系對氯蟲苯甲酰胺的毒力增效比分別為1.58和1.69。在氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量連續汰選下,甜菜夜蛾體內3種解毒酶活性均被誘導上升,其中MFOs酶活力上升最顯著,SE-Sel品系中腸和脂肪體的MFOs活性相對于SE-Lab品系分別提高了2.07和2.10倍,而經氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量再次誘導的SE-Sel試蟲的MFOs活性亦較SE-Lab品系上升4.02和3.44倍;在使用了酶抑制劑后3種解毒酶酶活力均有下降,其中MFOs活性下降最多,其酶比活力僅為未使用酶抑制劑處理的42.3%—44.8%。與SE-Lab品系相比,SE-Sel品系成蟲的產卵前期和總產卵前期變長,而產卵量減少;SE-Sel品系的內稟增長率(r)、周限增長率(λ)和凈增殖率(R0)均顯著小于SE-Lab品系,SE-Lab品系與SE-Sel品系的r分別為0.18和0.16 d-1,λ為1.20和1.17 d-1, R0為358.42和203.12 d-1。盡管SE-Sel品系的平均世代周期(T)更長,但是與SE-Lab品系無顯著差異。【結論】MFOs可能為甜菜夜蛾對氯蟲苯甲酰胺解毒代謝過程中的主要解毒酶,在其后續抗性形成中起主要作用;甜菜夜蛾在氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量作用下,世代周期延長,繁殖力降低,種群增長減緩,氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對甜菜夜蛾有持續控制作用。
    山東省辣椒炭疽病病原菌的鑒定及高效防治藥劑的篩選
    高楊楊,禾麗菲,李北興,林琎,慕衛,劉峰
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1452-1464.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.009
    摘要 ( 182 )   HTML ( 2 )   PDF (2812KB) ( 447 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】明確山東省露地辣椒主產區炭疽病致病菌的種類,評價不同藥劑對致病菌的毒力和活體接種防效,篩選高效防治藥劑。【方法】從山東省菏澤、濟寧等5個辣椒主產區采集感炭疽病的辣椒果實,經分離、純化培養后,觀察菌落及分生孢子的形態、大小和病原菌的致病性,利用真菌通用引物ITS4和ITS5對4個典型代表菌株的rDNA-ITS進行擴增,對擴增產物進行回收和測序,并利用MEGA 5.1軟件進行基于病原菌的rDNA-ITS序列和GenBank中相關炭疽菌序列的系統發育樹構建,確定病原菌的種類。采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定11種殺菌劑對辣椒炭疽病菌的毒力,通過活體接種試驗驗證藥劑對辣椒炭疽病的防效。【結果】分離得到的27個菌株形態特征相同,氣生菌絲較發達,初呈白色,而后逐漸變為淺灰色,分生孢子無色單胞,橢圓形,一端稍尖,大小為(7.48—14.69)μm×(2.52—5.64)μm。將所分離得到的菌株接種于刺傷果實或無傷口果實,兩者均可發病,但刺傷果實上病斑發展快。病菌既侵染未成熟的辣椒果實,也侵染成熟的果實,病斑呈橢圓形凹陷,表面有橘黃色的分生孢子團。所選取的4個代表性菌株的rDNA-ITS序列的長度為562、541、557和553 bp,通過系統進化樹分析,4個代表菌株與炭疽菌屬尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)聚在同一分支上,親緣關系置信度為100%。室內毒力測定試驗表明,吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌 唑對尖孢炭疽菌的菌絲生長和孢子萌發均具有較高的抑制活性。活體接種試驗表明,吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌 唑對辣椒炭疽病具有較好的預防和治療作用,在濃度為400 μg·mL-1時,對辣椒炭疽病的預防效果和治療效果均大于60%,高于對照藥劑嘧菌酯的防效。【結論】引起山東省露地辣椒主產區辣椒炭疽病的致病菌為尖孢炭疽菌。吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌 唑對該菌具有較高的毒力和活體防效,在辣椒炭疽病的田間防治中具有較大的應用潛力。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    土壤水與有機質對高光譜的作用及交互作用規律
    尚璇,李西燦,徐郵郵,劉莎莎
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1465-1475.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.010
    摘要 ( 224 )   HTML ( 1 )   PDF (684KB) ( 344 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】定量揭示土壤水分與有機質對高光譜的作用規律,為提高土壤水分、有機質的光譜估測精度提供基礎。【方法】以山東省泰安市岱岳區90個棕壤土樣為研究對象,進行室外光譜采集、室內土壤水分和有機質測定,運用Savitzky-Golay filter對光譜曲線進行平滑去噪預處理。根據含水量、有機質含量的高低將土壤樣本分為9組,運用比較法對9組原始光譜數據進行分析,初步探究土壤水、有機質對光譜的作用規律。然后采用相關分析法,分析水、有機質與土壤原始光譜反射率(raw spectral reflectance,R)、光譜一階微分變換(first order differential reflectance,D(R))以及分組光譜的相關性。在假定其他影響因素基本相同的條件下,利用有交互作用的雙因素方差分析法,定量分析水、有機質對土壤光譜反射率、光譜一階微分的作用程度及其交互作用。根據土壤水與有機質的交互作用規律,按相關系數較大而交互作用小的原則選取特征因子,采取偏最小二乘回歸模型建立土壤有機質含量的高光譜估測模型,分析依據兩者交互作用規律選取的因子對提高光譜估測模型精度的有效性。【結果】在田間持水量范圍內,水對土壤光譜反射率影響起主要作用;水與有機質對土壤光譜客觀存在交互作用,當土壤含水量小于10%時,600—1 800 nm的原始光譜能較好反映有機質的作用,而當土壤含水量大于15%時,有機質的作用幾乎被水的作用所掩蓋。水、有機質對土壤原始光譜的作用及其交互作用分別在360—1 800,410—1 800,509—1 800 nm達到顯著水平,且三者均在1 951—2 450 nm達到顯著水平(α=0.05);對土壤光譜的作用程度由大到小依次為:水、有機質、交互作用;在425—1 800 nm水對土壤光譜的作用大約是有機質的5—8倍,在1 950—2 300 nm為8—12倍;在350—2 500 nm有機質對土壤光譜的作用大約是水與有機質交互作用的2倍。光譜經一階微分變換之后,在450—530、600—790、1 019—1 027、2 000—2 020以及2 045—2 075 nm土壤水的作用增強,而在其他波段處減弱;土壤有機質的作用在471—824、851—949、967—1 140、1 172—1 340、1 379—1 428、1 450—1 770、1 953—2 122、2 174—2 199以及2 271—2 342 nm處得到增強,而在其他波段處減弱。水與有機質的交互作用也在不同波段處有所變化,但相對于土壤水與有機質的作用變化幅度而言是相對減弱的。基于土壤水與有機質的交互作用規律選取的特征因子,所建立的土壤有機質高光譜估測模型精度有所提高,其中16個檢驗樣本的決定系數R2由不考慮交互作用的0.6764提高到0.7934。【結論】研究表明,在反演土壤含水量時,可以不考慮有機質對光譜的影響;而在反演有機質含量時,必須要剔除水對反射率的影響,還要考慮水與有機質對光譜的交互作用。考慮水與有機質對土壤光譜的交互作用,可有效提高土壤有機質的光譜估測精度。
    基礎地力對黃壤區糧油高產、穩產和可持續生產的影響
    黃興成,石孝均,李渝,張雅蓉,劉彥伶,張文安,蔣太明
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1476-1485.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.011
    摘要 ( 272 )   HTML ( 1 )   PDF (1274KB) ( 329 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】黃壤是中國重要的地帶性土壤,黃壤區糧油作物的高產、穩產和可持續生產對于地區糧食安全和經濟民生至關重要。研究黃壤區主要糧油作物基礎地力特征,評價地力對糧油作物高產、穩產和可持續生產的影響,為黃壤耕地地力保育和區域作物綠色生產提供依據。【方法】依托于2006—2013年測土配方施肥項目在黃壤區開展的3 515個田間試驗(馬鈴薯434個、油菜525個、玉米1 318個、水稻1 238個),調查每個試驗點無肥對照(CK)和氮磷鉀肥(N2P2K2)處理作物產量;基于作物估計方法,分析了糧油基礎地力產量和地力貢獻率特征;采用直線擬合和邊界線分析評價了基礎地力對作物施肥產量及產量差的影響;采用穩定性指數和可持續性指數評估了基礎地力對產量穩定性和可持續性的影響。【結果】黃壤區馬鈴薯、油菜、玉米和水稻平均基礎地力產量分別為10.8、1.13、4.57和5.73 Mg·hm-2,平均地力貢獻率分別為50.8%、49.0%、59.0%和70.8%;基礎地力產量越高,地力對作物施肥產量的貢獻率越大。作物施肥產量與基礎地力產量顯著正相關,馬鈴薯、油菜、玉米和水稻施肥產量與基礎地力產量的直線擬合方程決定系數分別為0.476、0.284、0.382和0.366(P<0.001)。邊界線分析結果表明,馬鈴薯、油菜、玉米和水稻4種作物的施肥產量潛力分別為42.8、4.07、11.8和12.4 Mg·hm-2;隨著基礎地力的提升,作物施肥產量差降低,產量的穩定性和可持續性增加。【結論】提升基礎地力能夠提升作物施肥產量,降低產量差,有利于黃壤區糧油作物的高產、穩產和可持續生產。
    園藝
    葉用萵苣熱激蛋白基因LsHsp70-2711的克隆及高溫脅迫下的功能分析
    李雅博,李婷,韓瑩琰,范雙喜
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1486-1494.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.012
    摘要 ( 145 )   HTML ( 1 )   PDF (1469KB) ( 526 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】通過克隆Hsp70相關基因,并利用VIGS分析葉用萵苣熱脅迫下Hsp70表達量和形態變化,為解析熱激蛋白基因Hsp70在高溫脅迫下的響應機制及分子機理奠定基礎。【方法】通過同源克隆及RACE技術,獲得葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-2711的cDNA全長序列,利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析該基因在不同溫度和不同高溫時間下的葉用萵苣熱敏品種‘P-S11’和耐熱品種‘G-S59’的表達差異,確定基因和高溫的相關性。根據VIGS技術,構建pTRV-LsHsp702711瞬時沉默載體,轉化農桿菌GV1301,注射法侵染葉用萵苣葉片,三周后經PCR鑒定得到陽性植株。對照組和陽性組在基因表達和形態上進行對比,對照植株和陽性植株熱脅迫和干旱處理后再次分析LsHsp70-2711的表達特性,觀測形態變化。【結果】LsHsp70-2711 cDNA全長為2 226 bp,開放閱讀框為2 154 bp,編碼718個氨基酸,與擬南芥(NP_187864.1)、番茄(NP_001266213.1)、水母雪蓮花(AAB99745.1)等物種的Hsp70同源性達到80%以上,證明此基因屬于Hsp70家族。根據qRT-PCR結果,高溫脅迫下該基因在兩個品種中的表達均上調,在耐熱品種中總體表達水平均高于熱敏品種,耐熱品種LsHsp70-2711的表達量最大值出現在42℃、60 min,37℃、60 min時熱敏品種基因表達量達最大值,且在42℃高溫下熱敏品種‘P-S11’中基因表達隨著脅迫時間的增加受到抑制,而耐熱品種‘G-S59’則能長時間保持較高的表達水平,此結果和田間兩品種間耐熱差異表現相符合。亞細胞定位顯示,LsHsp70-2711主要在細胞質中。將構建好的載體侵入葉用萵苣,鑒定后獲得陽性植株。由定量PCR結果可知,未進行脅迫處理的陽性植株與對照株相比,LsHsp70-2711表達量下降,莖長明顯增長。熱脅迫和干旱處理后的陽性植株LsHsp70-2711表達量顯著低于對照植株,高溫處理對LsHsp70-2711的影響大于干旱脅迫。【結論】LsHsp70-2711屬于Hsp70基因家族,其與葉用萵苣耐熱性相關。研究結果為解析葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-2711在葉用萵苣高溫抽薹方面的功能提供了理論支持。
    新疆紅肉蘋果3個品系的風味品質與抗氧化能力評價
    劉羽,劉盛雨,盧娟芳,于慶帆,席萬鵬
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1495-1504.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.013
    摘要 ( 165 )   HTML ( 2 )   PDF (1123KB) ( 272 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】明確新疆紅肉蘋果風味物質組成與含量特征,了解其營養品質狀況,為開發利用提供信息。【方法】分別采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和氣相色譜-質譜聯用(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)技術,以富士蘋果‘長富2號’為對照,檢測分析3個新疆紅肉蘋果品系果皮和果肉的糖、酸和揮發性成分的組成及含量,并測定評價其提取物的總酚、總黃酮的含量以及抗氧化活性。【結果】3個供試品系的可滴定酸含量為21.01—27.71 mg·mL-1,是對照的3.68—4.85倍,pH為3.12—3.39,顯著低于對照(P<0.05)。共檢測到果糖、葡萄糖、蔗糖3種可溶性糖,其中以果糖(56.71%—64.07%)為主,蔗糖的含量最低,僅僅占總糖含量的8.89%—31.12%。供試品系中可溶性糖的含量均顯著低于對照;果肉中果糖的含量顯著高于果皮,而葡萄糖和蔗糖的含量無顯著差異(P<0.05)。共檢測到5種有機酸,包括檸檬酸、酒石酸、草酸、蘋果酸和奎寧酸,以蘋果酸(56.53%—95.07%)的含量最高,其次為檸檬酸(2.11%—40.72%),其他酸的含量均低于0.6 mg·g-1 FW,奎寧酸只在‘13-3’中檢測到。果皮、果肉中,蘋果酸含量分別是對照的6.56—8.99倍和5.58—6.61倍,檸檬酸的含量是對照的16.80—117倍和4.50—16.17倍;果肉中蘋果酸的含量顯著高于果皮,而檸檬酸的含量顯著低于果皮(P<0.05)。共檢測到85種揮發性成分,醛類、酯類和萜類的含量最為豐富,共占總香氣物質的92.32%—97.84%。‘13-3’與對照相似,以酯類和萜類為主,丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸甲酯、乙酸己酯是主要酯,蘇合香烯、D-檸檬烯、α-法尼烯是主要萜,而‘P3’和‘新農’以醛類和萜類為主,己醛和反-2-己醛是主要的醛。果皮中揮發性成分的含量顯著高于果肉(P<0.05)。果皮中總酚、總黃酮的含量分別是對照的2.31—2.65倍和1.23—1.61倍,果肉中分別是對照的5.53—16倍和1.43—3.49倍,3種自由基清除能力也顯著高于對照。果皮的總酚、總黃酮含量均高于果肉,且抗氧化活性也遠高于果肉,‘13-3’的總酚、總黃酮及抗氧化能力最高。【結論】3個供評價的品系材料均屬于新疆紅肉蘋果中的高酸類型;低可溶性糖、高蘋果酸、高檸檬酸、低總糖蘋果酸比,以及特征香氣成分己醛、2-己烯醛、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸乙酯在其獨特的風味品質決定中有重要作用,‘P3’和‘新農’屬“青香型”蘋果,‘13-3’屬“果香型”。供試品系風味特征鮮明、營養價值高,是研究風味品質及選育功能性加工蘋果的良好材料,其中‘13-3’的表現最優。
    基于HRM獲得與桃Tssd緊密連鎖的SNP標記
    魯振華,牛良,張南南,崔國朝,潘磊,曾文芳,王志強
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1505-1513.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.014
    摘要 ( 162 )   HTML ( 1 )   PDF (1420KB) ( 286 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】植物中,SNP標記具有分布廣泛、分辨率高、共顯性和多態性高等特點,是遺傳研究的常用分子標記。桃全基因組測序完成,獲得了大量SNP位點。利用現有的SNP數據進行簡單、快速的SNP基因分型是基因定位、品種鑒定和圖譜構建等后續研究的基礎。文章擬建立采用高分辨率熔解曲線進行不同類型SNP的基因分型方法,以獲得與桃溫度敏感半矮生型基因緊密連鎖的分子標記。【方法】以普通生長型(ST)單株97-32-46為母本,溫度敏感半矮生型單株03-94-2(Tssd)為父本進行人工雜交,利用其分離群體96個后代單株為研究材料。在定位目標基因的區間內開發連鎖和不同類型的SNP標記的基礎上,采用高分辨率熔解曲線進行SNP的基因分型并獲得與目標性狀緊密連鎖的SNP標記。【結果】明確了DNA模板和Mg2+是影響基因分型的關鍵因子,并確立了反應體系最佳濃度區間。在15 µL反應體系中模板DNA的量低于5.0 ng時或Mg2+濃度低于1.6 µmol·L-1時則不能完成PCR擴增和基因分型;根據親本基因型和表型一致的SNP位點設計引物,擴增片段長度在140 bp左右。高分辨率熔解曲線分析可對由單個核苷酸變異引起的4種不同類型的SNP(A/T、A/G、A/C和C/G)進行基因分型,并正確區分了溫度敏感半矮生型和普通生長型,與進行Sanger測序鑒定的結果一致。采用96孔板對溫度敏感半矮生型和普通生長型各48個分離后代單株進行了PCR擴增和基因分型,確定了遺傳距離。分型結果表明高分辨率熔解曲線分析技術可以將96個樣雜交后代單株分為溫度敏感半矮生型和普通生長型2種,正確地區分了A/A基因型和A/T基因型。在96個樣品中僅1個沒有成功擴增,在溫度敏感半矮生型和普通生長型中各存在1個重組單株。獲得與溫度敏感半矮生型基因緊密連鎖的SNP標記,遺傳距離為2.11 cM。【結論】建立了基于高分辨率熔解曲線分析的SNP基因分型。盡管高分辨率熔解曲線分析技術無法區分兩種不同純合類型的SNP變異,但仍不失為區分已知變異SNP的有效方法。在已經獲得桃大量SNP的基礎上,該體系可用于桃的基因定位、遺傳多樣性和品種鑒定等研究。
    食品科學與工程
    蠟質玉米淀粉凝膠的凍融穩定性
    寧吉英,顧豐穎,高萍萍,曹晶晶,羅其琪,王鋒
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1514-1524.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.015
    摘要 ( 161 )   HTML ( 2 )   PDF (1464KB) ( 336 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】采用多次凍融循環(FTC)處理手段,研究蠟質玉米淀粉凝膠與凍融穩定性相關的物性變化,為蠟質玉米淀粉在冷凍食品中的推廣應用提供科學支撐。【方法】以一個普通玉米淀粉樣品(YM)為對照、兩個蠟質玉米淀粉樣品(WCS1、WCS2)為研究對象,采用離心過濾方法測定淀粉凝膠的析水率;差示掃描量熱儀(DSC)測定淀粉凝膠的糊化焓、回生焓、冰晶熔化焓;Brabende黏度儀測定淀粉凝膠的糊化特性;物性測試儀測定蠟質玉米淀粉凝膠的質構特性;流變儀測定淀粉凝膠的凝膠動態黏彈性;掃描電子顯微鏡(SEM)觀察淀粉凝膠截面的微觀結構。【結果】析水率測定結果顯示首次FTC后,WCS表現超強持水能力,其中WCS2持水能力最強,析水率為5.75%,而YM持水能力最弱,析水率超過50%。隨著凍融循環次數的增加,淀粉凝膠的回生率和冰晶熔化焓均逐漸增大,且1、3、5次FTCs之間差異顯著,說明多次凍融使淀粉的回生程度和可凍結水含量增加。WCS的回生率在首次FTC時達到17%—18%,而YM的在40%—50%。WCS的冰晶熔化焓在首次FTC時達到540 J·g-1左右,而YM的在555 J·g-1左右。5次FTCs后淀粉凝膠硬度均發生明顯的增大,其中WCS凝膠硬度較小(45—100 g),遠低于YM淀粉凝膠硬度(440 g左右)。凝膠動態黏彈性結果顯示隨著凍融次數的增加,淀粉凝膠的tanδ均逐漸降低,但WCS的tanδ值始終大于YM的,表明WSC凝膠較黏軟。WCS的糊化特性也表明其在冷卻過程中不易老化。5次FTCs后的淀粉凝膠結構均發生明顯變化,WCS凝膠形成的網絡結構較不規則,淀粉壁出現的孔道不明顯且相互黏連纏繞;YM凝膠形成比較致密的網絡狀結構,結構較規則,淀粉壁出現的孔道完整,淀粉壁光滑。【結論】蠟質玉米淀粉凝膠經凍融處理后,其抵抗由溫度波動造成的不良物理變化的能力強,比普通玉米淀粉凝膠的凍融穩定性好,本研究結果對蠟質玉米淀粉在冷凍食品中的應用具有重要參考價值。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    輪牧方式對荒漠草原灘羊牧食特征、體重及繁殖性能的影響
    周靜靜,馬紅彬,周瑤,王麗,牛佳偉,沈艷,許冬梅
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1525-1534.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.016
    摘要 ( 133 )   HTML ( 1 )   PDF (425KB) ( 217 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】合理的放牧方式對維持草地生態系統平衡具有重要意義。研究輪牧方式對灘羊牧食特性、體重及繁殖性能的影響可為草地放牧管理提供依據。【方法】以寧夏面積最大的荒漠草原為對象,在載畜率為0.75 只/hm2水平下,設置連續放牧(CG)、二區輪牧(TG)、四區輪牧(FG)、六區輪牧(SG)4個處理。采用跟群全天觀察法測定灘羊的牧食習性,利用差額法測定采食量,采用常規方法測定草群和灘羊攝入牧草營養成分,每個輪牧周期結束觀測灘羊的體重,統計放牧期間繁殖性能等。【結果】放牧全天,灘羊采食時間占據了主體,比例達64%以上。隨輪牧分區增加,灘羊采食、游走站立時間下降(P<0.05),反芻臥息時間增加(P<0.05);排泄、爭斗、瘙癢、啃食異物等其他行為受個體行為影響更大,所占時間比例不到1.4%。草地牧草采食量表現為四區與六區輪牧無明顯差異(P>0.05),但均高于連續放牧和二區輪牧,連續放牧采食量最低(P<0.05);草地采食率呈現連續輪牧>二區輪牧>四區輪牧>六區輪牧的趨勢,連續放牧達到39.06%,六區輪牧僅為27.9%;灘羊日采食量在二區、四區、六區輪牧方式下差異不大(P>0.05),在連續放牧區最低(P<0.05)。灘羊攝入的牧草的粗蛋白、粗脂肪、磷的含量總體高于草群相應養分含量,而粗纖維和鈣低于草群養分含量,粗灰分和無氮浸出物比較接近,說明灘羊具有選食蛋白質含量高, 粗纖維含量低牧草的能力;隨輪牧分區增加,灘羊攝入的牧草粗蛋白含量呈下降趨勢、粗纖維呈上升變化,但灘羊攝入干物質、粗蛋白和磷的總量增加;各處理下灘羊營養攝入量均超出了美國NRC綿羊飼養標準,說明暖季灘羊放牧不需要補飼。放牧期間,灘羊體重和日增重以連續放牧最低(P<0.05),二區、四區及六區輪牧間無顯著差異(P>0.05);各處理下灘羊產羔率、羔羊平均初生重等繁殖性能接近,說明在適宜載畜率水平下,輪牧方式對灘羊繁殖性能影響不大。【結論】輪牧方式對灘羊牧食特征和增重產生了影響,相對于連續放牧,隨輪牧分區增加,草地牧草采食率、灘羊采食時間和攝入的牧草粗蛋白含量下降,但草地采食量,灘羊日采食量及攝入的干物質、粗蛋白等營養物質總量增加。劃區輪牧沒有提高灘羊繁殖性能,但更有利于灘羊體重增加。若僅考慮灘羊牧食特征、增重性能以及生產中放牧管理的便利性,二區輪牧方式是寧夏荒漠草原灘羊暖季的最優放牧方式。
    捻轉血矛線蟲Hc-daf-22基因的原核表達及重組蛋白酶活性測定
    鄭秀平,丁豪杰,郭筱璐,楊怡,黃艷,陳學秋,周前進,杜愛芳
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1535-1542.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.017
    摘要 ( 103 )   HTML ( 1 )   PDF (792KB) ( 238 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)是反芻動物主要的胃腸道線蟲之一,該病在中國呈全國性流行。為研究捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)脂肪酸代謝相關蛋白DAF-22的生化特性,對其基因進行了克隆、原核表達,并對重組蛋白進行了體外酶活性測定。以期了解捻轉血矛線蟲Hc-DAF-22蛋白在過氧化物酶體脂肪酸β氧化中的作用。 【方法】 根據NCBI公布的H. contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(GenBank:HQ738470.1)設計特異性引物,克隆Hc-daf-22基因并構建重組質粒pET-22b-Hc-daf-22, 經測序鑒定正確后將其轉化E. coli BL21,經終濃度為0.1 mmol·L-1 IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)誘導表達4h,離心菌液,50 mmol·L-1濃度的PBS溶液重懸菌體溶液,冰浴超聲破碎后上清沉淀分別進行SDS-PAGE分析。超聲破碎后產物以鎳柱親和色譜法分離純化重組蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE檢測蛋白純化情況及以抗His血清作為一抗Western Blot鑒定。純化后蛋白用超濾管濃縮除去鹽分,并按照蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定。利用天然狀態下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子會發生酮-烯醇互變形成烯醇化合物特性,酶活試驗以乙酰乙酰輔酶a為底物建立標準曲線。硫解酶體外測活體系為(50 mmol·L-1 Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L-1 MgCl2,60 μmol·L-1 CoA,10 μmol·L-1 AcAc-CoA,加入約0.1 μg蛋白),通過記錄反應過程中由于底物(AcAc-CoA)的減少而引起303 nm波長下的吸收值的變化,從而計算出硫解反應的初始反應速率,最終確定復性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同條件下,取AcAc-CoA底物濃度為10 μmol·L-1的反應體系(50 mmol·L-1 Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L-1 MgCl2,60 μmol·L-1 CoA,10 μmol·L-1 AcAc-CoA,加入約0.1 μg蛋白于室溫起始反應),分別調節反應體系的溫度及pH梯度,確定Hc-DAF-22最佳酶活反應溫度及pH條件。【結果】成功克隆Hc-daf-22基因,測序結果與NCBI已公布的H. contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比對基因相似度為99.9%,并實現重組子pET-22b-Hc-daf-22在E. coli BL21體內進行表達,表達產物經 SDS-PAGE和Western Blot檢測顯示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大腸桿菌中成功表達,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量約為59 kD,測得蛋白濃度為1.70 μg·μL-1;針對該表達產物的酶活分析結果表明,原核表達的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最適反應pH為8.0,最佳反應溫度為37℃,酶學常數Km值和Vmax值分別為33.765 μmol·L-1和1 784 nmol·L-1·min-1。【結論】捻轉血矛線蟲DAF-22是過氧化物酶體脂肪酸β氧化的關鍵酶之一,本試驗通過體外酶活試驗成功測定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,證明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但與秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性較低。
    研究簡報
    綿羊卵丘-卵母細胞復合體石蠟切片技術的改良
    李海軍,于泊洋,段云嬌,劉星宇,翁婭政,杜晨光,王秀梅
    中國農業科學. 2017, 50(8):  1543-1550.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.018
    摘要 ( 140 )   HTML ( 1 )   PDF (2774KB) ( 237 )   收藏
    參考文獻 | 相關文章 | 多維度評價
    【目的】在綿羊有腔卵泡發育過程中,多層卵丘細胞緊密包繞著卵母細胞形成卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊結構,存在于卵泡腔內。卵泡成熟后,綿羊COC從卵泡內排出,進入輸卵管,等待受精。現有的卵丘-卵母細胞復合體蛋白鑒定技術,或者將包含各級卵泡的卵巢組織直接進行切片處理,或者將COCs從卵泡內分離,在完整卵丘-卵母細胞復合體水平上進行免疫染色。但這兩種方法在檢測綿羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表達時,存在顯著缺陷。研究旨在對常規石蠟組織切片技術進行改進,以期滿足綿羊COCs蛋白鑒定需求。【方法】首先采用抽吸法從綿羊有腔卵泡內獲得COCs,以石蠟包埋方式人為構建了一種可以進行切片處理的“包含多枚綿羊卵丘-卵母細胞復合體的仿組織結構”。然后以該特殊結構與健康綿羊卵巢組織為研究對象,分別采用改良與傳統的石蠟組織免疫化學技術流程,檢測了目的蛋白,尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator, uPA)與其受體(urokinase-type plasminogen activator recepter, uPAR),在綿羊COCs中的表達情況,比較了兩種技術的免疫染色效果與染色流程差異。【結果】將所構建的綿羊COCs仿組織結構與正常綿羊卵泡組織,進行石蠟組織切片處理,經切片、貼片與脫蠟等步驟,分別形成了散在分布于載玻片上的COCs薄片與包含卵泡的卵巢組織薄層(厚度5µm)。經間接免疫染色處理后,結果顯示:?目的蛋白在兩種結構COCs中的表達是一致的,即uPAR在綿羊卵丘與卵母細胞上都有表達,而uPA只存在于綿羊卵丘細胞中;?在綿羊COCs薄片結構中,COCs整體形態完好,卵母細胞與外圍卵丘細胞層次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄層結構中,綿羊卵泡內壁顆粒細胞與COCs等形態結構相對完整,卵母細胞蛋白定位清楚,但是卵丘細胞層次與蛋白表達較不清晰;?與綿羊卵巢組織石蠟切片技術相比較,綿羊COCs仿組織結構石蠟切片技術,在固定、脫水、透明、浸蠟以及脫蠟等步驟的處理時間都大大縮短,例如固定處理由24h縮短為2h;由逐級脫水的10h縮短為兩級脫水的1h;透明由30min縮短為10min;軟蠟與硬臘浸入由原來的6h縮短為1h;由逐級脫蠟的25min縮短為兩級脫蠟的10min等。【結論】改進后的COCs仿組織石蠟切片染色技術,顯示更優質的免疫定位與染色效果,不僅具有COCs獲得率高、卵母與卵丘細胞形態層次清晰等優點,而且顯著縮短了操作時間,簡化了操作流程。該技術在保留COCs結構完整的基礎上,有效檢測了目的蛋白在綿羊卵丘-卵母細胞復合體中的表達模式,對于探明綿羊卵泡發育與卵母細胞成熟機制,具有重要意義。
福利彩票3d开奖结果