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當期目錄

    2018年 第51卷 第7期 刊出日期:2018-04-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    小麥稈銹病新抗源及抗病基因所在染色體特異分子標記
    韓冉,李天亞,宮文萍,李豪圣,宋健民,劉愛峰,曹新有,程敦公,趙振東,劉成,劉建軍
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1223-1232.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.001
    摘要 ( 99 )   HTML ( 5 )   PDF (1703KB) ( 555 )   收藏
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    小麥稈銹病是具潛在毀滅性的小麥病害之一,稈銹菌小種Ug99嚴重威脅全球小麥生產。本研究通過對165份小麥-近緣植物染色體系進行抗稈銹病鑒定,篩選小麥稈銹病新抗源并建立抗病基因所在染色體特異分子標記,以發掘小麥稈銹病新抗源,培育抗病品種,有效防御Ug99導致的稈銹病。【方法】將供試的165份小麥-近緣植物染色體系、3份六倍體小麥及感病對照小密穗分別播種于直徑10 cm的瓦盆中,生長到一葉一心時,用中國小麥稈銹菌流行小種34MKGQM和21C3CTHSM進行接種,當感病品種小密穗充分發病時,按照0—4級標準調查記載侵染型,對供試材料的抗稈銹病級別進行統計。同時,提取免疫、近免疫、高抗稈銹病附加系/代換系及其對應的整套染色體系、中國春等材料的基因組DNA,利用101對PLUG引物進行PCR擴增,擴增產物經限制性內切酶酶切后進行電泳檢測,篩選并建立抗稈銹基因所在染色體特異分子標記。【結果】在165份小麥-近緣植物染色體系中,中國春-卵穗山羊草7Mg#1附加系、中國春-卵穗山羊草7Mg#1(7A)和7Mg#1(7B)代換系、中國春-帝國黑麥1R附加系、中國春-中間偃麥草?Ai附加系(?表示外源染色體同源群未鑒定)、中國春-單芒山羊草6N附加系、中國春-易變山羊草6SvS端體附加系和中國春-智利大麥6Hch附加系9份材料對稈銹病表現為免疫或近免疫;ALCD-尾狀山羊草7C#1附加系、中國春-卵穗山羊草7Mg#1(7D)代換系、中國春-帝國黑麥6R附加系、中國春-高大山羊草6Sl#3附加系、中國春-高大山羊草6Sl#2(6B)代換系、中國春-希爾斯山羊草3S#1附加系和中國春-擬斯卑爾脫山羊草2Sg#3附加系7份材料對稈銹病表現為高抗;其余材料均表現為中感或高感。抗稈銹性基因定位信息比較分析發現,高大山羊草6Sl#2和6Sl#3、帝國黑麥6R、智利大麥6Hch、卵穗山羊草7Mg#1、尾狀山羊草7C、中間偃麥草?Ai染色體上可能含有抗稈銹新基因。分子標記篩選、定位及特異性驗證研究共獲得8個新的多態性標記,其中5個(TNAC1715、TNAC1718、TNAC1737、TNAC1739和TNAC1753)和3個(TNAC1740、TNAC1751和TNAC1756)分別被定位在6R6Sl染色體上。【結論】篩選得到8份可能含有抗稈銹新基因的材料,建立了抗稈銹基因所在染色體特異新標記8個。
    玉米籽粒淀粉粒密度基因tw1的精細定位
    孫粲然,張雪海,馬指揮,郭戰勇,湯繼華,付志遠
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1233-1243.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.002
    摘要 ( 147 )   HTML ( 11 )   PDF (11973KB) ( 240 )   收藏
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    【目的】淀粉粒密度影響籽粒容重,通過對一個玉米籽粒淀粉粒密度突變體Mrd進行鑒定和精細定位,為容重相關基因的克隆和功能驗證奠定基礎。【方法】以育種選系過程中發現的一個淀粉粒密度突變體Mrd為材料,利用近紅外光譜分析儀檢測其籽粒內部化學成分的變化,用掃描電鏡觀察授粉后18—45 d正常籽粒和突變籽粒中淀粉粒形態的差異;于2014—2016年分別在河南鄭州和原陽以及海南三亞種植Mrd與B73的雜交組合及F2和BC1分離群體,并對其進行遺傳分析;使用來自maizeGDB(http://www.maizegdb.org)的覆蓋全基因組的1 000對SSR引物,通過集團分離分析法(bulked segregation analysis,BSA)篩選與目的基因緊密連鎖的標記,實現目的基因的初步定位;并在該定位區間內開發新的標記,對從38 000 BC1分離群體中篩選出的交換單株進行基因型分析,實現目的基因的精細定位;通過候選基因序列分析、功能預測和等位性測驗確定首選候選基因。【結果】該突變體籽粒較正常籽粒體積變小,比重增加;細胞學和化學組份分析結果表明,與野生型籽粒相比,突變體籽粒中的粗蛋白含量降低,粗淀粉含量沒有顯著變化,淀粉粒形狀不規則且變小、密度增加,可能是導致籽粒容重變大的原因;對授粉后不同天數籽粒內部淀粉粒結構的觀察顯示,突變體籽粒淀粉粒的密度比正常籽粒密度大,并隨發育進程不斷增加;對Mrd與B73的F2及測交后代分離群體的遺傳分析結果表明,Mrd籽粒突變是由單隱性基因(命名為tw1)控制的;該基因首先被定位在第6染色體的SSR標記umc1105和bnlg1154之間,物理距離為22 Mb;利用上述2個標記對BC1群體進行交換單株篩選,并開發標記,將該基因定位于SSR標記B3和A47之間,物理距離為0.2 Mb;在該候選區段內有包含su2在內的3個候選基因,等位性測驗結果表明,tw1su2不是等位基因;候選基因序列分析和功能預測結果表明GRMZM2G042607編碼的蛋白具有碳水化合物識別結構域,在種子中對碳水化合物的儲藏起沉積作用,是tw1最可能的候選基因。【結論】實現了籽粒淀粉粒密度突變性狀基因tw1的精細定位,并確定了候選基因為編碼一種β-1,3半乳糖基轉移酶的GRMZM2G042607。
    大豆抗豆卷葉螟的轉錄組和蛋白質組關聯分析
    曾維英,孫祖東,賴振光,蔡昭艷,陳懷珠,楊守臻,唐向民
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1244-1260.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.003
    摘要 ( 130 )   HTML ( 7 )   PDF (4398KB) ( 584 )   收藏
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    【目的】通過對大豆受豆卷葉螟幼蟲脅迫下的轉錄組和蛋白質組結果進行聯合分析,篩選出一些與大豆抗豆卷葉螟相關的候選基因,為深入認識大豆抗豆卷葉螟的分子調控機制奠定基礎。【方法】以高抗材料趕泰-2-2(HR)和高感材料皖82-178(HS)為研究對象,運用RNA-Seq技術和iTRAQ技術鑒定出豆卷葉螟幼蟲取食誘導0和48 h時樣品間的差異表達基因(DEGs)和差異表達蛋白(DEPs),將在蛋白水平和轉錄水平關聯到的所有可定量數據進行關聯分析,計算蛋白水平和轉錄水平間的相關系數。【結果】蛋白質鑒定結果表明,HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中分別鑒定出236、250、213、211個DEPs;轉錄組鑒定結果表明,HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中分別鑒定出1 064、680、605、468個DEGs。定量關聯分析結果表明,HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組的相關系數r分別為0.156、0.2687、0.1149和0.035;HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比較組中分別關聯到11、9、3和4個DEPs/DEGs,其中蛋白和mRNA表達趨勢相同的基因分別有11、9、2和3個,蛋白和mRNA表達趨勢相反的基因分別有0、0、1和1個。生物信息學分析結果表明,這些差異蛋白功能涉及代謝途徑、核糖體、類黃酮生物合成、亞油酸代謝、氨基糖-核苷酸代謝、氨酰生物合成、亞麻酸代謝、次生代謝產物的生物合成、苯基丙酸生物合成、RNA運轉、谷胱甘肽代謝、抗壞血酸鹽和aldarate代謝等。功能關聯分析結果表明,HR48/HR0比較組中有27條Pathway通路共關聯到101個DEPs和23個DEGs,HS48/HS0比較組中有15條Pathway通路共關聯到147個DEPs和16個DEGs,HR0/HS0比較組中有18條Pathway通路共關聯到82個DEPs和10個DEGs,HR48/HS48比較組中僅有1條Pathway通路關聯到71個DEPs和2個DEGs。同時關聯發現胰蛋白酶抑制劑A、K型胰蛋白酶抑制劑、查爾酮異構酶4、脂氧合酶9、α-加氧合酶1、9S-脂氧合酶、植物凝集素前體、POD12、應激蛋白SAM22和cAPX1等可能是大豆抗豆卷葉螟潛在的靶標蛋白(基因)。qRT-PCR表達分析結果表明,5個DEPs/DEGs在HR48/HR0比較組的表達趨勢與它們的RNA-Seq和iTRAQ結果基本一致。【結論】確定了一些與豆卷葉螟的抗性相關蛋白(基因)和代謝通路,這些差異蛋白可能直接或間接參與大豆對豆卷葉螟的抗蟲反應。
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    溫度和土壤水分與Bt棉鈴殼中殺蟲蛋白表達關系及其氮代謝生理機制
    張祥,王劍,彭盛,芮秋治,李麗楠,陳媛,陳源,陳德華
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1261-1271.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.004
    摘要 ( 81 )   HTML ( 4 )   PDF (834KB) ( 79 )   收藏
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    【目的】明確溫度和土壤水分對Bt棉殺蟲蛋白含量及其氮代謝活性的影響,為生產中Bt棉抗蟲性的安全穩定利用提供理論參考。【方法】2016—2017年以轉Bt抗蟲基因抗蟲棉常規品種泗抗1號(SK1)和雜交種泗抗3號(SK3)為材料,采用盆栽法,設置29℃、32℃、35℃、38℃ 4個溫度水平,土壤最大持水量的80%、70%、60%、50%、40% 5個土壤水分水平,觀察溫度和土壤水分對Bt棉鈴殼殺蟲蛋白含量的影響,各處理持續脅迫4 d。2016年主要研究各處理對Bt棉鈴殼中殺蟲蛋白含量的影響;在此基礎上,2017年進一步探討各處理對鈴殼中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)、蛋白酶、肽酶活性的影響。【結果】SK1和SK3殺蟲蛋白含量均在32℃、最大持水量為60%時最高,分別達到471.1 ng·g-1 FW和351.7 ng·g-1 FW。在同一土壤水分條件下,32℃最利于SK1和SK3殺蟲蛋白表達;同一溫度條件下,最大持水量60%利于SK1和SK3殺蟲蛋白表達。對殺蟲蛋白含量與溫度和土壤水分關系進行二元多項式回歸分析發現,Bt棉殺蟲蛋白含量(Y)與溫度(X2)和土壤水分(X1)呈二元二次方程關系,其中SK1、SK3相關方程分別為Y=-3230.2+17.2X1+199.1X2-0.3X12-3.7X22-0.7X1X2 r=0.829**)、Y=-3322.0+40.7X1+145.2X2-0.3X12-2.0X22-0.3X1X2r=0.739**)。SK1的殺蟲蛋白表達量最大的溫度和土壤水分條件為31.8℃、57.8%,SK3為33.2℃、60.8%。氮代謝相關生理特征表明,SK1和SK3均表現為在32℃和土壤含水量為60%處理下,棉鈴中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)活性較高,蛋白酶、肽酶活性較低;殺蟲蛋白含量與可溶性蛋白和GOT活性呈極顯著正相關關系(r=0.613**;r=0.735**),與蛋白酶活性和肽酶活性呈極顯著負相關關系(r=-0.724**;r=-0.738**)。【結論】溫度和土壤水分通過調控蛋白質分解和合成,共同影響Bt棉殺蟲蛋白表達,且與其含量呈二元二次方程關系。
    套作對大豆苗期莖稈纖維素合成相關糖類物質轉化的影響及其與葉片光合的關系
    任勝茂,鄧榆川,文鳳君,Sajad Hussain,蒲全明,于曉波,劉衛國,楊文鈺
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1272-1282.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.005
    摘要 ( 132 )   HTML ( 4 )   PDF (633KB) ( 100 )   收藏
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    【目的】從纖維素合成相關糖類物質轉化的角度,闡明玉米大豆套作模式下,大豆苗期莖稈光形態建成的機理。【方法】在大豆單作和玉米大豆套作兩種種植模式下,以強耐蔭大豆南豆12和弱耐蔭大豆南032-4為試驗材料,對葉片光合速率和莖稈總碳、纖維素、可溶性糖、蔗糖、β-1,3-葡聚糖等含量進行測定和分析。【結果】與單作相比,套作大豆由于受到玉米蔭蔽,苗期光合速率顯著降低,但材料間對套作的反應程度不同,強耐蔭大豆南豆12受套作蔭蔽的影響程度相對較小,在套作下表現出較強的光合能力;套作顯著降低了大豆葉片和莖稈的總碳含量,但南豆12的降低幅度顯著低于南032-4。相關分析表明葉片光合速率與葉片和莖稈的總碳含量、莖稈的纖維素含量均呈極顯著正相關(r=0.952,0.935,0.825,P<0.01),說明蔭蔽通過影響大豆葉片的光合速率,減少了光合產物的積累和向莖稈中的分配,導致大豆植株莖稈纖維素含量降低;強耐蔭大豆南豆12在蔭蔽下的光合速率較高,光合產物積累較多,適合套作種植。在整個苗期,雖然套作大豆莖稈可溶性糖含量均顯著低于單作,但β-1,3-葡聚糖和蔗糖含量在大豆出苗后30—51 d卻表現為套作顯著高于單作,且在套作模式下,兩個大豆糖類物質轉化率差異顯著;同一種植模式下,強耐蔭大豆南豆12莖稈可溶性糖、蔗糖和β-1,3-葡聚糖的含量和轉化率均顯著或極顯著高于南032-4。對纖維素沉積方式分析表明,同一大豆材料,單作模式下莖稈纖維素快速累積時間和累積速率要高于套作;同一種植模式下,強耐蔭大豆南豆12纖維素快速累積時間要短于南032-4,但差異較小,而累積速率要高于南032-4,最終導致南豆12的莖稈纖維素含量顯著高于南032-4。【結論】套作蔭蔽降低了大豆葉片的光合能力,減少了光合產物向莖稈的運輸量和莖稈填充物的含量,改變了莖稈纖維素的沉積方式,使得纖維素的含量降低;而強耐蔭性大豆南豆12在套作模式下能保持較高光合能力和莖稈纖維素合成能力,具有較強的抗倒伏性。
    水氮互作對冬油菜氮素吸收和土壤硝態氮分布的影響
    谷曉博,李援農,黃鵬,杜婭丹,陳朋朋,方恒
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1283-1293.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.006
    摘要 ( 97 )   HTML ( 9 )   PDF (470KB) ( 158 )   收藏
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    目的】針對西北地區冬油菜蕾薹期干旱頻發,農民大量灌溉和施氮導致的環境問題,探究西北地區冬油菜蕾薹期適宜的灌溉量和施氮量。【方法】通過2年田間試驗,研究分析蕾薹期不同灌溉量(不灌溉(I0)、灌60 mm(I1)和灌120 mm(I2))和施氮量(不施氮(N0)、施氮80 kg·hm-2N1)和施氮160 kg·hm-2N2))下,地上部干物質量、籽粒產量、氮素吸收與分配、土壤硝態氮分布和氮素利用效率的差異,其中全生育期不施氮(不基施、不追施)和不灌溉為對照處理(CK)。【結果】蕾薹期灌溉或施氮能顯著提高冬油菜的地上部干物質量、籽粒產量、產油量和氮素吸收量。土壤硝態氮峰值所在的土層深度隨灌水量的增加而明顯下移,且峰值隨施氮量的增加而明顯增加,表現出明顯的淋洗趨勢。I1N1處理的土壤硝態氮累積量與I0N0處理間不存在顯著差異,但與I2N2相比,卻顯著降低41.9 kg·hm-2I0、I1和I2處理土壤硝態氮主要分布在0—40、40—80和80—160 cm。2個冬油菜生長季,I2N1處理的籽粒產量和產油量均最大,平均為3 385和1 429 kg·hm-2CK最小,平均為1 391和585 kg·hm-2。與I2N1相比,2012—2013年(干旱年)I1N1處理的籽粒產量顯著降低,但產油量無顯著差異;2013—2014年(平水年)二者的籽粒產量和產油量均不存在顯著差異。2年I1N1處理平均籽粒產量和產油量分別為3 264和1 358 kg·hm-2,僅比I2N1降低3.6%和4.7%。I1N1處理的平均氮肥農學利用率比I2N1降低7.2%。【結論】為提高冬油菜籽粒產量和氮素利用效率,減輕土壤硝態氮的下移趨勢和下移量,I1N1處理(灌溉60 mm,施氮80 kg·hm-2)為較優的灌溉施氮策略。
    植物保護
    甘薯羽狀斑駁病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立
    姜珊珊,馮佳,張眉,王升吉,辛志梅,吳斌,辛相啟
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1294-1302.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.007
    摘要 ( 93 )   HTML ( 6 )   PDF (1930KB) ( 407 )   收藏
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    【目的】甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反轉錄環介導等溫擴增技術(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一種快速、高效檢測SPFMV的方法。【方法】從GenBank上獲得SPFMV外殼蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4設計4條RT-LAMP特異性引物SPFMV-FIP(5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′)、SPFMV-BIP(5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′)、SPFMV-F3(5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′)和SPFMV-B3(5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′),同時設計2條反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的特異性引物SPFMV-F(5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′)和SPFMV-R(5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′)。分別設置F3/B3﹕FIP/BIP引物濃度比(1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10),dNTPs濃度梯度(0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825 mmol·L-1),Betaine濃度梯度(0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1),反應溫度(59、61、63、65、67和69℃)和反應時間(20、30、40、50、60、70、80和90 min),對RT-LAMP反應體系各條件進行優化,確定最佳反應體系。通過測序及酶切對RT-LAMP產物進行鑒定。以攜帶SPFMV、甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯潛隱病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)、甘薯褪綠斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)和健康甘薯葉片的總RNA為模板,分別進行RT-LAMP和RT-PCR特異性檢測;帶有SPFMV的甘薯總RNA進行10倍梯度稀釋,以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀釋液為模板進行RT-LAMP和RT-PCR靈敏度測定。最后利用優化的RT-LAMP體系對山東省多地采集的SPFMV疑似病樣進行檢測,加入SYBR green I進行可視化檢測。【結果】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特異性檢測方法,優化的反應體系:引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP為0.8 µmol·L-1,SPFMV-F3/SPFMV-B3為0.2 µmol·L-1,dNTPs為0.325 mmol·L-1,Betaine為1 mol·L-1;65℃反應70 min。特異性試驗顯示本研究建立的RT-LAMP只對攜帶SPFMV的RNA能夠擴增出典型的梯狀條帶。RT-LAMP最低可檢測的RNA濃度為121.6×10-4 ng·μL-1,而RT-PCR最低能檢測的RNA濃度為121.6×10-3 ng·μL-1,表明RT-LAMP的靈敏度比RT-PCR高10倍。田間樣品檢測,RT-LAMP擴增結果與可視化檢測結果一致,表明本研究建立的RT-LAMP快速檢測方法可有效應用到SPFMV的田間檢測。【結論】建立的RT-LAMP快速檢測方法靈敏度高、特異性好,適用于SPFMV的田間快速檢測。
    飛蝗表皮蛋白基因LmNCP1的分子特性及功能分析
    楊亞亭,趙小明,秦忠玉,劉衛敏,馬恩波,張建珍
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1303-1314.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.008
    摘要 ( 90 )   HTML ( 4 )   PDF (1578KB) ( 216 )   收藏
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    【目的】基于飛蝗(Locusta migratoria)轉錄組數據庫搜索并克隆獲得飛蝗表皮蛋白基因LmNCP1(nymph cuticle protein 1),分析其序列特征和表達特性,通過蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)誘導和干擾20E受體基因LmEcR表達研究其表達調控,并基于RNA干擾(RNAi)方法分析其生物學功能,為闡明該基因在飛蝗表皮發育過程中的作用提供理論依據。【方法】依據飛蝗轉錄組數據庫獲得表皮蛋白基因LmNCP1,結合RT-PCR技術克隆獲得其全長開放閱讀框(ORF)序列,并結合飛蝗基因組序列分析其基因結構及序列特征;使用MEGA 6.0軟件中鄰接法(neighbor-joining,NJ),與其他昆蟲同源序列聚類分析,并根據聚類結果進行命名;利用reverse-transcription quantitative PCR(RT-qPCR)分析其在5齡飛蝗不同組織和不同發育天數的基因表達特性;通過體內注射20E誘導以及干擾20E受體基因LmEcR的表達,RT-qPCR檢測該基因的表達情況;基于RNAi結合H&E染色方法分析其生物學功能。【結果】通過搜索獲得表皮蛋白基因LmNCP1,并進行了克隆和測序驗證,獲得457 bp的cDNA序列,其全長ORF序列為306 bp,編碼101個氨基酸。氨基酸序列分析表明該基因編碼的蛋白含有1個信號肽,不含幾丁質結合域,但包含3個重復基序,Weblogo分析結果顯示其在物種間具有保守性。系統進化樹分析顯示該蛋白與蜚蠊目蟑螂(Blaberus craniifer)BcNCP1序列一致度最高,聚為一支。根據聚類結果將該蛋白命名為LmNCP1(GenBank登錄號:MF326211)。RT-qPCR結果顯示LmNCP15齡若蟲體壁中高表達,在翅芽、前腸和脂肪體中表達次之,在中腸、后腸、胃盲囊和馬氏管中表達量較低或不表達;LmNCP15齡早期(N5D1和N5D2)高表達,隨后表達量逐漸降低(N5D3—N5D6),到下一次蛻皮前表達有所升高(N5D7),其表達量動態與內表皮形成時間一致。20E誘導不同時間結果顯示,與對照組相比,LmNCP1在20E誘導1 h和3 h后表達量顯著上調,分別上調了1.3倍和0.9倍;利用RNAi方法干擾LmEcR 48 h和72 h后,與對照組相比,LmNCP1表達量均顯著降低,分別降低了71%和87%。利用RNAi方法在4齡和5齡第2天分次注射dsLmNCP1后,飛蝗仍能夠正常蛻皮,無致死表型,但對其表皮進行H&E染色發現,與對照組相比,其內表皮形成減少,導致表皮顯著變薄,表皮層厚度約減少了33%。【結論】飛蝗表皮蛋白LmNCP1含有3個物種間保守的重復基序,不含幾丁質結合域,屬于其他家族蛋白;LmNCP1主要在體壁中高表達,而且響應LmEcR介導的20E信號通路調控;RNAi試驗表明,LmNCP1在飛蝗蛻皮過程中參與內表皮的沉積。
    赤擬谷盜章魚胺受體3(TcOctβR3)cDNA克隆、表達及功能
    劉小強,蔣紅波,李慧敏,熊英,王進軍
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1315-1324.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.009
    摘要 ( 88 )   HTML ( 6 )   PDF (2073KB) ( 445 )   收藏
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    【目的】章魚胺信號系統在調節昆蟲行為和生理過程中具有至關重要的作用。赤擬谷盜(Tribolium castaneum)作為一種模式昆蟲,被廣泛用于解析昆蟲生長發育及生理等調控機制的研究工作。本研究以赤擬谷盜為對象,旨在明確章魚胺受體在調節赤擬谷盜行為和生理方面的功能。【方法】根據GenBank登錄的相關序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技術克隆赤擬谷盜章魚胺受體基因TcOctβR3的cDNA序列。利用在線生物信息學分析軟件預測該基因的開放閱讀框、編碼的氨基酸序列以及跨膜結構域等信息,基于鄰接法構建該基因與其他昆蟲相關序列的系統發育樹,明確系統進化關系。分別提取赤擬谷盜各發育階段(卵、幼蟲、蛹和成蟲)、不同組織(中樞神經系統、脂肪體、中腸、后腸、馬氏管、精巢和卵巢)以及饑餓脅迫后的RNA,以赤擬谷盜核糖體蛋白S3(TcRPS3)為內參基因,采用實時定量PCR技術分析該基因在赤擬谷盜不同發育階段、不同組織以及在饑餓脅迫下的表達模式。運用哺乳動物異源表達系統在人胚胎腎細胞HEK293中瞬時表達TcOctβR3,進而利用第二信使cAMP含量測定技術分析TcOctβR3與配體的結合能力。最后,通過體外合成赤擬谷盜TcOctβR3的雙鏈RNA,利用RNA干擾以及軌跡球行為分析等技術探究該基因的生理功能。【結果】序列分析結果表明,赤擬谷盜TcOctβR3開放閱讀框全長1 305 bp,編碼434個氨基酸,序列中含有G蛋白偶聯受體典型的7個跨膜結構域。基于鄰接法構建的系統發育樹表明,該基因編碼的蛋白質與小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3親緣關系最近。實時定量PCR分析結果表明,TcOctβR3在赤擬谷盜各發育階段均有表達,尤其在低齡幼蟲期轉錄水平最高,而在其他發育階段表達量無顯著差異;在赤擬谷盜不同組織中,TcOctβR3在中樞神經系統的表達量顯著高于其他組織;赤擬谷盜幼蟲在經饑餓處理24 h的過程中,TcOctβR3的表達量呈先下降后上升的趨勢,且在處理6 h的表達量最低,為對照的0.47倍,在16 h表達量最高,為對照的1.80倍,最后恢復到正常水平。通過HEK293細胞異源表達TcOctβR3后,cAMP測定結果表明章魚胺(OA)呈濃度依賴性地激活TcOctβR3,其EC50為8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激動活性最高,其有效中濃度EC50為8.56×10-8 mol·L-1。4種供試生物胺激動劑活性強弱為:萘甲唑啉>酪胺(TA)>章魚胺>多巴胺(DA)。進一步采用RNA干擾技術的分析結果表明,注射dsRNA能有效抑制TcOctβR3的表達,沉默效率高達61.5%,但干擾該基因表達后不會影響赤擬谷盜成蟲的爬行速度和產卵量。【結論】TcOctβR3在赤擬谷盜中樞神經系統可能發揮重要作用,能調節幼蟲對饑餓脅迫的響應。明確了TcOctβR3的分子生物學特性,可為將來以其為靶標篩選高效激動劑和抑制劑提供理論依據。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    電滲析法研究紫色土、黃壤和磚紅壤的酸化特征
    程永毅,李忠意,白穎艷,劉莉
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1325-1333.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.010
    摘要 ( 89 )   HTML ( 3 )   PDF (651KB) ( 116 )   收藏
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    【目的】研究紫色土、黃壤和磚紅壤在快速酸化過程中的酸化特征。【方法】將3種供試土壤在15 V·cm-1的外加直流電壓梯度下進行連續30次,每次8 h的電滲析。并通過測定電滲析前后土壤的酸度指標、鹽基離子含量以及在電滲析過程中土壤所釋放的鹽基離子含量來分析土壤的酸化特征。【結果】電滲析法可在短時間內實現土壤的快速酸化,3種土壤的pH均降低至4.5以下的強酸化水平。電滲析后,3種土壤的交換性酸、交換性H+和交換性Al3+含量顯著增加。紫色土、黃壤和磚紅壤的交換性酸含量分別從3.35、0.23和0.76 cmol(+)·kg-1增加至18.9、7.0和5.8 cmol(+)·kg-1,可見紫色土的酸化程度最為嚴重。土壤酸化后,水溶性和交換性K+、Na+、Ca2+和Mg2+含量降低,其中Ca2+、Mg2+的降低幅度較大。酸化導致土壤的交換性鹽基總量和鹽基飽和度下降,紫色土、黃壤和磚紅壤的鹽基飽和度從電滲析前的96.8%、82.6%和47.3%降低至電滲析后的20.5%、11.8%和12.2%。盡管紫色土的交換性酸含量遠大于黃壤和磚紅壤,但交換性鹽基離子總量和鹽基飽和度也大于黃壤和磚紅壤。由于各土壤的交換性Ca2+和Mg2+含量大于交換性K+和Na含量,且相對于K+和Na,Ca2+和Mg2+與帶負電的土壤顆粒間具有更強的靜電引力,因此在酸化過程中,一價鹽基離子K+和Na在3種土壤中均表現為快速釋放,而二價鹽基離子Ca2+和Mg2+表現出緩慢釋放和波動釋放的規律。3種供試土壤,隨著土壤發育程度增加,土壤的潛在酸化風險下降(紫色土>黃壤>磚紅壤),但土壤的鹽基飽和度表現出紫色土>黃壤≈磚紅壤。可以看出,紫色土的酸化特征表現出這種明顯的“雙面性”,由于紫色土具有較高的CEC值,導致土壤酸化后的交換性酸含量顯著高于黃壤和磚紅壤,使酸化紫色土上生長的植物存在較高的鋁毒害風險;同時,由于紫色土豐富的礦物組分能夠對鹽基離子進行及時補充,紫色土酸化后仍含有相對較高的鹽基離子含量和鹽基飽和度,保證了植物生長對鹽基養分離子需求,也能在一定程度上緩解紫色土的進一步酸化。【結論】電滲析法可用于模擬土壤的快速酸化過程;土壤的表面負電荷量和復鹽基離子能力是決定土壤酸化特征的關鍵因素;紫色土具有異于地帶性土壤黃壤和磚紅壤的“雙面性”酸化特征。
    測墑補灌和施氮對冬小麥產量及水分、氮素利用效率的影響
    金修寬,馬茂亭,趙同科,安志裝,姜玲玲
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1334-1344.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.011
    摘要 ( 105 )   HTML ( 6 )   PDF (398KB) ( 172 )   收藏
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    【目的】測墑補灌是近年來研究的一種小麥節水灌溉新技術。論文旨在探索測墑補灌與施氮對冬小麥生長的影響,為該區節水、節氮提供依據。【方法】采用漫灌的方式設置測墑補灌和施氮兩因素田間試驗,補灌設置4個處理,于冬小麥拔節期、開花期依據0—40 cm土層土壤質量含水量進行測墑補灌,補灌至土壤田間持水量的50%W1)、60%W2)、70%W3)、80%W4)。施氮設置4個處理,不施氮(N0、施純氮180 kg·hm-2N180、240 kg·hm-2N240和300 kg·hm-2N300)。在此處理下研究了測墑補灌和施氮對冬小麥產量及水分、氮素利用效率的影響。【結果】(1)各施氮處理下,補灌量的增加可增加冬小麥籽粒產量,當補灌量至土壤田間持水量的60%—80%范圍內時,冬小麥籽粒的增產效應差異不顯著。各補灌處理下,當施氮量超過240 kg·hm-2時籽粒產量無顯著性變化。本試驗條件下當補灌至土壤田間持水量的60%,施氮量為240 kg·hm-2時冬小麥籽粒產量達到最高,為8 104.6 kg·hm-2(2)增加施氮量和補灌量均可顯著增加麥田總耗水量,但當施氮量超過240 kg·hm-2時,施氮的提高效果不顯著。補灌量的增加會顯著增加麥田總耗水量,但當補灌至土壤田間持水量60%(W2)、70%(W3)時較補灌至80%(W4)處理顯著降低耗水量,說明有利于節約灌水而獲得較高產量。(3)相同施氮處理下,補灌量的增加可顯著提高冬小麥水分利用效率,當補灌量增至土壤田間持水量的60%時,冬小麥水分利用效率達到最大值,為14.7 kg·hm-2·mm-1。相同補灌處理下,增施氮肥可顯著提高冬小麥水分利用效率但施氮量不宜超過240 kg·hm-2,否則將導致水分利用效率降低。(4)相同施氮處理下,應控制補灌量至土壤田間持水量的60%時冬小麥氮素干物質生產效率及氮素利用效率最高,為60.1 kg·kg-122.4 kg·kg-1。相同補灌處理下,施氮量應控制在240 kg·hm-2時可獲得較高的氮素干物質利用效率及冬小麥氮素利用效率最高,為63.9 kg·kg-123.5 kg·kg-1。【結論】本試驗條件下當施氮量為240 kg·hm-2、冬小麥拔節期、開花期補灌至土壤田間持水量的60%時冬小麥籽粒產量、水分利用效率、氮素干物質利用效率、氮素利用效率均最高,為最優的節水、節氮、高產組合,推薦其作為該區域適宜水、氮用量。
    園藝
    蘋果生長素響應因子MdARF5的克隆與功能鑒定
    安建平,宋來慶,趙玲玲,由春香,王小非,郝玉金
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1345-1352.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.012
    摘要 ( 118 )   HTML ( 5 )   PDF (926KB) ( 220 )   收藏
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    【目的】分離蘋果生長素響應因子MdARF5(Auxin Response Factor 5),分析其對生長素的響應,鑒定其在調節花青苷合成過程中的作用,揭示MdARF5的生物學功能,為進一步研究生長素對花青苷的調節提供理論依據。【方法】以‘嘎拉’蘋果(Malus×domestica ‘Royal Gala’)為材料,利用同源克隆技術,克隆得到一個ARF(Auxin Response Factor)轉錄因子,并將其命名為MdARF5。利用MEGA5.0軟件構建多物種間系統進化樹。通過農桿菌介導的遺傳轉化獲得轉基因蘋果愈傷組織。比較野生型和轉基因蘋果愈傷組織花青苷積累的差異。利用煙草葉片瞬時轉化試驗,分析MdARF5對MdMYB1的轉錄調控。【結果】克隆獲得蘋果生長素響應因子MdARF5(序列號:MDP0000143749),該基因CDS為2 691 bp,編碼含有896個氨基酸的蛋白。系統進化樹分析表明,蘋果MdARF5與梨PbARF5同源性最高。基因表達分析顯示,該基因響應生長素處理,并且與花青苷合成相關基因表現出相反的表達模式。在蘋果愈傷組織中超表達MdARF5,其花青苷積累較野生型顯著降低,表明MdARF5在調控花青苷積累過程中發揮重要作用。對蘋果MdMYB1啟動子序列進行分析,發現其序列包含一個MdARF5的結合位點。煙草瞬時表達試驗顯示,MdARF5能夠抑制MdMYB1的表達。【結論】推測蘋果MdARF5可能通過直接抑制MdMYB1的表達負調節花青苷的積累。
    過量表達RdreB1BI對草莓果實品質及相關基因的影響
    閻依超,萬春雁,古咸彬,郭成寶,陳月紅,高志紅
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1353-1367.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.013
    摘要 ( 90 )   HTML ( 3 )   PDF (489KB) ( 162 )   收藏
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    【目的】研究外源基因RdreB1BI轉入對‘紅頰’草莓果實品質及相關基因表達的影響,揭示RdreB1BI在草莓果實品質調控中的作用及分子機理。【方法】以5個轉RdreB1BI株系及非轉基因‘紅頰’草莓全紅期果實為材料,測定果實縱橫徑、單果重、可溶性糖、可溶性蛋白、抗壞血酸等風味物質及花青苷、總黃酮、總酚等著色物質的含量。應用BLASTn、GENEFINDER和PlantCARE等生物信息學方法分析外源基因和7個次生代謝產物合成途徑相關基因(RdreB1BIFractinFvC4HFvCCR2FvGSTFvF3HFvDFRFvMYB306)的結構,并預測基因啟動子作用元件。采用qRT-PCR定量法檢測相關基因表達量,應用7300 system軟件和2-△△Ct法分析數據。對生理生化及分子數據進行方差及相關性分析,綜合討論RdreB1BI的轉入對‘紅頰’草莓果實品質及相關基因表達的影響。【結果】轉基因‘紅頰’草莓株系與野生型果實單果重的范圍為11.75—15.42 g,縱徑和橫徑的范圍分別為35.12—40.42 mm及28.73—32.6 mm,僅株系8果實縱徑顯著大于株系7,其余指標間差異不顯著。其中轉基因株系1和7的花青苷含量顯著高于野生型;轉基因株系1、7及8總黃酮含量顯著高于野生型;各轉基因株系的總酚含量均顯著高于野生型。轉基因株系1、7和8果實的可溶性糖含量顯著高于野生型(21.70 mg·g-1 FW),分別為野生型的2.87、3.39和3.35倍。可溶性固形物含量與可溶性糖含量呈正相關(r=0.811*),但樣品果實的可溶性固形物含量間不存在顯著性差異。轉基因株系草莓成熟果實果肉中氨基酸含量為0.2580—0.3950 g/100 g FW,野生型果實的氨基酸含量為0.5151 g/100 g FW,顯著高于各轉基因株系草莓果實;轉基因株系1和7的可滴定酸含量顯著高于野生型;轉基因株系1果實的抗壞血酸含量為168.35 mg/100 g FW,顯著高于野生型(92.50 mg/100 g FW)。轉基因株系9及10果實的可溶性蛋白含量分別為25.97和25.86 mg·g-1 FW,顯著高于野生型(22.93 mg·g-1 FW)。RdreB1BIFvCCR2cinnamoyl-CoA reductase 2-like)和FvMYB306(myb-related protein 306)在各轉基因株系中表達量顯著高于野生型。分析發現差異表達基因啟動子區域包含多種高等植物順勢調控元件,主要有對真核生物起增強基因轉錄效率的CAAT-box和核心啟動子元件TATA-box。同時還包含G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch等能影響各基因對光的響應、在苯丙烷代謝途徑中起調節作用的順式作用元件。【結論】RdreB1BI調控相關基因參與轉化體果實發育和成熟,提高光的有效性,活化黃酮類生物合成通路關鍵基因,差異基因中均包含大量光誘導響應元件,FvCCR2FvMYB306的表達促進了總黃酮、酚類物質及花青苷等次生代謝物的合成。轉入RdreB1BI使草莓果實的多項營養成分和著色物質含量顯著增加,改善了草莓的果實品質。
    食品科學與工程
    超高壓殺菌處理冷破碎獼猴桃果漿的條件優化及其貯藏期殺菌效果
    楊天歌,鄧紅,李涵,孟永宏,雷佳蕾,馬婧,郭玉蓉
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1368-1377.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.014
    摘要 ( 104 )   HTML ( 4 )   PDF (1217KB) ( 159 )   收藏
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    【目的】研究‘海沃德’獼猴桃冷破碎果漿的超高壓殺菌最優條件及超高壓處理后果漿貯藏過程中的殺菌效果,為獼猴桃的非熱加工及產品開發提供參考。【方法】采用冷破碎技術設備獲得獼猴桃純果肉果漿,以菌落總數、VC、褐變度等為評價指標,利用響應面分析建立模型,得到超高壓殺菌最優工藝條件;利用微生物學方法,研究超高壓處理的果漿在4℃、-20℃下貯藏期菌落總數、霉菌酵母和大腸桿菌的變化。【結果】通過單因素試驗和Box-Behnken模型響應曲面分析獲得超高壓殺菌的最佳條件為壓力497 MPa,溫度27℃,保壓時間24 min;在此條件下超高壓處理對果漿的菌落總數、大腸桿菌、霉菌酵母殺菌率分別達到73.18%、97.46%、100.00%。超高壓殺菌的冷破碎果漿于4℃、-20℃下貯藏6周、14周,在符合標準范圍內菌落總數的增量較大,與貯藏第1天相比分別達到97.19%、85.98%,但菌落總數增長速度不大;而果漿中的霉菌酵母、大腸桿菌的增量相對較少,且增殖也較慢;果漿中的霉菌酵母、大腸桿菌僅分別為1.36、0.67和0.32、0.35 lg(CFU/mL)。【結論】超高壓處理作為一種非熱殺菌方式對熱敏性的獼猴桃果漿有較好的殺菌效果。冷破碎果漿作為獼猴桃加工的中間原料在超高壓處理后于-20℃下貯藏14周依然符合商業無菌要求,因此低溫貯藏與超高壓殺菌結合有利于冷破碎果漿的貯藏和進一步加工利用。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    慢病毒介導的CRISPR/Cas9技術編輯PFF細胞BMPR-IB基因及BMPs信號通路重要基因表達分析
    楊強,徐盼,蔣凱,喬傳民,任軍,黃路生,幸宇云
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1378-1389.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.015
    摘要 ( 93 )   HTML ( 6 )   PDF (3827KB) ( 281 )   收藏
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    【目的】利用慢病毒介導的CRISPR/Cas9基因組編輯技術獲得編輯BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor, type IB)基因的豬胎兒成纖維細胞(pig fetal fibroblasts, PFF),并研究該基因被編輯后對骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)信號通路中重要功能基因表達的影響。【方法】針對豬的BMPR-IB基因的外顯子8,利用在線軟件http://crispr.mit.edu獲得了21條sgRNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sgRNA與互補序列(包含接頭)退火成雙鏈后連接入線性化的lentiCRISPR v2質粒以獲得打靶質粒,打靶質粒與包裝質粒psPAX2和pCMV-VSV-G按5﹕4﹕1質量比混合后通過293T細胞包裝慢病毒。慢病毒溶液經0.45 μm濾膜回收后與PFF細胞培養液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至終濃度為6 μg·mL-1,在1 000 g轉速、32℃下離心感染PFF細胞1 h。感染3 d后,細胞在含3.5 μg·mL-1嘌呤霉素的培養液中篩選6—7 d,最終獲得編輯BMPR-IB基因的PFF細胞克隆群。針對編輯(打靶)細胞,首先通過T7E1酶切檢測突變體,初步判斷打靶效率,再通過PCR、PCR-TA克隆分析細胞的編輯及脫靶情況。利用RT-PCR檢測編輯和對照組細胞中與BMPs信號通路相關的重要基因的表達情況;Western blotting檢測編輯細胞與對照組細胞中BMPR-IB基因的蛋白表達量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測編輯細胞及對照組細胞的增殖能力。【結果】T7E1酶切及PCR測序均證實PFF細胞成功打靶目標DNA區域;TA克隆測序表明目標區域發生了插入與缺失突變,突變率為70%。針對20個潛在的脫靶位點的TA克隆測序結果表明,僅1個位點出現了10%(2/20)的脫靶情況。RT-PCR結果顯示,打靶細胞與對照組細胞相比,BMPR-IB、CylinD2、Cdk2和Bcl2基因的表達量均極顯著下降(P < 0.01)。Western blotting結果顯示,打靶細胞BMPR-IB基因的表達量較對照組細胞降低62%。CCK-8檢測試驗表明,同一代細胞中,打靶PFF的增殖能力極顯著低于對照組細胞(P < 0.01);打靶細胞中,隨著傳代的(P5、P7和P9)增加其增殖能力極顯著下降(P < 0.01),而對照組細胞不同代次間細胞增殖能力無顯著差異(P > 0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素篩選的影響。【結論】慢病毒介導的CRISPR/Cas9技術可針對PFF細胞快速高效地實現基因編輯;在BMPR-IB基因編輯細胞中,BMPs通路重要功能基因的表達量顯著下降,該基因對PFF細胞的增殖有重要的調節作用。
    用ZBED6基因敲除豬研究心臟發育的分子機制
    王丹丹,唐雨婷,馬月輝,王立剛,潘登科,蔣琳
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1390-1400.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.016
    摘要 ( 96 )   HTML ( 7 )   PDF (1450KB) ( 176 )   收藏
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    【目的】ZBED6基因是一個調控肌肉生長發育的轉錄因子,為了探討 ZBED6 在心肌生長發育中的調控機制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技術比較ZBED6基因敲除巴馬小型豬(ZBED6-KO)和同日齡正常巴馬小型豬(ZBED6-WT)的心臟組織轉錄組,挖掘ZBED6基因的敲除對家豬心臟組織發育及基因表達的影響。【方法】利用t-test對ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織大小的表型特征進行顯著性分析,利用實時熒光定量PCR對ZBED6基因的靶基因IGF2的表達量進行定量。通過制作石蠟組織切片對心肌進行組織學分析,比較其組織結構的差異。提取ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織的總RNA,以Illumina Hiseq 2000平臺進行RNA-Seq分析。以豬Sus_scrofa10.2為參考序列,用轉錄組的標準流程篩選ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織中的差異表達基因,對差異基因進行GO和IPA富集分析。隨機選擇9個差異表達基因,利用實時熒光定量PCR驗證RNA-Seq結果的可靠性。【結果】ZBED6-KO豬心臟重以及IGF2表達量均顯著高于ZBED6-WT豬(P<0.05),與ZBED6-WT豬相比,ZBED6-KO豬肌纖維的寬度較寬,結締組織較少,ZBED6基因的敲除對家豬心臟的生長發育有一定的促進作用;測序結果顯示,各樣本獲得至少10 G的數據量,每個樣本clean ratio、Q30 data均達到90%以上,其中62.8%-80.1%的reads能比對到豬的基因組上,表明測序飽和度良好,測序數據真實可靠;對測序數據進行分析,篩選到 184個差異基因,其中上調的基因114個,下調的基因70個,注釋的141個,未注釋的43個;差異基因層次聚類分析顯示,ZBED6-KO組(x1、x3、x6)的3個個體表達模式相似,ZBED6-WT組(x2、x4、x5)的3個個體表達模式相似;GO和IPA富集分析得到13個顯著的GO條目,33條顯著的pathway通路,差異基因主要富集在免疫反應、肌肉發育和RhoA信號等相關的通路;qRT-PCR 檢測9個差異表達基因的表達模式與RNA-Seq分析結果一致,證實了RNA-Seq結果的可靠性。【結論】首次以ZBED6-KO巴馬小型豬為模型,利用RNA-Seq技術探究了ZBED6敲除對心臟發育和功能的影響,豐富了ZBED6 對心臟發育和功能的研究。
    家蠶glial cell missing (BmGcm)基因鑒定、表達、亞細胞定位和功能
    張奎,潘光照,蘇晶晶,談娟,徐曼,李鈺添,崔紅娟
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1401-1411.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.017
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    【目的】鑒定、克隆家蠶(Bombyx mori)glial cell missing (BmGcm)基因,分析其mRNA表達及亞細胞定位特征。制備多克隆抗體,同時在細胞水平進行過表達,檢測Gcm對細胞增殖和周期的影響,為探究BmGcm功能打下基礎。【方法】利用RACE方法克隆獲得BmGcm全長cDNA序列,利用ORF Finder和SMART等在線工具對BmGcm基本序列特征和結構信息進行分析,運用Clustalx 和MEGA 6.0等軟件對多物種Gcm蛋白進行同源序列比對和進化分析。采用RT-PCR和qRT-PCR方法檢測BmGcm的表達情況。利用原核表達系統獲得重組蛋白,通過蛋白純化和免疫小鼠制備多克隆抗體,運用Western blot對抗體進行檢測。構建BmGcm表達載體,轉染家蠶胚胎細胞系,分析其亞細胞定位情況,同時利用EDU細胞增殖標記和流式細胞儀對其功能進行探索。【結果】BmGcm(BGIBMGA006182)定位于4號染色體的nscaf2847上,其基因全長 4 046 bp,包含4個外顯子和3個內含子。其cDNA全長1 734 bp,包含166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整開放閱讀框(ORF)。該基因編碼446個氨基酸殘基,預測蛋白分子量為50.61 kD,等電點5.557,含有典型的GCM結構域。多重比對結果顯示GCM結構域在不同物種間具有高度的保守性,進化分析顯示昆蟲Gcm蛋白單獨聚為一支,其中BmGcm蛋白與帝王蝶同源蛋白親緣關系最為接近。表達分析結果顯示BmGcm在胚胎發育第4天表達達到峰值,隨后表達水平逐漸下調,而在幼蟲階段,BmGcm主要表達于中腸、精巢和卵巢。將BmGcm完整的開放閱讀框序列構建至原核表達系統,經IPTG誘導和親和層析純化獲得高純度重組蛋白,通過免疫小鼠獲得了多克隆抗體,Western blot檢測該抗體可以特異性識別重組蛋白。在家蠶細胞系中過表達BmGcm蛋白,結果顯示其定位于細胞核。在細胞水平,過表達BmGcm會明顯抑制細胞增殖,將細胞周期阻滯于G1/S期。【結論】克隆鑒定得到Bmgcm全長序列,獲得其表達和亞細胞定位信息。通過原核表達、蛋白純化和免疫小鼠制備了可用的多克隆抗體。細胞實驗發現BmGcm可以顯著抑制增殖和影響正常的細胞周期進程。
    農業經濟及管理
    基于產業要素年代差距分析的農業現代化水平國際比較研究
    胡志全,朱殿霄,辛嶺,侯麗薇,王東陽
    中國農業科學. 2018, 51(7):  1412-1420.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.018
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    【目的】農業現代化是中國“四化同步”的重要組成,分析中國與發達國家農業現代化發展的相對差距,界定中國農業發展的全球定位。【方法】FAO在相關研究中提出:農業現代化發展是一個漸進的規律性過程,該過程伴隨著一系列基本特征的趨勢性變化。承認農業現代化發展內在的規律性是進行農業現代化水平國際比較的前提條件。在此基礎上,論文提出如下兩個核心假設作為使用年代差距進行農業現代化發展水平國際比較探究的基礎:①不同國家農業現代化發展具有共性特征,不同國家的農業現代化發展會經歷相同的歷史階段,在不同階段表現出大致相同的特征。②核心指標在農業現代化某階段的單位變化率相同,即不同國家的相關指標在相同發展階段面臨相同的變化率。據此提出計算不同指標序列年代差距的核心計算公式:Dj=Ya-Wjb±(Xa-Xjb)/Xjb。論文在充分借鑒國內外學者相關研究的基礎上,建立了包含農業經濟效益、經濟結構轉型、農村經濟社會發展、農業可持續發展4個一級指標和10個二級指標組成的綜合評價體系。選定美國、英國、日本、印度、巴西、南非六國作為國際比較的典型國家。其中美、英、日三國農業現代化起步早,在農業現代化發展過程中表現出的歷史特征,可以作為中國農業現代化發展的長期對照,中國、印度、巴西、南非同為高速變革的發展中國家,面臨眾多相同的機遇和挑戰,宏微觀政策各有得失,經驗教訓更為深刻,將巴西、印度、南非作為典型國家作對比具有參照意義。【結果】測算表明,中國農業現代化發展總體水平大體相當于美、英等國20世紀60年代末到80年代初水平,同日本20世紀90年代初期水平相當,與印度、巴西等國基本處于相同的發展階段。從分項指標看,中國的農業現代化存在自身發展不均衡問題,各核心指標分化較為嚴重,耦合性不高,這種不均衡限制了農業現代化總體水平進一步提高。【結論】基于年代差距法的農業現代化水平國際比較方法具有操作簡單,易理解,結果直觀的特點,可作為分析農業現代化問題,評估農業現代化發展水平的有效工具。
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