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當期目錄

    2017年 第50卷 第16期 刊出日期:2017-08-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    Ath-miR169d介導的擬南芥葉片發育的分子調控機制
    張敏,朱明,李文宗,馬潔,劉悅萍,江海洋,王磊,徐妙云
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3063-3070.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.001
    摘要 ( 76 )   HTML ( 2 )   PDF (877KB) ( 333 )   收藏
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    【目的】探究ath-miR169d在擬南芥葉片發育過程中的作用,明確其調控的分子機制,為增強葉菜類植物的光合效率以及增加生物量和提高作物產量提供理論依據。【方法】選取ath-miR169d過表達和降低表達的擬南芥轉基因株系,以及野生型擬南芥,在22℃、相對濕度60%、16 h/8 h光周期條件下培養,觀察不同生長階段葉片發育表型的差異;同時構建pmiR169d::GUS表達載體,轉化農桿菌EHA105,并利用蘸花法轉化野生型擬南芥(Columbia,Col-0),獲得轉基因擬南芥,利用GUS染色對ath-miR169d在擬南芥不同組織器官中的表達模式進行研究;選取8周齡的過表達材料和野生型對照株系,對其葉片表皮細胞形態進行掃描電鏡分析;對4周齡過表達材料和野生型對照株系的幼苗頂端分生組織和葉片中總IAA進行定量分析,并進行基因芯片表達譜分析,篩選差異表達基因;通過實時熒光定量PCR對生長素信號途徑部分差異表達關鍵基因的表達情況進行分析。【結果】Ath-miR169d過表達擬南芥株系蓮座葉數目較野生型少,葉片小,而ath-miR169d降低表達的擬南芥株系的蓮座葉較野生型多,葉片大,且在抽薹和種子成熟之后還持續長出新葉,而野生型蓮座葉則在種子成熟之后逐漸衰老干枯;掃描電鏡觀察到ath-miR169d過表達擬南芥株系葉片中表皮細胞小于野生型;表達模式分析表明,ath-miR169d主要在頂端分生組織(shoot apical meristem,SAM)和葉片維管系統中表達,且新葉中表達強。SAM是產生生長素的部位,IAA測定結果表明ath-miR169d過表達擬南芥株系中IAA含量顯著降低,為野生型植株的38.6%,同時基因芯片表達譜分析也驗證了ath-miR169d參與調控植物體內激素信號轉導途徑。進一步研究發現,ath-miR169d過表達株系中生長素合成關鍵基因YUC2和轉運體蛋白基因PIN1均顯著下調表達,而具有轉錄抑制功能的生長素響應因子1和2基因(ARF1ARF2)表達上調;STTM miR169d低表達株系中這4個基因的表達則為相反趨勢,該結果與觀察到的表型相一致。【結論】Ath-miR169d通過介導生長素信號途徑參與了擬南芥葉片發育的調控,ath-miR169d表達量發生變化會影響葉片的數量和大小,最終影響整個植株的生物量。
    谷子轉錄因子SiNAC18通過ABA信號途徑正向調控干旱條件下的種子萌發
    竇祎凝,秦玉海,閔東紅,張小紅,王二輝,刁現民,賈冠清,徐兆師,李連城,馬有志,陳明
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3071-3081.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.002
    摘要 ( 99 )   HTML ( 3 )   PDF (1087KB) ( 197 )   收藏
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    【目的】谷子(Setaria italica L.)具有顯著耐旱性。研究旨在通過反向遺傳學方法分析并鑒定在干旱條件下影響植物萌發過程的重要調控因子,為研究作物干旱條件下種子萌發的調控機制創造條件。【方法】使用ClustalX 2.0和MEGA 5.05軟件對谷子SiNAC18蛋白序列及其同源序列進行多序列比對,并構建系統進化樹;利用real-time PCR方法檢測SiNAC18在不同脅迫條件下的表達模式;通過瞬時轉化的方法分析SiNAC18蛋白亞細胞定位;在擬南芥中過表達SiNAC18,分析SiNAC18的生物學功能;分析SiNAC18在轉基因擬南芥中可能控制的下游基因。【結果】SiNAC18全長1 074 bp,編碼由357個氨基酸組成的親水性蛋白,分子量約為38.8 kD;系統進化樹分析表明SiNAC18屬于NAC轉錄因子家族第Ⅰ組的NAP亞組,與擬南芥基因AtNAC29同源性最高;氨基酸序列比對結果顯示,SiNAC18與其他物種包括水稻、擬南芥、大豆和玉米中同源性最高的NAC類轉錄因子蛋白的N端都具有A、B、C、D和E這5個保守結構域,蛋白C端具有高度多態性,證明SiNAC18的N端序列與其結合下游基因啟動子元件相關;real-time PCR結果顯示,SiNAC18在干旱(PEG)、ABA、高鹽(NaCl)及過氧化氫(H2O2)處理條件下的表達量明顯上升;亞細胞定位結果表明SiNAC18蛋白定位于細胞核中;基因功能分析結果顯示,在ABA和PEG脅迫處理下,SiNAC18轉基因擬南芥與野生型種子的萌發率存在明顯差異:在正常生長條件下,野生型擬南芥WT和SiNAC18轉基因擬南芥的萌發率基本一致,在PEG濃度為10%和15%的MS培養基上,SiNAC18轉基因擬南芥的萌發率顯著高于WT。在2和5 μmol·L-1 ABA處理條件下,轉基因擬南芥的萌發率顯著低于WT;下游基因表達分析結果顯示,ABA信號途徑相關基因AtRD29A,脯氨酸合成相關基因AtP5CR和AtPRODH以及過氧化物酶基因AtPRX34在SiNAC18轉基因株系中的表達量高于WT中的表達量,表明SiNAC18通過調控這些下游基因影響轉基因植物在干旱條件下的萌發率。【結論】谷子NAC類轉錄因子基因SiNAC18可能通過ABA信號途徑、氧化脅迫調控等途徑正向調控植物在干旱條件下的萌發過程。
    大豆組成型三重反應基因GmCTR1的克隆與功能分析
    張楠楠,薛冬,崔曉霞,趙晉銘,郭娜,王海棠,邢邯
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3082-3091.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.003
    摘要 ( 92 )   HTML ( 1 )   PDF (977KB) ( 402 )   收藏
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    目的】植物激素乙烯參與植物的生長發育以及生物與非生物脅迫過程。組成型三重反應基因CTR1作為乙烯受體下游一個負調控因子,結合乙烯受體共同參與乙烯的信號轉導途徑。本研究通過對大豆(Glycine max)的組成型三重反應基因CTR1進行克隆和誘導表達分析,以及在大豆發狀根中過表達該基因后進行疫霉根腐病的抗性分析,探究CTR1在大豆與疫霉菌互作過程中的功能。【方法】利用同源克隆的方法,以擬南芥的AtCTR1序列為探針,在大豆基因組數據庫中搜索同源性最高的基因即為大豆的GmCTR1Glyma.13G151100),并從Williams82中將GmCTR1克隆出來。對GmCTR1進行多重序列比對、系統進化分析和疫霉菌的誘導表達分析。構建植物過表達載體pBinGFP2: GmCTR1。應用發根農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得大豆發狀根,經GFP熒光篩選得到大豆過表達GmCTR1的陽性發狀根和轉入空質粒的陰性對照發狀根。對過表達GmCTR1發狀根和陰性對照發狀根侵染疫霉菌后,檢測病斑長度、疫霉生物量和抗性相關基因的表達。【結果】根據同源序列比對結果,將與擬南芥AtCTR1AT5G03730)同源性最高(75.3%)的大豆基因Glyma.13G151100命名為GmCTR1,從Williams82中克隆得到GmCTR1的CDS序列。該基因的CDS序列全長2 511 bp,編碼836個氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,蛋白質量為92.35 kD,等電點為6.51。多重序列比對結果顯示,GmCTR1氨基酸具有CTR1同源蛋白的典型結構域和關鍵特征。構建系統發育樹進行進化分析發現,GmCTR1與菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的CTR1親緣關系十分相近,在同一個分支上,且與菜豆的親緣關系最近。熒光定量PCR結果表明,在大豆疫霉菌P6497侵染后,GmCTR1受誘導逐漸上調表達,在侵染48 h后表達水平達到最高,隨后表達量降低。利用酶切連接方法將GmCTR1的CDS序列構建到植物過表達載體pBinGFP2中,PCR和酶切驗證獲得了重組質粒pBinGFP2: GmCTR1。對發狀根接種疫霉菌后發現,過表達GmCTR1減弱了對疫霉根腐病的抗性,疫霉菌侵染36 h后過表達發狀根與對照相比病斑長度顯著增長。過表達GmCTR1發狀根中疫霉菌的生物量與對照相比增加,與大豆抗病反應相關基因的表達水平顯著降低。【結論】GmCTR1在大豆與疫霉菌的互作過程中發揮一定的負調控作用。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    施氮量對間作小麥蠶豆根系分泌槲皮素和橙皮素的影響
    劉英超,肖靖秀,湯利,鄭毅
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3092-3100.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.004
    摘要 ( 69 )   HTML ( 1 )   PDF (407KB) ( 115 )   收藏
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    【目的】系統探討間作條件下,不同施氮水平不同生育期小麥和蠶豆根系分泌槲皮素和橙皮素的動態變化及累積特征,為進一步探明間作增產控病機制提供依據。【方法】通過盆栽試驗,采用小麥與蠶豆根系尼龍分隔(MB)和塑料分隔(PB)兩種間作種植模式,測定間作小麥蠶豆不同氮水平(低氮1/2N:常規施氮量的一半;常規施氮N;高氮3/2N:常規施氮量的1.5倍)條件下,不同生育期根系分泌槲皮素和橙皮素數量。【結果】施氮水平和間作體系根系不同分隔方式影響作物生物量和根冠比。隨著施氮量增加,小麥和蠶豆生物量增加45%—62.5%和3.2%—18.9%,根冠比降低33.8%—47.3%和11.8%—26.9%;與塑料分隔相比,相同施氮水平條件下,作物生長60 d時,尼龍分隔小麥和蠶豆生物量分別提高4.2%—25%、19%—38.6%,隨生長天數增加差異逐漸不顯著。間作根系不同分隔方式和施氮量均能影響小麥蠶豆根系槲皮素和橙皮素的分泌量。隨施氮量增加,小麥蠶豆槲皮素和橙皮素分泌量減少,與低氮條件相比,常規施氮和高氮條件下,小麥槲皮素分泌量減少了23.4%和62.3%,橙皮素分泌量減少了32.2%和64.5%;蠶豆槲皮素分泌量減少了35.4%和44.1%,橙皮素減少了11.9%和23.9%。相同氮水平條件下,尼龍分隔小麥蠶豆槲皮素和橙皮素分泌量高于塑料分隔,低氮和常規施氮條件下,尼龍分隔小麥槲皮素的分泌量分別高于塑料分隔15.3%和27.1%,橙皮素的分泌量分別高于塑料分隔21%和13.7%;蠶豆根系尼龍分隔槲皮素分泌量高于塑料分隔34.6%和56.6%,橙皮素高于塑料分隔16.9%和5.1%;高氮條件下兩種根系分隔方式之間差異不顯著。【結論】間作根系不同分隔方式影響小麥和蠶豆根系槲皮素和橙皮素的分泌,但這種影響受施氮水平的調控,低氮和常規施氮條件下,尼龍分隔小麥和蠶豆根系槲皮素和橙皮素分泌量高于塑料分隔,高氮條件下差異不顯著。
    基于開花期衛星遙感數據的大田小麥估產方法比較
    譚昌偉,杜穎,童璐,周健,羅明,顏偉偉,陳菲
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3101-3109.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.005
    摘要 ( 83 )   HTML ( 3 )   PDF (296KB) ( 535 )   收藏
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    【目的】衛星遙感具有覆蓋范圍廣、獲取速度快、信息量大、動態性強等優勢,能夠及時準確地獲取作物產量信息,反映作物產量空間變化趨勢。遙感技術作物估產已成為現代農業生產中研究熱點。通過改善遙感估產建模方法,以實現進一步提高大田作物遙感估產精度,為宏觀了解不同區域作物產量形成情況及變化趨勢提供直觀、可靠的參考。【方法】論文結合2011—2012年江蘇省大豐、興化、姜堰、泰興、儀征5個縣區的定點觀測試驗,以國產衛星產品HJ-1A/1B影像為遙感數據,于小麥開花期開展大田定位觀測區衛星遙感植被指數、關鍵生長指標與收獲期單產間的定量分析。通過對產量與小麥生長指標以及植被指數進行定量關系分析,進一步增強遙感反演的機理性和重演性。將衛星遙感變量與小麥產量進行相關關系分析作為遙感估產的直接建模方法,間接建模方法則是選取與產量相關性較好的遙感變量以及與遙感變量相關性較好的主要苗情指標,利用篩選得到的敏感遙感變量,首先監測對應的小麥生長指標,結合該小麥生長指標與產量間的定量關系,進而建立間接估產模型,利用此模型進行小麥遙感間接估產。利用直接和間接建模方法,以相關性最高為原則,篩選估算產量的敏感衛星遙感變量。以2012年試驗數據為建模樣本,采用線性回歸分析方法,分析小麥開花期苗情指標、產量與衛星遙感變量兩兩之間的相關性,分別構建以遙感植被指數為基礎的大田小麥估產模型,與地面實測結果一起建立模型共同分析。以2011年試驗數據為驗證樣本,選取評價指標擬合度(R2)和均方根誤差(RMSE),對兩類模型的估算精度進行驗證和比較,以提高遙感反演的定量化水平和可信度。【結果】分別以差值植被指數(difference vegetation index,DVI)和比值植被指數(ratio vegetation index,RVI)為基礎的單因子直接估產模型的均方根誤差(root mean square error,RMSE)為918 kg·hm-2和1 399.5 kg·hm-2,以DVI和RVI遙感變量構建雙變量估產模型的RMSE為1 036.5 kg·hm-2,以歸一化植被指數(normalized difference vegetation index,NDVI)和葉片氮積累量為基礎構建的間接估產模型的RMSE為805.5 kg·hm-2,說明開花期HJ-1A/1B影像估算小麥區域產量是可行的,且精度較高;經比較,以NDVI和葉片氮積累量為基礎的間接估產模型精度明顯高于直接估產模型,相較于DVI直接估產模型RMSE降低了112.5 kg·hm-2,相較于RVI直接估產模型RMSE降低了594 kg·hm-2,相較于雙因子模型RMSE降低了231 kg·hm-2。【結論】國產衛星HJ-1A/B可以較好滿足估測小麥產量要求,且利用間接方法建立作物遙感估產模型要好于直接方法,研究結果為利用遙感技術更為準確估算大田小麥產量提供了一種新的途徑。
    局部恢復供水對苗期玉米生長、根系吸收能力及解剖結構的影響
    牛曉麗,胡田田,張富倉,段愛旺,劉戰東,申孝軍
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3110-3121.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.006
    摘要 ( 85 )   HTML ( 2 )   PDF (581KB) ( 267 )   收藏
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    【目的】作物對局部灌溉的響應研究已受到廣泛關注,能否采用局部灌溉還需考慮局部灌溉前的土壤水分狀況。研究水分虧缺后局部恢復供水下玉米生長、水分吸收的動態變化以及補償效應的生理機制有重要意義。【方法】以聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG-6000)調控營養液的滲透勢模擬水分虧缺,采用分根技術,通過水培試驗模擬前期水分虧缺后局部根區恢復供水,設置3個水分虧缺程度(-0.2、-0.4、-0.6 MPa)和1個對照(無PEG),于處理后0、0.25、0.5、1、3、5、7、9 d連續動態監測各根區根系的生長和導水率狀況,玉米干物質累積以及葉水勢。并在此基礎上,于處理后0、1、5、9 d連續動態測定對照和-0.2 MPa兩個處理各根區根系解剖結構特征。【結果】水分虧缺6 d后局部恢復供水,恢復供水區根干重和導水率平均增長速率顯著大于持續脅迫區(P<0.05);-0.2 MPa虧缺后局部恢復供水下,0—0.25 d時,恢復供水區根干重平均增長速率較對照明顯增大(P<0.05),且持續到局部恢復供水后5 d,表現出根系生長的補償效應;-0.4和-0.6 MPa虧缺后局部恢復供水處理分別于0.25—0.5 d和0.5—1 d時恢復供水區根干重平均增長速率較對照明顯增大(P<0.05),產生根系生長的補償效應,可見,根系生長的補償效應發生隨水分虧缺程度增大而延遲;-0.2 MPa虧缺后局部恢復供水5 d時,恢復供水區根系導水率平均增加速率恢復到對照水平,產生根系吸水的補償效應,繼續增大虧缺程度或延長恢復供水時間,補償效應均消失,說明局部恢復供水有效刺激恢復供水區根系吸水補償效應的臨界水分虧缺程度為≥-0.2 MPa。此外,-0.2 MPa虧缺后局部恢復供水5 d,恢復供水區根系直徑與導管直徑顯著小于1 d(P<0.05),但仍維持或超過對照水平,皮層厚度占根系直徑的比例與對照無顯著差異(P>0.05),9 d時,根系直徑與導管直徑明顯減小(P<0.05),較對照減小19%,皮層厚度占根系直徑的比例仍顯著大于對照(P<0.05),與根系吸水補償效應的產生與消失同步,從根系解剖結構特征方面揭示了恢復供水區根系吸水補償效應的生理機制。【結論】局部恢復供水可有效刺激恢復供水區根系生長和吸水的補償效應,但與局部恢復供水前水分虧缺程度和局部恢復供水時間有關,恢復供水區根系解剖結構的變化是補償效應產生或消失的一個生理機制。該研究可為更好的發揮局部灌溉在農業節水中的作用提供理論依據。
    植物保護
    中國79個小麥品種(系)抗條銹病評價及基因分子檢測
    黃亮,劉太國,肖星芷,屈春艷,劉博,高利,羅培高,陳萬權
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3122-3134.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.007
    摘要 ( 86 )   HTML ( 5 )   PDF (948KB) ( 362 )   收藏
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    【目的】了解中國小麥品種的條銹病抗性水平,掌握條銹病抗性基因的分布與利用情況,加強小麥品種的合理應用,促進品種布局與推廣,延長品種使用年限,保障小麥生產安全。【方法】在溫室中采用條銹菌CYR32、CYR33、G22-9、G22-14對中國小麥主產區的79個小麥品種(系)進行苗期抗性鑒定,噴霧接種的幼苗在(10±1)℃的黑暗保溫桶中保濕12—18 h,取出置于白天16—18℃,夜晚14—16℃溫室中,光周期為L﹕D=16 h﹕8 h,15 d后按0—9級分級標準進行調查;在河北廊坊大田中采用條銹菌CYR32、CYR33對79個小麥品種(系)進行成株期抗性鑒定,接種適期為小麥拔節期,接種前3 d灌水確保田間土壤溫度。采用1 g夏孢子﹕300 mL礦物油的條銹菌夏孢子懸浮液噴霧接種誘發行感病品種銘賢169,待礦物油晾干后,噴水并覆塑料薄膜保濕12—16 h,待充分發病后調查病害的普遍率、嚴重度和侵染型,調查兩次,以最高等級作為病情發病的級數;利用小麥抗條銹病基因Yr5Yr10Yr18Yr261B/1R易位系的相應分子標記Wmc175F/R、SC200F/R、csLv34 F/R、We173 F/R和AF1/AF4對供試小麥進行分子檢測;結合系譜分析、抗病性鑒定和分子檢測結果分析確定參試小麥品種的抗性基因情況。【結果】在所有的參試小麥品(系)中,苗期對CYR32和CYR33均具有抗性的16份,占20.3%;對條銹菌致病類型G22-9和G22-14均具有抗性的4份,占5.1%;對CYR32、CYR33、G22-9和G22-14這4個小種均具有抗性的4份,占5.1%;成株期對CYR32和CYR33表現中抗及以上水平的24份,占30.4%;對CYR32表現全生育期抗性的12份,占15.2%;對CYR33表現全生育期抗性的16份,占20.3%;對CYR32和CYR33均表現全生育期抗性的11份,占14.0%。苗期對4個菌系均具有抗性并且成株期對CYR32和CYR33表現中抗或以上水平的共4份,占5.1%。結合系譜分析、抗病性鑒定和分子檢測結果得出,供試小麥品種中4份攜帶Yr5,占5.1%;8份攜帶Yr10,占10.1%;3份攜帶Yr18,占3.8%;僅1份攜帶Yr26,占1.3%;35份攜帶1B/1R,占44.3%;4份攜帶2個抗性基因;遠豐139攜帶Yr5Yr10Yr26。【結論】中國主產麥區的79個小麥品種(系)對當前條銹菌流行小種抗性水平普遍較低,1B/1R易位系使用率依然較高,在今后的育種工作中應加大Yr5Yr18等有效抗性基因的利用,育成多基因聚合的有效持久抗性品種,進一步減少對1B/1R易位系的使用。
    玉米大斑病菌環腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表達分析
    申珅, 李貞楊, 趙玉蘭, 李盼, 韓建民, 郝志敏, 董金皋
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3135-3144.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.008
    摘要 ( 49 )   HTML ( 2 )   PDF (677KB) ( 176 )   收藏
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    【目的】獲得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)環腺苷酸磷酸二酯酶(cAMP phosphodiesterase, PDE)基因,并分析其在病菌侵染結構發育過程及侵染寄主早期階段中的表達,為深入探索cAMP信號途徑調控病菌致病性的作用機制打下基礎。【方法】根據釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、綠僵菌(Metarhizium anisopliae)和黑曲霉(Aspergillus niger)6種真菌PDE基因的保守序列,利用簡并引物PCR對基因保守片段進行擴增,結合RACE和Genome Walking技術獲得基因全長及其側翼序列;利用MEGA 5.0軟件對PDE蛋白預測編碼產物進行多重序列比對,并采用鄰近法構建系統發育樹;利用GSDS分析基因結構,ProtParam分析理化性質,SOMPA預測二級結構,SMART數據庫在線分析保守結構域;收集人造疏水介質誘導下侵染結構發育不同時期以及侵染感病寄主葉片不同時間的玉米大斑病菌材料,利用qRT-PCR技術研究StPDE在病菌侵染結構形成過程中不同階段的轉錄水平。【結果】玉米大斑病菌基因組中存在1個高親和力磷酸二酯酶基因(StH-PDE)和1個低親和力磷酸二酯酶基因(StL-PDE)。其中,StH-PDE全長3 208 bp,包含5個內含子和6個外顯子,ORF為2 898 bp。StL-PDE全長5 054 bp,包含4個內含子和5個外顯子,ORF為3 090 bp。StH-PDE和StL-PDE分別含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型cAMP磷酸二酯酶催化結構域。不同的植物病原真菌中PDE同源基因分別呈現出高度的相似性,其中,StH-PDE與Magnaporthe griseaCordyceps militarisMetarhizium acridum等病原真菌的高親和力磷酸二酯酶基因聚于同一進化支,StL-PDE與Ascochyta rabiri、Scedosporium apiospermumFusarium oxysporumMetarhizium album等病原真菌的低親和力磷酸二酯酶基因聚于相同進化支。人造疏水介質誘導下,與菌絲相比,StH-PDE和StL-PDE在分生孢子中的表達水平均顯著上調,其中StH-PDE和StL-PDE分別上調了約2倍和52倍。孢子萌發初期兩個基因表達水平顯著下調,隨著萌發的進行,表達水平緩慢回升,至附著胞形成階段,基因表達出現了第2次高峰,隨后表達水平再次下調。在整個過程中,StH-PDE的最高表達水平則出現在附著胞形成時期,達到了菌絲體中的近7倍、分生孢子中的近2倍,而StL-PDE的表達水平始終低于其在分生孢子中的表達水平。StH-PDE和StL-PDE在病菌侵染寄主過程中的表達水平變化趨勢與其在人工疏水介質誘導下的表現基本一致。在孢子萌發早期表達顯著下調,隨著時間延長,緩慢回升,至接種后18和24 h StH-PDE表達水平上調,超過萌發初期。【結論】在病菌侵染結構發育過程中,StH-PDE和StL-PDE均呈現下調-上調-下調的表達水平變化趨勢。StH-PDE在附著胞時期表達水平最高,StL-PDE在分生孢子中的相對表達水平最高。
    異色瓢蟲3個小分子熱激蛋白序列及低溫誘導表達分析
    汪慧娟,趙靜,施佐堃,邱玲玉,王甦,張帆,王世貴,唐斌
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3145-3154.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.009
    摘要 ( 70 )   HTML ( 2 )   PDF (378KB) ( 153 )   收藏
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    【目的】異色瓢蟲(Harmonia axyridis)是一種重要的捕食性天敵昆蟲,廣泛應用于農林害蟲的生物防治中。本研究旨在分析探索低溫脅迫條件對3個小分子熱激蛋白(small heat shock protein,sHSP)抗寒基因相對表達量的影響,為異色瓢蟲低溫冷藏及其抗寒機制研究提供科學依據。【方法】在轉錄組獲得異色瓢蟲基因序列的基礎上,根據特異性引物獲得HaHSP47.74(基因登錄號:KX161871)、HaHSP21.53(基因登錄號:KX161873)和HaHSP21.52(基因登錄號:KX161874)基因cDNA的開放閱讀框序列(open reading frame,ORF),采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)技術測定異色瓢蟲3個sHSP基因在不同發育階段、短時降溫和短時降溫后恢復處理、低溫儲存處理下以及不同色斑的表達水平。【結果】在不同發育階段處理中,HaHSP47.74HaHSP21.53在蛹期及成蟲期高表達;HaHSP21.52在4齡幼蟲第4天表達量顯著高于對照組。在短時降溫處理中,HaHSP47.74在降溫至0℃和-5℃時表達量顯著高于對照組;HaHSP21.53HaHSP21.52在降溫過程中表達量顯著降低。在短時降溫后恢復處理中,3個sHSP基因表達量無顯著差異。在低溫儲藏條件下,實驗種群:黑底雌瓢蟲HaHSP47.74表達水平在儲存第5天時顯著升高,黃底雌瓢蟲HaHSP47.74在儲存5—15 d時表達量顯著升高;黑底雌瓢蟲HaHSP21.53在儲存5—20 d時顯著性高表達,黃底雌瓢蟲HaHSP21.53在15 d時顯著性高表達;黑底和黃底雌瓢蟲HaHSP21.52無顯著性高表達;越冬種群:黑底和黃底雌瓢蟲HaHSP47.74HaHSP21.53HaHSP21.52在低溫儲存中均無顯著性高表達。【結論】sHSP在異色瓢蟲發育階段可能發揮著作用。短時降溫脅迫能夠誘導sHSP基因高表達。實驗種群在低溫儲存條件下HaHSP47.74HaHSP21.53均出現了顯著性高表達,表明這兩個基因在瓢蟲受到冷馴化時起到了作用。此外,不同色斑型異色瓢蟲的抗寒機制和抗寒能力有所差異。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    石灰性紫色水稻土不同土壤深度中厭氧氨氧化細菌對施肥的響應
    王鎣燕, 盧圣鄂, 李躍飛, 涂仕華, 張小平, 辜運富
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3155-3163.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.010
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    【目的】研究長期不同施肥處理對水稻土厭氧氨氧化細菌anaerobic ammonium oxidation bacteria, AAOB)群落結構和垂直分布特征的影響,深入認識不同施肥處理下石灰性紫色水稻土厭氧氨氧化作用的微生物調控機制,為該地區科學施肥、培肥地力提供理論依據。【方法】利用化學分析、末端限制性片段長度多態性分析(T-RFLP)和熒光定量PCR技術分別對不同施肥處理下石灰性紫色水稻土理化性質、厭氧氨氧化細菌豐度及群落結構進行分析。【結果】理化性質結果顯示,相對于無肥處理(CK),氮(N)、氮磷鉀肥(NPK)及氮磷鉀配施農家肥(NPKM)均會降低土壤pH和硝態氮含量,而增加土壤有機質、全氮和銨態氮含量。隨土壤深度增加,土壤pH增加,全氮和硝態氮含量降低,銨態氮含量變化趨勢不明顯。qPCR結果顯示,就土壤層次而言,厭氧氨氧化細菌在0—20 cm層的豐度最高,20—40 cm層最低;就施肥處理而言,氮肥(N)對厭氧氨氧化細菌的豐度促進最為明顯。T-RFLP結果表明,厭氧氨氧化細菌在0—20 cm土層群落組成最為豐富,Shannon-wiener多樣性指數最高;寡氮肥下其群落組成最為簡單,無肥處理下群落結構最為復雜。厭氧氨氧化細菌優勢種群屬于Candidatus Brocadia。冗余梯度分析(RDA)顯示,pH影響是石灰性紫色水稻土厭氧氨氧化細菌群落結構差異的主要環境因子。【結論】本研究顯示寡氮處理會降低石灰性紫色水稻土中厭氧氨氧化細菌的多樣性但促進其豐度。表層土(0—20 cm)是厭氧氨氧化細菌分布的主要層次。
    長期施肥對休閑季土壤呼吸溫度敏感性的影響
    張彥軍
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3164-3174.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.011
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    【目的】在農作物-休閑輪作系統中,研究長期施肥條件下休閑季土壤呼吸溫度敏感性(Q10)的變化機理,為科學調控黃土高原雨養區的農田溫室氣體排放提供依據。【方法】依托長武農田生態試驗站的長期定位施肥試驗,在小麥收獲后的休閑季測定不同施肥處理下(CK、N、NP、M、NPM)的土壤呼吸速率、土壤溫度、土壤水分、底物的數量 (土壤有機碳和根茬碳)和質量 (土壤碳氮比和根茬碳氮比,依次簡寫為土壤C﹕N和根茬C﹕N),研究長期施肥影響休閑季Q10變異的機理。【結果】在休閑季,不同施肥處理下的土壤呼吸速率差異顯著 (P<0.05),長期施肥導致土壤呼吸速率增加了6%—127%。土壤溫度、土壤水分、底物的數量和質量均是影響土壤呼吸速率的重要因素(P<0.05)。土壤溫度對土壤呼吸速率的影響,利用指數關系模型進行擬合 (P<0.05),且土壤溫度可以解釋40%—57%的土壤呼吸變異性。而土壤呼吸速率對土壤水分的響應則用拋物線關系模型進行擬合(P<0.05),且土壤水分可以解釋56%—74%的土壤呼吸變異性。同時,底物的數量和質量對土壤呼吸速率的影響,利用線性關系模型進行模擬(P<0.05),且底物的數量和質量可以解釋高達66%—94%的土壤呼吸變異性。長期單施氮肥處理(N)對土壤有機碳影響不顯著(P>0.05),而NP、M和NPM處理下的土壤有機碳則增加了12%—36%。同時,N處理下的根茬碳減少了34%, 而NP、M和NPM處理下的根茬碳則增加了15%—63%。N和NP處理下的土壤C﹕N影響不顯著(P>0.05),而M和NPM處理下的土壤C﹕N則增加了12%—13%。不同施肥處理下的根茬C﹕N則降低了8%—38%。在休閑季,長期施肥導致Q10降低了12%—56%,而長期施肥處理下Q10的差異與底物的數量(土壤有機碳和根茬碳)和質量(土壤C﹕N和根茬C﹕N)或者二者的交互作用密切相關(P<0.05)。Q10隨著底物數量和土壤C﹕N的增加均呈現出線性降低的趨勢(P<0.05),且底物的數量和土壤 C﹕N可以解釋61%—95%的Q10變異性,而Q10隨著根茬C﹕N的增加呈現出線性增加的趨勢(P<0.05),且根茬C﹕N可以解釋72%的Q10變異性。同時對Q10的貢獻呈現出根茬碳>根茬C﹕N>土壤有機碳>土壤C﹕N的趨勢(2.16 vs. 1.22 vs. 0.48 vs. 0.03)。【結論】在農作物-休閑輪作系統中,長期施肥通過影響底物的數量和質量影響休閑季Q10的變化,對科學評價黃土高原雨養區的農田溫室氣體排放具有重要意義。
    長期施用氮磷肥對旱地冬小麥籽粒產量和鋅含量的影響
    惠曉麗,王朝輝,羅來超,馬清霞,王森,戴健,靳靜靜
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3175-3185.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.012
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    【目的】小麥是中國北方地區的主要糧食作物,主要種植在低鋅的石灰性土壤上,其籽粒鋅含量普遍偏低,因此小麥籽粒鋅營養強化是近年研究的熱點。小麥氮磷與鋅的吸收利用存在互作效應。利用從2004年起在中國西北旱地潛在缺鋅的石灰性土壤上開展的長期定位試驗,研究長期氮磷施用下的小麥產量與鋅含量的變化。【方法】田間試驗采用完全隨機區組設計,設不施肥(CK)、單施氮肥(N160,施160 kg N·hm-2)、單施磷肥(P100,施100 kg P2O5·hm-2)和氮磷配施(N160P100,施160 kg N·hm-2100 kg P2O5·hm-24個處理。于2012—2016年連續4年進行田間取樣,分析小麥的生物量、產量、產量構成,及鋅含量與鋅吸收和分配。【結果】與不施肥相比,長期單施氮肥使小麥穗數降低9%,籽粒產量和地上部生物量均降低12%,而籽粒鋅含量由不施肥處理的29.4 mg·kg-1提高到42.8 mg·kg-1,提高幅度為46%,籽粒和地上部的鋅吸收量分別增加29%和37%,地上部的氮鋅比和磷鋅比分別降低13%和45%;長期單施磷肥使小麥穗數、籽粒產量和地上部生物量分別增加18%、15%和16%,籽粒鋅含量、籽粒和地上部的鋅吸收量卻分別降低31%、19%和17%,同時地上部的氮鋅比和磷鋅比分別提高19%和83%;氮磷配施的小麥穗數、籽粒產量和地上部生物量也顯著增加,增加幅度分別為40%、46%和38%,籽粒和地上部的鋅吸收量還分別提高36%和34%,但籽粒的鋅含量僅降低8%,同時地上部的氮鋅比和磷鋅比分別提高43%和27%。與單施磷肥相比,氮磷配施不僅提高了籽粒產量,還提高了籽粒鋅含量,主要原因是施用氮肥能夠增加小麥鋅吸收,減緩了磷肥對小麥鋅吸收的抑制作用。【結論】在生產實踐中,單施氮肥雖可以提高小麥籽粒的鋅含量,達到食物鋅營養強化的目的,但長期單施氮肥會導致土壤養分不平衡,不利于維持和提高小麥產量。長期單施磷肥雖能夠提高小麥籽粒產量,但抑制小麥鋅吸收,不利于籽粒鋅累積,降低籽粒含量。因此,在黃土高原旱地石灰性土壤上,建議合理進行氮磷配施,以保證小麥生產高產優質。
    園藝
    外源褪黑素對干旱脅迫下番茄葉片光合作用的影響
    楊小龍,須暉,李天來,王蕊
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3186-3195.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.013
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    【目的】褪黑素是一種廣泛存在于高等植物體內的小分子物質,被認為是一種新的植物生長調節劑和生物刺激劑,對于提高植物抗逆性具有重要作用。探索外源褪黑素對干旱脅迫下番茄葉片光合作用的影響,為揭示褪黑素調節植物抗逆性的機制打下基礎。【方法】以番茄‘遼園多麗’為試材,首先采用葉片噴施和根施不同濃度褪黑素進行預處理:CK:葉片噴施清水、根施50 mL清水;R5、R50、R100、R150、R250:葉片噴清水,分別根施50mL 5、50、100、150和250 µmol?L-1褪黑素;L5、L50、L100、L150、L250:根施50 mL清水,葉片分別噴施5、50、100、150和250 µmol?L-1褪黑素;連續處理3 d后將植株移至溫室中,以不澆水作為干旱處理(其中CK0:葉片噴施清水、根施50 mL清水預處理后正常澆水,CK1:葉片噴施清水、根施50 mL清水預處理后干旱處理)。干旱脅迫5 d后,通過比較暗適應下PSII最大光化學量子產量Fv/Fm和PSI最大氧化狀態Pm,確定根施和葉片噴施的最佳濃度處理。然后利用光合熒光同步測量系統分析根施和葉片噴施褪黑素對干旱脅迫下番茄葉片氣體交換參數,PSII和PSI的光能分配和電子傳遞速率,類囊體膜的完整性和ATP酶活性的調節。【結果】根施和葉片噴施不同濃度褪黑素均提高了干旱脅迫下番茄葉片的Fv/Fm和Pm,并且隨濃度增加表現出先升高后降低的趨勢,L100和R100處理下的Fv/Fm和Pm最大,顯著高于對照。L100和R100顯著緩解了干旱脅迫對氣體交換參數的抑制,其中葉片凈光合速率(Pn)分別為2.04和1.71 µmol?m-2?s-1,顯著高于對照(CK1)(0.52 µmol?m-2?s-1);蒸騰速率(E)分別為0.66和0.54 mmol?m-2?s-1,顯著高于CK1(0.25 mmol?m-2?s-1),并且顯著提高了番茄葉片氣孔導度(GH2O)和最大水分利用效率(WUE),降低了氣孔限制值(Ls),而L100優于R100處理。快速光響應曲線結果表明L100和R100處理提高了干旱脅迫下番茄幼苗PSII的光化學反應效率Fv'/Fm'及PSII光化學淬滅系數qP,表明褪黑素處理更利于干旱脅迫下番茄葉片PSII光化學反應的高效進行;干旱脅迫下番茄幼苗環式電子傳遞速率得到顯著加強,而L100和R100處理降低了環式電子傳遞速率,但加強了線性電子傳遞速率,且L100處理下番茄葉片ETRI和ETRII均高于R100處理;L100、R100處理提高了干旱脅迫下番茄葉片的Y(I)、Y(II),表明褪黑素處理有利于干旱脅迫下番茄葉片吸收光能向光化學反應的方向分配;暗適應后,L100和R100處理番茄葉片P515誘導曲線均高于CK1,照光后,CK0處理番茄幼苗P515信號快速下降,其次是L100和R100處理,而CK1處理降低較慢,表明褪黑素具有保護葉綠體類囊體膜和ATP合成酶免受干旱脅迫傷害的作用。【結論】根施和葉片噴施外源褪黑素能緩解干旱脅迫對番茄幼苗光合性能的抑制,加強光合運轉效率,而葉片噴施是一種更簡單高效的處理方式;褪黑素能加強作物光合作用對環境脅迫的適應性,對于農作物的生長發育具有調節作用。
    超表達蘋果細胞分裂素響應基因MdCRF6影響花青苷積累和鹽脅迫抗性
    安建平,宋來慶,趙玲玲,由春香,王小非,郝玉金
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3196-3204.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.014
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    【目的】克隆蘋果細胞分裂素響應因子基因MdCRF6(cytokinin response factor 6),鑒定其在調節花青苷積累和鹽脅迫抗性中的作用,揭示MdCRF6的功能,為研究細胞分裂素信號途徑和果樹生長發育調控提供理論依據。【方法】以‘嘎啦’蘋果(Malus domestica‘Gala’)為研究材料,利用同源序列比對和PCR技術,分離細胞分裂素響應基因MdCRF6。使用MEGA 5.0軟件構建蘋果MdCRF6與擬南芥CRFs間系統進化樹;通過SMART軟件和DNAMAN軟件分析MdCRF6蛋白的保守結構域。利用實時熒光定量PCR方法檢測該基因對細胞分裂素和鹽脅迫的響應。通過電泳遷移率試驗(EMSA),驗證MdCRF6原核表達蛋白對DRE作用元件的綁定。構建MdCRF6植物超表達載體,并通過農桿菌介導的遺傳轉化獲得轉MdCRF6蘋果愈傷組織。比較野生型和轉基因蘋果愈傷組織在花青苷積累和鹽抗性方面的差異,結合基因表達分析,初步鑒定MdCRF6在調節花青苷積累和鹽脅迫方面的生物學功能。【結果】分離得到了蘋果細胞分裂素響應因子基因MdCRF6(基因序列號:MDP0000783818),該基因開放閱讀框(ORF)為1 047 bp,編碼含有348個氨基酸的蛋白。進化樹分析和氨基酸序列比對結果表明,蘋果MdCRF6蛋白在N端包含保守的CRF結構域,在C端包含保守的AP2/ERF結構域,并且與擬南芥AtCRF6同源性最高。基因表達分析顯示該基因具有細胞分裂素和鹽脅迫響應,分別在10 μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 NaCl處理3 h和6 h時表達量最高。EMSA試驗結果驗證MdCRF6原核表達蛋白能夠綁定DRE序列。在蘋果愈傷組織中超表達MdCRF6,發現MdCRF6轉基因蘋果愈傷組織花青苷積累受到抑制,同時蘋果愈傷組織的抗鹽性降低。基因表達分析顯示,MdCRF6顯著抑制花青苷合成基因和鹽響應相關基因的表達。【結論】蘋果MdCRF6與擬南芥AtCRF6具有高度的同源性,其參與植物對細胞分裂素和鹽脅迫的響應。在蘋果愈傷組織中超量表達MdCRF6抑制其花青苷積累,降低植物抗鹽性。推測蘋果MdCRF6可能通過結合花青苷合成基因以及抗鹽相關基因的啟動子,抑制基因的表達,從而負調節花青苷積累和抗鹽性。
    食品科學與工程
    不同類型桃果肉酚類物質及抗氧化活性分析
    盧娟芳,劉盛雨,蘆旺,席萬鵬
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3205-3214.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.015
    摘要 ( 136 )   HTML ( 4 )   PDF (665KB) ( 425 )   收藏
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    【目的】探討不同類型桃果肉中酚類物質組成、含量及其抗氧化活性的差異,為桃的品質育種和科學利用提供參考。【方法】以水蜜桃、蟠桃和油桃3種類型共15個品種的桃果肉為試驗材料,使用高效液相色譜法(high performance liquid chromatograph,HPLC)檢測各品種中的酚類物質,采用1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy,DPPH)、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid diammonium salt,ABTS)自由基清除能力和鐵離子還原能力(Ferric reducing/antioxidant power,FRAP)3種方法測定抗氧化能力,并利用相關性分析酚類物質與抗氧化活性的關系。【結果】供試品種總酚與總黃酮含量的變異范圍分別為0.35—2.54 mg CHA·g-1 FW和0.08—3.32 mg RE·g-1 FW。整體上蟠桃總酚及總黃酮含量高于水蜜桃和油桃,‘早露蟠桃’的含量最高。3種類型桃果實中共檢測到酚酸6種(沒食子酸、香草酸、原兒茶酸、阿魏酸、新綠原酸、綠原酸)和類黃酮4種(兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素)。表兒茶素、兒茶素、綠原酸和新綠原酸在桃果實中的含量最為豐富,不同類型桃果實的酚類物質組成與含量明顯不同。其中,水蜜桃以表兒茶素和綠原酸為主,變異范圍為37.57—105.49 µg·g-140.19—49.8 µg·g-1;蟠桃以表兒茶素、綠原酸、新綠原酸和兒茶素為主,變異范圍分別為35.94—297.32 µg·g-136.14—80.57 µg·g-11.45—29.26 µg·g-10—44.64 µg·g-1;油桃以綠原酸和兒茶素為主,變異范圍為30.97—48.05 µg·g-19.22—53.73 µg·g-1。DPPH清除速率、ABTS和FRAP值分別為0.21—7.01 µmol TE·g-1 FW、0.66—8.57µmol TE·g-1 FW和0.59—5.60µmol TE·g-1 FW,綜合抗氧化指數依次為:蟠桃>水蜜桃>油桃。供試品種中,‘早露蟠桃’多酚含量與抗氧化能力最高。總酚、總黃酮、新綠原酸、表兒茶素與DPPH清除速率、FRAP及ABTS均呈極顯著的正相關關系(P<0.01)。【結論】不同類型桃果實中酚類物質及抗氧化能力差異較大,表兒茶素和綠原酸是水蜜桃的主要酚類物質,表兒茶素、兒茶素、綠原酸和新綠原酸是蟠桃的主要酚類物質,綠原酸、兒茶素是油桃的主要酚類物質。蟠桃的酚類物質含量和抗氧化能力均高于水蜜桃和油桃,表兒茶素和綠原酸在桃果實抗氧化能力中起著重要的作用。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    牦牛DGAT1基因多態性及其與乳質性狀關聯分析
    高小莉,胡江,郭淑珍,石斌剛,謝建鵬,羅玉柱,王繼卿,牟永娟
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3215-3225.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.016
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     【目的】檢測牦牛DGAT1基因多態性,評估基因突變對牦牛乳品質性狀的影響,以期豐富牦牛重要經濟性狀的分子遺傳研究基礎。【方法】采用PCR-SSCP方法,檢測甘南牦牛、天祝白牦牛、青海牦牛及野血牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17區突變,分析基因突變對乳品質性狀的影響。【結果】牦牛DGAT1基因intron5-exon7區發現c.562+32_c.562+33insCCGCCC的插入/缺失,等位基因M、基因型MM頻率最高為優勢等位基因和基因型,各類群牦牛PIC<0.5屬中度或低度多態;intron15-exon17區檢測到c.1249-23CT和c.1336C>T的突變,其中exon17發現的c.1336C>T突變導致編碼氨基酸p.Arg447Cys轉變,等位基因A頻率最高為優勢等位基因,甘南牦牛、天祝白牦牛和青海牦牛中基因型AA為優勢基因型,野血牦牛基因型AB為優勢基因型,各類群牦牛0.25<PIC<0.5屬中度多態;兩區域3處突變位點構建出6種單倍型和11種單倍型組合,突變位點間存在連鎖關系且接近于連鎖平衡。關聯分析表明,甘南牦牛intron5-exon7區基因型與乳質性狀無顯著相關intron15-exon17區基因型BB個體乳品質性狀最低,且乳蛋白率、乳脂率、總固體物質含量中顯著低于其他基因型個體(P0.05);攜帶等位基因A的個體乳蛋白率、乳脂率、總固體物質含量及無脂固體含量顯著高于未攜帶者(P0.05),攜帶等位基因C的個體乳脂率也顯著高于未攜帶者(P0.05),而攜帶等位基因B的個體乳脂率、總固體物質含量顯著低于未攜帶者(P0.05);單倍型組合H1H3個體的乳蛋白率、乳脂率、總固體物質含量和無脂固體物質含量均較高,且乳脂率及總固體物質含量顯著高于其他單倍型組合(P0.05),而H2H2單倍型組合個體則較低,除乳糖率以外的其他乳品質性狀均顯著低于其他7種單倍型組合(P<0.05)。【結論】牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17區為低度和中度多態,intron6存在c.562+32_c.562+33insCCGCCC的插入/缺失,intron15和exon17分別檢測到c.1249-23C>T突變和c.1336C>T的非同義突變。intron15-exon17區突變影響甘南牦牛乳品質性狀,選留攜帶等位基因A的個體和淘汰攜帶等位基因B的個體、或選留H1H3單倍型組合及淘汰H2H2單倍型組合個體,均可顯著改善后代群體的乳品質。
    蘇博美利奴羊胎兒皮膚毛囊結構及形態發育研究
    阿布來提·蘇來曼,田月珍,許琴,何軍敏,趙冰茹,徐新明,付雪峰,熱娜古麗·艾尼瓦爾江,黃錫霞,田可川
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3226-3235.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.017
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    【目的】研究蘇博美利奴羊毛囊的組織結構與形態發育過程,為解析細毛羊毛囊發育的分子調控機制奠定組織學基礎。【方法】采用石蠟切片技術分析胎齡為第65、85、105和135天的蘇博美利奴羊胎兒頭部、頸側、頸上緣、鬐甲、背部、體側、肩甲、腹部、薦部及股部等10個不同部位皮膚的組織學特性。【結果】蘇博美利奴羊毛囊結構同其它動物一樣,由毛球、連接組織鞘、外根鞘、內根鞘和毛干等幾部分組成。在胎齡65d時初級毛囊(primary follicles, PF)已經發生形成毛芽,毛芽延長,繼續向真皮層深入,形成柱狀結構,通過由大量真皮細胞在末端聚集,形成帽子結構,各部位表皮均形成完整的結構。胎齡85d時毛囊上部形成一個膨大部,在毛乳頭上方形成錐形結構,毛球基本形成,毛乳頭長度明顯大于寬度;在初級毛囊基底部可見次級毛囊(secondary follicles ,SF)的囊泡結構,并形成皮脂腺原始細胞。在胎齡105d時次級毛囊大量形成,伴隨著初級毛囊毛芽伸長,次級毛囊毛芽向真皮層深入,毛乳頭直徑逐漸增大,皮脂腺開始形成;原始次級毛囊頸部隆突部開始再分化出再分化次級毛囊(secondary-derived follicles ,SD),并可見汗腺,毛管發育完整;已形成完整的毛囊群結構,主要為三元毛囊群,每個毛囊群由1—3個初級毛囊和圍繞其周圍的幾個次級毛囊組成。胎齡135d時大量形成再分化次級毛囊,形成成熟的汗腺,大部分初級毛囊和部分次級毛囊發育成熟,毛囊形成角質化毛干并穿出體表。【結論】蘇博美利奴羊胚胎皮膚初級毛囊約50—55d開始形成;胎齡65—75d是初級毛囊形成的重要時期;胎齡80—85d是次級毛囊形成期,此時期,初級毛囊大量形成;胎齡105—135d是次級毛囊大量再分化,再分化次級毛囊形成及發育的關鍵時期。為了解蘇博美利奴羊毛囊的結構及毛囊從發生到發育成熟的形態變化過程,為相關領域研究提供參考依據。
    家蠶組織蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鑒定、表達及其功能分析
    潘光照,張奎,李重陽,趙羽卒,申利,徐曼,蘇晶晶,林西,崔紅娟
    中國農業科學. 2017, 50(16):  3236-3246.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.018
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    【目的】鑒定克隆家蠶組織蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表達特征。分析家蠶組織蛋白酶L在大腸桿菌誘導下mRNA表達量的變化趨勢,為進一步研究家蠶組織蛋白酶L的功能打下基礎。【方法】基于家蠶基因組數據庫(SilkDB)中序列BGIBMGA006893設計引物,利用RACE技術克隆家蠶組織蛋白酶L基因的cDNA全長序列,通過在線工具對基因結構和蛋白質分子量及等電點進行預測;在NCBI數據庫下載其他物種組織蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0 軟件進行同源比對并構建進化樹。運用RT-PCR和qRT-PCR對其時空表達特征進行分析。選取該基因的特異性片段,經PCR擴增,測序驗證后將其連接至pET-28載體,轉化至Rosseta感受態表達菌株,經IPTG在適宜溫度條件下誘導,獲得組織蛋白酶L重組蛋白。然后再利用鎳離子親和層析法對該蛋白進行純化,獲得純度較高的重組蛋白。最后利用大腸桿菌對家蠶血液系統進行攻毒,檢測家蠶組織蛋白酶L基因的表達水平。【結果】通過查詢家蠶基因組數據庫和生物信息學分析得出,家蠶組織蛋白酶L基因定位于家蠶第10號染色體上,基因編號為BGIBMGA006893, nscaf2860。基因開放閱讀框全長687 bp,編碼228個氨基酸,含有保守的Pept_C1結構域。通過在線網站預測,得出該蛋白酶的分子量為26.132 kD,等電點為4.57。進化分析表明該基因與同為鱗翅目昆蟲的草地貪夜蛾和黑脈金斑蝶親緣關系最為接近。RT-PCR顯示該基因集中表達于血細胞,在血液不同齡期也較高表達。用His抗體檢測經純化后的蛋白,最終成功孵育出純化后的蛋白條帶;大腸桿菌個體攻毒免疫試驗檢測顯示,其mRNA表達水平隨攻毒時間呈現拋物線式的顯著性變化規律,從而揭示出BmCat L與家蠶免疫系統的關聯性。【結論】克隆獲得家蠶組織蛋白酶L基因的cDNA序列,發現其特異性高表達于血細胞。通過原核表達和蛋白純化成功獲得了該基因的重組蛋白。大腸桿菌的刺激能夠顯著上調其表達,推測組織蛋白酶L可能參與家蠶免疫反應。
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