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當期目錄

    2018年 第51卷 第2期 刊出日期:2018-01-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    貴紫麥1號籽粒色素形成相關基因的差異表達
    徐熙,任明見,李魯華,楊喜翠,徐如宏
    中國農業科學. 2018, 51(2):  203-216.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.001
    摘要 ( 163 )   HTML ( 5 )   PDF (3293KB) ( 401 )   收藏
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    【目的】探明貴紫麥1號小麥灌漿期變紫后和變紫前2個時期籽粒的轉錄組差異,發掘影響貴紫麥1號花青素合成的關鍵基因和關鍵酶,豐富小麥籽粒色素轉錄組數據信息,為轉錄因子的克隆及表達提供參考。【方法】利用Illumina Hiseq 2000TM高通量測序技術對貴紫麥1號籽粒變紫前和變紫后2個時期進行轉錄組測序、文庫構建及建庫質量評估,對測序結果進行信息學分析。采用TTM對read count數據進行標準化處理,隨后用DEGseq進行差異分析,設定q-value<0.005且|log2 (fold change)|>1為閾值。通過篩選分析,獲得兩者間差異表達基因,按照無參轉錄組分析方法,對差異表達基因進行BLAST搜索,Nr數據庫比對,GO功能富集及KEGG pathway分析,找出與花青素相關的關鍵基因和關鍵酶,并結合qRT-PCR驗證所找到的關鍵基因及關鍵酶在不同時期的表達水平,掌握這些關鍵基因的信息。【結果】測序結果表明,貴紫麥1號變紫后和變紫前分別獲得13.36 G和12.69 G的clean bases,clean reads為106 906 108條和101 547 534條,占原始序列的93.73%和94.90%。通過Trinity軟件對所得clean reads進行拼接,共獲得170 396條轉錄本,長度為119 020 625。拼接clean reads后獲得119 572條Unigenes。在BLAST搜索中,119 572個高質量獨特序列中有86 004條(71.92%)Unigenes與現有基因模型具有至少1個顯著匹配。在Nr數據庫比對結果鑒定了至少5種具有與來自節節麥、烏拉爾圖小麥、二穗短柄草、大麥、小麥等已知基因同一性且序列相似性高的Unigenes。KOG數據庫比對結果顯示,注釋成功的基因按KOG的26個group進行分類,注釋在一般功能基因,蛋白質翻譯后修飾與轉運、分子伴侶及翻譯、核糖體結構與生物合成等類別基因所占比重較大,分別為15.79%、14.51%和10.54%。643個差異基因中,236個呈上調趨勢,407個呈下調趨勢。GO注釋表明,按照基因參與的生物過程、所處的細胞組分、具有的分子功能下一層級分類,共44個分類,差異基因顯著富集在碳水化合物代謝過程(GO:0005975,16.03%)、應激反應(GO:0006950,10.83%)和水解酶活性分子功能(GO:0016787,34.84%)等類別中。KEGG pathway富集分析可知,353個差異基因富集到153條相關通路上,其中淀粉與蔗糖代謝、苯丙素生物合成、類黃酮生物合成等通路富集顯著。類黃酮生物合成途徑相關基因共66個,2條相關上調表達Unigenes,涉及查爾酮酶、隱色花色素雙加氧酶2個關鍵酶基因,log2(fold change)分別為3.4164和2.1258。對所得關鍵基因進行qRT-PCR驗證,證實查爾酮酶、隱色花色素雙加氧酶在貴紫麥中1號中表達量呈明顯上調趨勢,與轉錄組測序分析結果一致,測序結果可靠度高。【結論】比較分析貴紫麥1號籽粒變紫后和變紫前2個時期轉錄組測序結果,獲得大量Unigenes數據及差異表達基因相關信息,明確類黃酮代謝途徑中2個關鍵酶基因(CHS和ANS)在調控貴紫麥1號籽粒花青素合成過程中作用顯著。
    過表達酵母PAC1增強轉基因大豆對大豆花葉病毒的抗性
    牛陸,趙倩倩,楊靜,邢國杰,張偉,賀紅利,楊向東
    中國農業科學. 2018, 51(2):  217-225.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.002
    摘要 ( 87 )   HTML ( 5 )   PDF (1991KB) ( 197 )   收藏
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    目的】大豆花葉病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是中國大豆產區最主要的病害之一,嚴重影響大豆產量和籽粒品質。核糖核酸酶PAC1能夠識別和降解植物RNA病毒或類病毒復制過程中產生的dsRNAs,從而有效抑制病毒在寄主中的復制與積累。PAC1的這一特點為廣譜抗RNA病毒及類病毒轉基因作物的創制和培育提供了有效的靶標基因。本研究利用轉基因技術,將來源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1導入栽培大豆,研究過表達PAC1對大豆SMV抗性的影響,為抗SMV轉基因大豆新品種選育提供依據。【方法】采用酶切連接技術,將PAC1連接到雙元表達載體pCAMBIA3300中,構建植物表達載體pCAMBIA3300-PAC1。目的基因啟動子為組成型強啟動子CaMV 35S,終止子為NOS,篩選標記為草銨膦抗性基因BAR。采用農桿菌介導轉化法,將PAC1導入栽培大豆品種Williams82。在利用PAT/BAR試紙、PCR及除草劑(500 mg·L-1 Basta噴施檢測基礎上,通過Southern雜交技術進一步分析外源基因在轉基因大豆中的整合情況和拷貝數。采用人工摩擦接種法,對T2和T3代轉基因大豆株系進行田間抗SMV鑒定農藝性狀調查,分析轉基因大豆對SMV抗性及遺傳穩定性。并利用qRT-PCR技術分析接種SMV 28 d后轉基因大豆中SMV積累水平。【結果】共轉化2 600多個外植體,獲得耐草銨膦(5 mg·L-1)大豆再生植株76株。PCR檢測結果表明,其中65株能夠擴增出目的條帶,大豆遺傳轉化效率為2.48%。對T1—T3代轉基因大豆株系噴施除草劑表明,在500 mg·L-1 Basta處理7 d后,轉基因植株表型沒有明顯變化,而對照(非轉基因大豆)植株葉片則黃化枯死。Southern雜交結果表明,外源基因以低拷貝的方式(1—2個)整合至大豆基因組中。摩擦接種SMV SC-3鑒定表明,在接種35 d后,對照出現嚴重花葉、皺縮等典型SMV發病癥狀,而轉基因大豆僅部分葉片表現出輕微的花葉癥狀,其病情指數降低至11.11—22.22,較對照(病情指數36.81—46.24)顯著降低SMV抗性在轉基因大豆不同代際間能夠穩定遺傳。qRT-PCR分析表明,在接種SMV SC-3株系28 d后,轉基因大豆中SMV CP表達水平較對照極顯著下降。農藝性狀調查表明,在未接種SMV條件下,轉基因大豆在葉形、花色、種皮色、種臍色、株高、節數、結莢高度、生育期及百粒重等方面與對照沒有顯著差異。【結論】PAC1過表達顯著抑制了SMV的積累及癥狀發展,增強了轉基因大豆對SMV的抗性水平
    紫花苜蓿秋眠性的SSR標記關聯分析
    劉希強,張涵,王學敏,儀登霞,王贊
    中國農業科學. 2018, 51(2):  226-232.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.003
    摘要 ( 115 )   HTML ( 6 )   PDF (1112KB) ( 236 )   收藏
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    【目的】發掘紫花苜蓿秋眠性關聯位點,為揭示紫花苜蓿秋眠性狀的遺傳規律和分子機制提供理論依據。【方法】紫花苜蓿關聯群體由75份321個四倍體紫花苜蓿基因型構成,其中中國紫花苜蓿品種每份材料選取6—8個基因型;其余材料每份選取3—4個基因型。利用紫花苜蓿基因組均勻分布的85對SSR(Simple sequence repeats)標記,對321個紫花苜蓿基因型進行掃描。于2014—2015年連續兩年對紫花苜蓿秋眠性開展調查,并利用一般線性模型(GLM)及混合線性模型(MLM)2種方法,開展秋眠性與SSR分子標記的關聯分析。【結果】紫花苜蓿秋眠性表現出極顯著的基因型、年際及基因型×年際互作效應。2014年,表型變異幅度為5.1—55.1 cm,平均值為22.4 cm,變異系數為45.5%。2015年,變異幅度在3.5—44.9 cm,平均為15.2 cm,變異系數為43.7%。秋季株高兩年均呈現接近正態分布特征。廣義遺傳力為0.71。MLM模型很好的控制了紫花苜蓿秋眠性的假陽性關聯。基于MLM模型,在2014年共找到12個顯著關聯的SSR位點,表型貢獻率為2.42%—6.73%。2015年共找到11個,表型貢獻率為2.45%—4.81%。在這些關聯位點中,分布于Chr 2的m83_157、Chr 3的m525_230和m525_231、及Chr 4的m429_245,在兩種模型及兩年內均被重復檢測到。【結論】通過兩種模型發掘到4個與紫花苜蓿秋眠性顯著相關的位點,經過驗證后可以用于紫花苜蓿秋眠性分子標記輔助選擇育種。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    交替溝灌玉米灌漿期莖流影響因子敏感性分析與模型適用性研究
    杜斌,胡笑濤,王文娥,馬黎華,周始威
    中國農業科學. 2018, 51(2):  233-245.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.004
    摘要 ( 93 )   HTML ( 4 )   PDF (732KB) ( 473 )   收藏
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    【目的】應用人工神經網絡對不同處理玉米莖流進行精準預測,為推算玉米蒸騰耗水量以及制定合理的灌水方案提供新思路。【方法】試驗研究對象為夏玉米,品種為西農985。試驗設置3個處理,分別為交替溝灌高水處理(alternate furrow irrigation,AFI1)、交替溝灌低水處理(alternate furrow irrigation,AFI2)和常規溝灌處理(conventional furrow irrigation,CFI)。AFI1、AFI2每次灌水量為CFI灌水量的2/3和1/2。利用通徑系數與互信息分析不同處理的影響因素與玉米莖流相關關系,基于人工神經網絡理論建立了玉米莖流速率估算模型,以主成分回歸模型為對比,對兩個模型預測精度和穩定性進行評價。【結果】(1)不同處理對環境因子的響應有所差異,影響CFI、AFI1玉米莖流的主要因素是氣象因子,影響AFI2處理玉米莖流的主要因素是土壤水分;(2)不同土層含水量對各處理莖流的影響也有所不同,研究發現10—20 cm和20—30 cm土層含水量與玉米莖流相關程度最高。利用不確定性分析法進一步分析得出,常規處理與高水處理水平下,與莖液流變化關系最密切的土壤含水層為20—30 cm,其次是10—20 cm,低水處理水平下,最敏感的土層為10—20 cm,其次是20—30 cm;(3)根據模型誤差分析與模型不確定性分析,神經網絡模型RMSE、d-factor值較小,R2值達到了0.9以上,說明神經網絡模型預測精度更高,模型更穩定。【結論】與傳統方法相比,人工神經網絡模型可以快速準確地對莖流進行預測,對指導玉米灌溉具有重要的指導意義。
    中國粒用高粱改良品種的產量和品質性狀時空變化
    李嵩博,唐朝臣,陳峰,謝光輝
    中國農業科學. 2018, 51(2):  246-256.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.005
    摘要 ( 83 )   HTML ( 12 )   PDF (888KB) ( 229 )   收藏
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    【目的】對1977—2016年粒用高粱生產現狀和審定品種的產量及品質相關性狀進行分析,以期為高粱品種選育和生產提供參考。【方法】通過查閱行業年鑒和相關文獻,統計了國家和省級審定并公開的品種324個,搜集其區試單產、穗粒重、千粒重、生育期、株高、穗長,以及品質相關性狀包括淀粉、單寧、蛋白質、賴氨酸與脂肪含量的數據。【結果】從時間演變來看,40年來審定品種數隨年份持續增加。株高呈下降趨勢,平均每年降低1.36 cm。區試單產呈顯著上升趨勢,平均每年提高69.1 kg·hm-2;淀粉和單寧含量呈顯著上升趨勢P0.05,蛋白質含量呈顯著下降趨勢P0.05,賴氨酸和脂肪含量則無顯著變化。從空間分布來看,生育期的平均值在春播早熟區、春播晚熟區、春夏兼播區和南方區的變化范圍為94—126 d;春夏兼播區的穗粒重最高(105.4 g),南方區最低(64.6 g);千粒重在春播晚熟區最高(30.3 g),南方區最低(22.6 g,分區間均表現出顯著差異(P<0.05);淀粉含量在春播早熟區和春播晚熟區較高,平均為74.2%,而脂肪含量較低,平均為3.5%;單寧在南方區含量最高(1.1%);蛋白質和賴氨酸含量在分區間無顯著性差異。【結論】建議今后品種選育把植株矮化和提高千粒重作為提高產量的重點策略,品質上向專用型發展。釀酒高粱應保證適當高淀粉含量、合理的蛋白質和脂肪含量范圍,注重提高單寧含量。而飼料高粱應保證高淀粉,注重降低單寧并提高蛋白質、賴氨酸含量。
    植物保護
    禾谷鐮孢碳源代謝調控因子FgCreA的功能
    侯瑞,王晨芳
    中國農業科學. 2018, 51(2):  257-267.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.006
    摘要 ( 82 )   HTML ( 2 )   PDF (4122KB) ( 445 )   收藏
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    【目的】敲除禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)中碳源代謝調控因子FgCreA,并對其營養生長、有性生殖和致病力等方面進行研究,為研究禾谷鐮孢中碳源代謝機制提供依據。【方法】根據酵母數據庫SGD和NCBI數據庫中的序列,利用釀酒酵母中碳源代謝調控因子Mig1確定禾谷鐮孢中的碳源調控因子FgCreA;在NCBI數據庫中檢索其他物種中碳源代謝調控蛋白,使用ClustalW2軟件進行多重序列比對,并用MEGA5軟件構建系統進化樹,同時在InterProScan網站上預測其蛋白結構域;在NCBI數據庫中檢索與禾谷鐮孢碳源吸收相關的結構基因和真菌毒素DON生物合成的相關基因,調取起始密碼子上游1 000 bp的片段,預測FgCREA基因結合位點位置;用Primer5軟件設計引物,利用Split-PCR和PEG介導原生質體轉化的方法進行基因敲除,并通過PCR和Southern blot驗證獲得FgCREA基因敲除突變體Fgcrea。根據突變體Fgcrea營養生長、有性生殖和致病力等方面的變化分析FgCREA的功能。【結果】通過生物信息學方法,明確禾谷鐮孢中只有一個碳源代謝調控因子基因FgCREA(FGSG_09715),氨基酸序列416 aa,共包含兩個保守的C2H2鋅指結構區域。FgCreA同源蛋白在各類真菌中均存在一定程度的同源性,具有較高的保守性。禾谷鐮孢碳源吸收相關結構基因(XYL2ARA1ICL1PG1SUC2)和真菌毒素DON生物合成相關基因(TRI1TRI3TRI4TRI5TRI6TRI7TRI8TRI10TRI12TRI101)啟動子區均含有FgCREA DNA結合位點。采用Split-PCR技術和PEG介導的原生質體轉化,通過PCR和Southern blot獲得并驗證了兩個FgCREA基因敲除突變體。表型觀察發現,突變體Fgcrea的生長速度與野生型相比下降90%;分生孢子形態正常,但產孢量與野生型相比降低88%;有性生殖階段,突變體Fgcrea可以產生正常的子囊殼、子囊和子囊孢子,但需要比野生型長20—28 d;突變體Fgcrea對鈉鹽較敏感,侵染小麥穗不發病。【結論】獲得禾谷鐮孢碳代謝調控因子FgCreA敲除突變體,明確FgCreA參與營養生長和有性生殖,并能夠影響致病過程。但是否影響相關結構基因的轉錄水平和DON生物合成仍需進一步驗證。
    高效離子交換色譜法分析青枯雷爾氏菌Tn5轉座子突變菌株的異質性
    鄭雪芳,劉波,朱育菁,陳德局,陳小強
    中國農業科學. 2018, 51(2):  268-278.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.007
    摘要 ( 83 )   HTML ( 2 )   PDF (1064KB) ( 120 )   收藏
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    【目的】研究青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)Tn5轉座子突變菌株的異質性,篩選出無致病力高效生防菌株。【方法】利用已構建的青枯雷爾氏菌致病力參考指標“弱化指數(attenuation index,AI)”和接種番茄植株的生物測定法對60株供試的青枯雷爾氏菌Tn5轉座子突變菌株進行致病力測定;利用高效離子交換色譜法研究不同致病力突變菌株的色譜行為異質性;構建色譜效價指數(chromatography titer index, CTIi),CTIi=Si/(S1+S2+S3)×100%(i=1、2或3;S1、S2和S3分別對應P1、P2和P3的峰面積),測定不同致病力青枯雷爾氏菌突變菌株的CTIi值,用皮爾遜相關系數(Pearson correlation coefficient,PCC)分析色譜效價指數與突變菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互關系。【結果】基于AI值和生物測定結果,青枯雷爾氏菌Tn5轉座子突變菌株具有3種不同致病力類型:強致病力、無致病力和中間型。強致病力菌株共33株,其AI值介于0.49—0.63,接種番茄15 d,植株發病率為66.33%—100%;無致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78—0.89,接種番茄15 d,植株發病率為0;中間型菌株共有7株,其AI值介于0.68—0.73,接種番茄15 d,植株發病率為24.17%—45.92%20株無致病力突變菌株對番茄青枯病的防治效果測定結果顯示,防治效果介于16.68%—92.45%,菌株T831防治效果最好,達91.74%,其次是菌株T780,防治效果為87.51%,菌株T497防治效果最差,為16.68%。不同致病力青枯雷爾氏菌的高效離子交換色譜分離結果顯示,青枯雷爾氏菌經高效離子交換色譜可以分離出P1(出峰時間為0.6 min)、P2(出峰時間為4.4或4.5 min)和P3峰(出峰時間為5.9或6.0 min);強致病力菌株和無致病力菌株均具有3種不同峰類型:單峰、雙峰和3個峰,強致病力菌株的主峰為P3峰,無致病力菌株的主峰為P1峰,中間型菌株有雙峰和3個色譜峰兩種類型;強致病力菌株中CTI3為100%的菌株,致病力最強,誘導番茄植株發病率均達85%以上,CTI3<100%的菌株,接種后番茄植株發病率介于66.33%—84.14%;無致病力菌株中CTI1達100%的菌株,其防治效果高,均達到80%以上,CTI1<90%的菌株,其防治效果低,介于16.68%—63.62%;CTI3與突變菌株致病力呈極顯著正相關,相關系數PCC值為0.62;CTI1與無致病力突變菌株的防治效果呈極顯著正相關,相關系數PCC值為0.80。【結論】青枯雷爾氏菌Tn5轉座子突變菌株具有3種致病力類型,不同致病力菌株的色譜行為不同。構建的色譜效價指數CTI1可用于快速篩選出無致病力高效生防菌株,CTI3可作為青枯雷爾氏菌致病力的參考指標。
    大麥黃條點花葉病毒的分布及其分離物的遺傳多樣性
    楊菲,張愛紅,孟凡思,霍良占,李希望,邸墊平,苗洪芹
    中國農業科學. 2018, 51(2):  279-289.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.008
    摘要 ( 108 )   HTML ( 2 )   PDF (674KB) ( 429 )   收藏
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    【目的】明確大麥黃條點花葉病毒(Barley yellow striate mosaic virusBYSMV)在中國北方小麥主產區的分布及其種群遺傳多樣性,為病害流行預警和防控提供理論依據。【方法】2008—2016年,在河北、山東、江蘇、安徽、河南、陜西和山西等7個省66個縣/市/區田間,采集了864份疑似病毒病癥狀的植物樣品。提取樣品總RNA,利用一步法三重RT-PCR技術檢測樣品中的BYSMV、水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和北方禾谷花葉病毒(Northern cereal mosaic virus,NCMV)。利用RT-PCR擴增獲得BYSMV的L和N基因片段,克隆并測定核苷酸序列,應用MEGA、DnaSP和PAML等軟件分析BYSMV分離物的系統進化和遺傳多樣性特征。【結果】從48個縣/市/區采集的336份樣品中檢測到BYSMV,檢出率為38.89%,該病毒主要分布于陜西、河北、山西和山東,另外,河南及安徽北部亦有分布,江蘇徐州和邳州僅局部發生。基于BYSMV的L、N基因序列構建的系統發育樹均可將分離物劃分為2個亞組,亞組I中的分離物其來源涉及全部7個省份,而亞組II中的分離物僅來自陜西和山西2個省,基于L基因序列系統發育分析表明亞組II分離物與伊朗的分離物親緣關系較近,BYSMV的遺傳分化與分離物的地理來源相關,而與寄主植物、發生時間無明顯相關性。運用RDP程序包的7個軟件進行基因重組分析顯示沒有支持重組的證據。選擇壓力分析顯示,亞組內和亞組間的ω(dN/dS)值(0.02—0.19)遠小于1,表明群體正承受凈化選擇。L和N基因的單倍型多樣性(Hd)值(0.90909和0.99524)均大于0.5、核苷酸多樣性(π)值(0.01324和0.01224)均高于0.005,表明中國BYSMV群體遺傳多樣性豐富。基于L和N基因片段的遺傳分化研究顯示,東部和西部群體的遺傳分化系數(FST)值(0.32201和0.37326)均大于0.25,且統計檢驗差異顯著,表明東部和西部的BYSMV群體嚴重分化;基因流(Nm)值(0.53和0.42)均小于1,說明有限的基因流是促使群體發生遺傳分化的主要原因。【結論】BYSMV在中國北方小麥主產區分布廣泛,河北、山東、江蘇、安徽、河南、陜西和山西等地均有不同程度的發生。BYSMV群體具有豐富的遺傳多樣性,且東部和西部群體之間存在嚴重的遺傳分化。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    長期施肥和灌溉對土壤細菌數量、多樣性和群落結構的影響
    楊亞東,王志敏,曾昭海
    中國農業科學. 2018, 51(2):  290-301.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.009
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    【目的】通過對華北地區一年兩熟種植模式下冬小麥生長季不同施肥和灌溉處理下土壤細菌群落的研究,揭示長期不同施肥和灌溉制度下土壤細菌數量、多樣性和群落結構的變化規律。為科學施肥和灌溉,提高農田地力和維持土壤微生物多樣性等提供依據。【方法】依托中國農業大學吳橋實驗站,選取長期施肥和灌溉定位試驗的6個處理冬小麥收獲后耕層土壤為研究對象,分別為化肥+不灌溉(CI0)、化肥+拔節期灌溉(CI1)、化肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉(CI2)、有機肥+不灌溉(MI0)、有機肥+拔節期灌溉(MI1)和有機肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉(MI2)。借助熒光定量PCR技術和Illumina Miseq高通量測序平臺,以16S rRNA基因為標靶,研究長期不同施肥和灌溉制度對土壤細菌數量、多樣性和群落結構的影響,并分析細菌數量、多樣性和群落結構變化與土壤理化性質的相關性。【結果】灌溉顯著提高了土壤含水量和土壤pH,施有機肥比施化肥顯著提高了土壤有機碳含量。不同處理細菌16S rRNA基因拷貝數為每克干土4.34×109—1.39×1010。灌溉顯著提高了細菌數量,化肥和有機肥處理分別提高了1.17—1.60和0.76—1.93倍。多樣性指數結果表明灌溉顯著影響細菌群落α多樣性指數,施肥對細菌群落α多樣性指數的影響均不顯著。門水平上,18個樣品共獲得39個類群,其中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優勢類群,相對豐度共占77.22%—86.28%。不同處理間放線菌門(11.09%—27.01%)、擬桿菌門(5.45%—12.13%)和Saccharibacteria(2.41%—3.77%)的相對豐度差異顯著。灌溉顯著降低了放線菌門和Saccharibacteria的相對豐度,化肥和有機肥處理分別降低了36.48%—48.03%、22.17%—33.67%和15.21%—45.54%、13.40%—23.97%。層次聚類和主成分分析結果顯示施肥和灌溉對細菌群落結構都產生影響,相同灌溉次數處理的細菌群落結構相似,而相同施肥處理間細菌群落結構差異較大,表明灌溉對細菌群落結構的影響強于施肥。此外,土壤含水量、土壤pH、全氮含量和有機碳含量與細菌數量、α多樣性指數和群落結構存在一定的顯著相關關系。【結論】灌溉顯著改變了細菌數量、多樣性和群落結構,施肥對細菌數量和群落結構的影響較小。土壤含水量和土壤pH是造成土壤細菌數量、多樣性和群落結構差異的主要原因。
    黃土高原植被生態系統水分利用效率時空變化及驅動因素
    劉憲鋒,胡寶怡,任志遠
    中國農業科學. 2018, 51(2):  302-314.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.010
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    【目的】明晰黃土高原植被生態系統水分利用效率(water use efficiency,WUE)時空變化特征及其影響因素,為深刻理解生態恢復和氣候變化雙重背景下黃土高原植被生態系統與水文相互作用研究提供依據。【方法】利用趨勢分析和逐步回歸方法,對2000—2014年黃土高原植被生態系統WUE時空變化特征及其驅動因素進行了探討。【結果】近15年黃土高原植被生態系統WUE呈顯著增加趨勢,增速為0.02 gC·kg-1H2a-1P<0.001),不同植被生態系統年內WUE主要呈“雙峰”模式,峰值分布在4—5月和9—10月;空間上,黃土高原植被生態系統WUE整體呈現上升趨勢,其中上升趨勢和顯著上升(P<0.05)面積分別占研究區的95.04%和66.96%,但不同季節變化趨勢特征差異較大;不同植被生態系統WUE均值和趨勢差異顯著,其中稀疏灌叢和草地WUE均值較低,而針葉林WUE趨勢下降明顯;進一步對坡度統計表明,25—50°范圍內植被生態系統WUE呈持續增加趨勢。當年蒸散量小于3 700 mm時,總初級生產力(gross primary productivity,GPP)隨著蒸散量(evapotranspiration,ET)的增加而增加,隨后GPP則隨ET的增加呈下降趨勢,且研究區中東部(57.25%)WUE主要由GPP控制,而西部區域(42.75%)WUE則受ET影響。近15年黃土高原植被生態系統WUE與LAI呈顯著的正相關關系(P<0.001),表明LAI的增加能夠有效促進WUE的提升。逐步回歸分析表明,降水量、日照時數和相對濕度3種氣候因子是導致WUE及其組分GPP和ET變化的主要氣候因子。【結論】在氣候變化和人類活動雙重影響下,2000—2014年黃土高原植被生態系統WUE呈顯著上升趨勢,且大部分植被類型年內分布呈現雙峰結構。生態恢復工程不僅改善了黃土高原植被覆蓋狀況,同時顯著提高了植被生態系統的WUE,成為近年來黃土高原WUE變化的主要驅動因素。
    園藝
    番茄U6啟動子的克隆及CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立
    蒲艷,劉超,李繼洋,阿爾祖古麗·塔什,胡燕,劉曉東
    中國農業科學. 2018, 51(2):  315-326.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.011
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    【目的】從番茄中克隆高效轉錄的SlU6啟動子,構建CRISPR/Cas9基因編輯載體,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系統,為番茄功能基因組學和分子育種研究提供技術基礎。【方法】采用PCR方法從‘中蔬四號’番茄品種中克隆4種SlU6啟動子,利用Transfer PCR方法分別對4個啟動子進行兩種不同長度的截短,分別構建8個截短的SlU6啟動子驅動GUS的植物融合表達載體。利用農桿菌瞬時轉化法分別轉染番茄葉片,通過GUS染色篩選出在番茄葉片中轉錄活性較高的SlU6-2啟動子。采用DNA重組技術構建以SlU6-2為啟動子驅動sgRNA,以番茄白粉病相關基因MLO1EDR1為靶序列的CRISPR/Cas9基因組編輯載體。載體構建成功后,采用PEG法轉化番茄原生質體,提取基因組DNA,采用酶切/PCR法分析內源基因突變情況;采用測序法分析內源基因突變的類型。利用突變位點頻率分布圖來驗證番茄內源啟動子在番茄CRISPR/Cas9系統中的有效性。【結果】經過兩輪PCR,共獲得4種8個不同長度的番茄U6啟動子,其長度分別是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,啟動子序列比對分析發現番茄U6啟動子與擬南芥U6啟動子一樣,也含有比較保守的兩個元件,USE和TATA框。成功構建了8個SlU6啟動子分別驅動GUS的植物融合表達載體。番茄葉片染色結果顯示轉化后的番茄葉片均被染成藍色,表明克隆的番茄8個SlU6啟動子均具有轉錄活性。選擇SlU6-2P4為啟動子驅動sgRNA,成功構建番茄白粉病相關基因MLO1EDR1為靶序列的CRISPR/Cas9基因組編輯載體,驗證結果表明番茄內源啟動子SlU6-2P4能有效地驅動sgRNA的轉錄,并成功實現對番茄內源基因的編輯。內源基因突變的類型都為堿基替換,突變熱點僅存在于內源基因靶序列區。【結論】成功克隆了4種在番茄葉片中高效轉錄的SlU6啟動子;基于SlU6-2啟動子的CRISPR/Cas9基因組編輯載體,在番茄中成功實現對內源基因的編輯。
    梨全基因組生長素反應因子(ARF)基因家族鑒定及表達分析
    歐春青,姜淑苓,王斐,趙亞楠
    中國農業科學. 2018, 51(2):  327-340.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.012
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    【目的】明確梨ARF轉錄因子在梨基因組中的數量、結構和組織表達差異,為揭示ARF轉錄因子在梨樹生長素信號途徑及在矮生梨生長發育中的作用奠定理論基礎。【方法】根據文獻報道的蘋果、擬南芥等植物中的ARF轉錄因子基因,利用BLAST軟件鑒定梨基因組中的ARF。采用SMART、PROSITE、WebLogo 3、DNAMAN 5.0、MEME、GSDS 2.0和MEGA 5.1等軟件對其蛋白和基因序列進行生物信息學分析。采用qPCR方法檢測梨ARF在矮生梨‘中矮1號’不同組織器官及3個不同生長勢梨品種木質部和韌皮部中的表達情況。【結果】鑒定得到31個梨ARF,所有PbARF蛋白均含有1個Auxin_resp結構域和1個B3結構域,除PbARF11、12、24、25和26外,其他序列的C末端還存在一個PB1(AUX_IAA)結構域。保守元件分析表明,PbARF基因家族包含15個保守元件,并非每個蛋白均含有所有保守元件。分組鑒定和進化樹分析結果顯示,PbARF蛋白可以被分為4組。基因結構分析表明,PbARF基因家族成員由2—15個外顯子組成,基因結構進化高度保守。qPCR結果顯示,所有PbARF在‘中矮1號’根、韌皮部、木質部、葉、花和果實中均有表達,表達模式各有不同,PbARF29在3個梨品種韌皮部中的表達表現出植株越矮表達量越高的趨勢,PbARF16、17、18、27等4個基因在3個梨品種木質部中的表達表現為植株越矮表達量越低的趨勢。【結論】梨基因組中含有31個ARF基因家族成員;所有PbARF蛋白均含有Auxin_resp和B3兩個高度保守的結構域;PbARF結構進化高度保守;所有PbARF在‘中矮1號’不同組織器官、基砧杜梨根系及3個梨品種的木質部和韌皮部中均有表達,其中,PbARF2916、17、18、27等5個基因的表達可能與梨樹植株的高矮有關。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    不同開食料采食量斷液體飼糧對羔羊生長發育的影響
    柴建民,王波,祁敏麗,王世琴,屠焰,陶曉菁,刁其玉,張乃鋒
    中國農業科學. 2018, 51(2):  341-350.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.013
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    【目的】研究不同開食料采食水平斷液體飼糧(代乳品)對羔羊生長、屠宰性能、內臟器官和胃腸道發育的影響,旨在確定羔羊最佳斷代乳品時間,為羔羊生長發育提供理論依據。【方法】采用單因素試驗設計,以斷代乳品時開食料采食水平為試驗因子,選取體重接近的純種湖羊羔羊64只,分為4組,每組16只,每個重復1只。于10日齡斷母乳飼喂代乳品,于15日齡開始補飼開食料,開食料自由采食。當羔羊連續3d開食料干物質采食量達到200、300、400和500g時分別斷掉代乳品,對應地分別為A、B、C和D組。動物飼養試驗過程中,測定羔羊生長性能包括體重、日增重和采食量并計算飼料轉化率。在羔羊90日齡進行屠宰試驗,測定羔羊屠宰性能、內臟器官和胃腸道發育情況。【結果】(1)90日齡羔羊體重,B和C組有高于D組的趨勢(P=0.0563);日增重方面,在10至90日齡期間,B和C組顯著高于D組(P<0.05);代乳品采食量方面,A和B組羔羊顯著低于C和D組(P<0.05),其中A組顯著低于B組(P<0.05);開食料采食量方面,整個試驗期,A和B組開食料采食量顯著高于C和D組(P<0.05);飼料轉化率方面,斷代乳品至90日齡和10-90日齡期間,B和C組羔羊料重比顯著低于其余組(P<0.05)。(2)瘤胃重量A、B和C組顯著高于D組(P<0.05),其中C組顯著高于A組(P<0.05),雖然瘤胃占復胃總重比例及占宰前活重比值無顯著差異(P>0.05),但是在數值上B和C組均高于A和D組;C組網胃和瓣胃重顯著高于A和D組(P<0.05);C組全胃重顯著高于A和D組(P<0.05),A、B、C和D組全胃占宰前活重比值無顯著差異(P>0.05),但B和C組在數值上較其它組高;小腸重量及占宰前活重比值各組間無顯著差異(P>0.05),但是B和C組在數值上較其它組高。C組大腸重顯著高于A和D組(P<0.05),A和B組大腸重顯著高于D組(P<0.05),大腸占宰前活重比值各組間無顯著差異(P>0.05),但是B和C組在數值上較其它組高。(3)B和C組心臟重量顯著高于D組(P<0.05),C組脾臟重量有高于B和D組的趨勢(P=0.0806),其余內臟器官重量及占宰前活重比值各處理組間無顯著差異(P>0.05)。(4)在90日齡,A、B和C組羔羊的宰前活重、空體重、胴體重和24h胴體重均顯著高于D組(P<0.05),C組空體重顯著高于A和B組(P<0.05),C組胴體重和24h胴體重顯著高于A組(P<0.05);B和C組羔羊眼肌面積顯著高于A和D組(P<0.05)。【結論】當開食料干物質采食量連續3 d達到300和400g時斷代乳品,羔羊生長性能、屠宰性能和胃腸道發育較好。因此,湖羊羔羊于開食料采食量達到300g時斷代乳品效果最佳。
    藏綿羊不同毛色皮膚組織miRNA表達譜及靶基因分析
    吳震洋,唐曉惠,付玉華,王昇,章程,李京津,余梅,杜小勇
    中國農業科學. 2018, 51(2):  351-362.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.014
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    【目的】藏綿羊又稱藏系綿羊,是中國三大粗毛羊品種之一,主要分布在西藏及其毗鄰的高寒牧區,如青海、甘肅、四川、云南等地。藏綿羊由于其被毛纖維粗長,毛質細膩且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作為一種重要的經濟性狀,同時制約羊毛的經濟價值。然而,目前對于綿羊毛色的分子調控機制尚不明確,以藏綿羊為研究對象,對其不同顏色皮膚組織(黑色和白色)進行轉錄組測序,旨在探討miRNA在藏綿羊不同毛色皮膚組織轉錄后水平中發揮的作用及其可能參與的調控通路。【方法】選取2只具有黑白花毛色的健康藏綿羊,減去體側被毛使皮膚完全裸露并用75%酒精消毒處理,屠宰后快速切取皮膚組織并保存在組織樣品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通過miRNA測序和生物信息學分析,獲得藏綿羊不同毛色(黑色和白色)皮膚組織miRNA表達譜,篩選組織差異表達miRNA并預測相關靶基因。通過靶基因分析,獲得與調控藏綿羊毛色性狀可能相關的信號通路。【結果】黑色和白色皮膚組織共獲得85.76兆條原始讀長,經過濾后得到85.08兆條clean reads;共鑒定出334個已知的miRNA和59個新的miRNA;從中獲得23個差異表達miRNA,其中14個差異表達miRNA在白色皮膚組織中表達顯著上調,9個表達下調。miR-2284b和miR-744僅在藏綿羊白色皮膚中表達,而miR-23b、miR-411a-5pmiR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p則僅在藏綿羊黑色皮膚中表達,但表達量相對較低。表達量最高的miRNA為miR-10a,而倍數差異最大的為miR-23b。其中,miR-10a可參與調節多種信號通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、細胞粘附等各個方面,目前并無調控綿羊毛色方面的相關報道,但其功能及作用機制的研究仍在不斷擴展。miR-23b則與Wnt、Notch等信號通路有關,這些信號通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切關系。結合倍數差異和miRNA表達量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色調控密切相關。本研究共預測出981個靶基因可能參與毛色調控,多數基因和WNT信號通路、MAPK通路、EDNRB信號通路及黑素原生成通路(melanogenesis pathway)相關,其中黑素原生成通路顯示和WNT信號通路、KIT信號通路及EDNRB信號通路相互關聯。黑素原生成通路顯示藏綿羊不同毛色可能最終通過MITF基因調控下游的TYR基因(酪氨酸酶基因)影響黑色素的合成。同時,篩選7個差異表達miRNA進行定量驗證,結果表明,5個miRNA在黑色皮膚組織中上調表達,2個miRNA在白色組織中上調表達,定量結果與測序結果一致。【結論】獲得了藏綿羊皮膚組織miRNA表達譜,并通過生物信息學分析得到可能和調控毛色性狀相關的miRNA和信號通路。這些結果表明,藏綿羊毛色性狀可能受到多種miRNA的調控并涉及多個信號通路,這有助于更進一步了解毛色轉錄后水平的調控過程,并對進一步的功能驗證奠定基礎。
    家蠶安全轉基因技術研究現狀與展望
    龍定沛,郝占章,向仲懷,趙愛春
    中國農業科學. 2018, 51(2):  363-373.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.015
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    轉基因技術是實現基因功能研究和生物遺傳改良的重要工具。轉基因生物安全問題主要包括轉基因操作技術安全與轉基因產品安全這兩個方面。近年來業內對轉基因生物的安全性研究主要集中于轉基因農作物、水生動物和家禽、家畜等大型動物在醫藥、農業和食品工業等領域的安全評估,而對于具有重要科研與經濟價值的農業昆蟲安全轉基因技術研究的報道則較為有限,而且農業部至今未有轉基因昆蟲安全性評估的先例。家蠶(Bombyx mori)是重要的鱗翅目模式昆蟲和農業經濟昆蟲,家蠶安全轉基因技術的深入研究對于促進基礎遺傳學發展和推動蠶絲產業發展均具有重要價值和意義。自2000年第一例轉基因家蠶建立以來,轉基因技術已廣泛應用于家蠶基因功能鑒定的基礎研究和品種改良的應用研究領域,但轉基因家蠶的安全性問題卻成了限制轉基因家蠶實用化應用的主要瓶頸。因此,開展家蠶安全轉基因技術體系研究對促進轉基因家蠶安全性評估和產業化具有重要意義。本文系統地概述了基于條件基因打靶的家蠶安全轉基因技術體系的建立與研究現狀,討論了家蠶安全轉基因技術的發展趨勢和應用前景,以期為轉基因動物特別是農業轉基因昆蟲的安全轉基因技術建立和完善提供參考。
    研究簡報
    三種限水灌溉水平下中麥175干物質積累與水分利用特性解析
    李法計,徐學欣,何中虎,肖永貴,陳新民,王志敏
    中國農業科學. 2018, 51(2):  374-385.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.016
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    【目的】中麥175是中國北部冬麥區水澆地和黃淮旱肥地大面積種植的水旱兼用型小麥品種。研究旨在明確其干物質積累和水分利用特征,揭示節水高產機理為培育水旱兼用的廣適型小麥新品種提供理論支撐和評價指標。【方法】在河北吳橋和北京順義兩個試驗點,以中麥175和京冬17為試驗材料,在3種限水灌溉(W0,全生育期不灌溉;W1,灌拔節水75 mm;W2,灌拔節水和開花水共150 mm)水平下,比較兩個品種群體性能、干物質積累與分配、產量及水分利用效率(water use efficiency,WUE)等性狀及其對供水的響應特征。【結果】兩個品種的產量均在W2水平最高,隨著灌水量減少產量降低;W0主要降低單位面積粒數(每平米穗數減少47—67穗,穗粒數減少1.6—5.1粒),W1主要降低千粒重(降低0.6—1.5 g)。水分虧缺顯著降低蒸散量(ET)和群體生物量,但顯著促進了花前積累的干物質向籽粒的轉運,適度水分虧缺(W1)提高WUE。在3種灌溉水平下,中麥175的產量及其穩定性均優于京冬17,表現為穗數、花前干物質積累量及其向籽粒的轉運量和轉運率、收獲指數(HI)均較高,灌漿期反映群體性能的歸一化植被指數(NDVI)和氣冠溫差(CTD)指標值及反映品種抗旱性能的莖稈可溶性糖含量(WSC)含量均較高,全生育期ET和WUE較高,大部分產量性狀的水分敏感性較弱。穗粒數和生物量對水分的敏感系數(WS)與產量對水分的WS呈密切相關性,而灌漿前期群體NDVI和CTD對水分的WS也與產量對水分的WS高度相關。【結論】前期干物質積累快、群體庫容量大及花后群體性能穩定性強可能是中麥175節水高產的主要原因。不同供水條件下灌漿期群體NDVI和CTD的差異性可作為小麥品種對水分敏感性的快速綜合評價指標。
    中國不同氣候區小麥產量及發育期持續時間對田間增溫的響應
    高美玲,張旭博,孫志剛,孫楠,李仕冀,高永華,張崇玉
    中國農業科學. 2018, 51(2):  386-400.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.017
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    【目的】氣候變暖對小麥生長發育有重要影響。然而,中國不同氣候區小麥生長發育對溫度升高的響應程度仍未系統量化。因此,急需闡明不同氣候區增溫及不同時段增溫對小麥產量及發育期持續時間的影響程度,揭示小麥產量及發育期對增溫的響應規律。【方法】本文搜集了1990—2017年間已發表的關于中國小麥全生育期田間持續增溫條件下小麥產量變化的21篇文獻,運用整合分析(Meta-analysis)量化田間不同增溫幅度及不同時段增溫對中國小麥產量及生育期的影響程度,系統闡明其在不同氣候區的差異及規律。【結果】(1)亞熱帶季風區增溫(0—3℃)顯著增加小麥產量、千粒重和穗粒數,其平均增幅分別為8.2%、6.3%和4.7%;溫帶季風區增溫(0—3℃)顯著增加小麥產量、穗粒數和穗數,其平均增幅分別為6.8%、3.9%和5.5%,而溫帶大陸性氣候區增溫(0—3℃)顯著降低小麥產量、千粒重和穗粒數,其平均降幅分別為10.2%、5.9%和8.3%。其中,亞熱帶季風區增溫0—2℃,小麥產量顯著提高了8.5%,而增溫2—3℃時,小麥并未增產;溫帶季風氣候區小麥增產愈為明顯,當增溫2—3℃時小麥的增產幅度達14.5%;相反,在溫帶大陸性氣候區增溫0—2℃和2—3℃時,小麥分別顯著減產10.1%和15.9%。(2)亞熱帶季風區和溫帶大陸性氣候區增溫(0—3℃)小麥全生育期持續時間分別縮短了3.3%和7.1%,相反,在溫帶季風區,增溫并未明顯改變小麥全生育期持續時間;與此同時溫帶大陸性氣候區和溫帶季風氣候區的生殖期持續時間并無明顯變化,而亞熱帶季風區小麥生殖生長持續時間卻顯著增加(8.7%)。(3)總體來看(季風氣候區所有獨立研究結果)夜間增溫0—2℃和2—3℃對小麥產量有顯著影響,小麥分別增產10.5%和15.0%。【結論】田間增溫會顯著影響中國糧食主產區小麥產量以及發育期持續時間,但不同氣候區及不同時段增溫對小麥生長和發育的影響不同。本研究結果可為未來氣候變化新態勢下中國糧食主產區種植制度優化與合理布局提供科學依據。
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