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當期目錄

    2018年 第51卷 第9期 刊出日期:2018-05-01
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    水稻短穗小粒突變體sps1的鑒定與基因精細定位
    謝佳,張孝波,陶怡然,熊毓貞,周倩,孫瑩,楊正林,鐘秉強,桑賢春
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1617-1626.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.001
    摘要 ( 141 )   HTML ( 7 )   PDF (2610KB) ( 384 )   收藏
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    【目的】通過對一個水稻短穗小粒突變體的鑒定與基因精細定位,為水稻等禾本科作物的籽粒發育及分子改良奠定基礎。【方法】在水稻EMS誘變體庫中鑒定到一個短穗小粒突變體,暫命名為sps1shorten panicle and seed 1)。成熟期觀察野生型和sps1的形態變化,考察株高、節間長、穗實粒數、結實率和千粒重等農藝性狀;對野生型和sps1籽粒外稃內外表皮中部進行掃描電鏡觀察,并利用石蠟切片進一步分析野生型和sps1籽粒的形態變化;配制縉恢10號/sps1雜交組合進行遺傳分析,并利用其F2群體進行基因精細定位;對野生型和sps1兩葉一心期的葉鞘進行油菜素內酯(brassinolide,BR)敏感性試驗;抽穗期分析SPS1在水稻根、莖、葉、鞘和穗中的表達,并對籽粒發育相關基因和BR相關基因進行qPCR分析。【結果】sps1穗和倒1、2、3的節間長度均極顯著短于野生型,導致株高半矮化;此外,sps1穗枝梗數、結實率和千粒重也顯著降低;掃描電鏡觀察發現sps1外稃中部內外表皮細胞長度極顯著小于野生型,寬度則極顯著變大,石蠟切片觀察進一步證實了sps1籽粒寬短是由細胞變短、變寬造成的;籽粒發育相關基因qPCR分析發現,部分通過調控細胞分裂和擴展進而影響水稻籽粒發育的基因表達量發生了顯著變化,在sps1中,AFD1SLGHGWGS3的表達量顯著上調,GW7GID1顯著下調;選取符合3﹕1分離比例的F2代分離群體中的突變單株進行基因定位,最終將調控基因精細定位在第7染色體上標記sps1-3和sps1-2之間134 kb的物理范圍內,包含19個注釋基因;經測序,與野生型相比,發現sps1中的Os07g0616000在編碼區有一個A-T的堿基替換,致使編碼的賴氨酸變成了終止密碼子,導致蛋白翻譯提前終止,初步確定為候選基因。qPCR分析發現SPS1在水稻的根、莖、葉、鞘和穗中均有表達,且在莖稈中的表達量最高;生物信息學分析發現,SPS1DEP2的一個新等位基因。sps1對外源BR的敏感性降低,BR鈍感基因D1的表達極顯著下調;推測SPS1/DEP2可能通過BR信號傳導途徑調控水稻籽粒和株型的發育。【結論】sps1是一個水稻短穗小粒突變體,SPS1編碼一個表達蛋白,是DEP2的新等位基因,通過BR信號傳導途徑調控水稻籽粒和株型的發育。
    谷子穗頂端敗育突變體sipaa1的表型分析和基因定位
    薛紅麗,楊軍軍,湯沙,智慧,王蕊,賈冠清,喬治軍,刁現民
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1627-1640.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.002
    摘要 ( 141 )   HTML ( 14 )   PDF (4166KB) ( 237 )   收藏
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    【目的】穗發育對于農作物產量至關重要,而穗頂端敗育谷子產量下降的重要原因之一。通過挖掘谷子穗頂端敗育的相關基因,探求谷子穗頂端發育的生物學通路,以期為谷子穗發育遺傳機理研究提供理論基礎。【方法】利用化學誘變劑甲基硫酸乙酯(ethyl methyl sulfonate,EMS)對野生型豫谷一號(Yugu1)進行誘變,在其后代中發現了一個可以穩定遺傳的穗頂端敗育的突變體,命名為sipaa1,同時對該突變體的農藝性狀進行鑒定。以突變體sipaa1母本,SSR41父本構建的F2定位群體為材料進行遺傳分析及圖位克隆,確定基因所屬染色體以及在該染色體上的位置。對突變體sipaa1和野生型Yugu1的BC1F2進行高通量測序,挖掘定位區間內的候選基因,根據候選基因在谷子不同組織部位表達量的差異,找出在穗部高表達的候選基因。對孕穗期的Yugu1和sipaa1進行轉錄組測序,尋找差異表達基因并分析差異表達基因富集的生物學通路。【結果】與Yugu1相比,突變體sipaa1的平均株高略有增高,增幅不顯著,葉長、葉寬分別降低了10.66%和5.08%。突變體的表型變異主要集中在穗部,最突出的表現是穗頂端小花發育異常,谷穗長和谷穗粗分別降低了11.36%和16.12%,單株穗重、谷碼數、單穗粒重及千粒重分別降低了30.02%、32.58%、30.55%和18.18%。通過對sipaa1×SSR41的F2代群體中正常株與突變株的遺傳分析表明該突變為隱性單基因控制。經圖位克隆將突變基因定位于第1染色體Indel標記1-9.23與1-9.333之間約100 kb的范圍內。結合高通量測序數據庫,在該定位區間篩選到6個在穗部高表達的候選基因。轉錄組測序發現,在突變體與野生型之間存在2 768個上調表達基因,507個下調表達基因,且定位區間內有2個差異表達基因主要與激素信號轉導、外界脅迫響應、植物-病原互作等生物學通路有關。【結論】谷子穗頂端敗育突變體sipaa1由隱性單基因控制,突變基因位于第1染色體Indel標記1-9.23與1-9.333之間,轉錄組測序與基因功能分析發現了2個在穗部高表達且與植物花器官發育及脅迫響應密切相關的候選基因,候選基因可能通過對激素、脅迫響應,以及細胞程序性死亡等相關通路調控谷子穗頂端敗育
    利用回交和標記輔助選擇快速培育高油酸花生品種及其評價
    張照華,王志慧,淮東欣,譚家壯,陳劍洪,晏立英,王曉軍,萬麗云,陳傲,康彥平,姜慧芳,雷永,廖伯壽
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1641-1652.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.003
    摘要 ( 131 )   HTML ( 15 )   PDF (2237KB) ( 425 )   收藏
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    【目的】高油酸育種是花生品質改良的重要方向,利用回交育種結合標記選擇可快速實現現有推廣品種的高油酸化改良,探討利用這一技術體系進行花生高油酸遺傳改良的實踐和效率。【方法】以目前推廣的優質高產抗病品種中花16、中花21、泉花551、徐花13為輪回親本(母本,基因型AABB),以高油酸材料冀花13為非輪回親本(父本,基因型aabb)配制4個雜交組合,一年種植兩季并進行人工雜交或自交,夏季在武漢種植,冬季在湛江南繁基地種植,通過1次雜交、4次回交和1次自交得到BC4F2后代。利用PCR產物測序方法,鑒定雜交和回交后代的基因型:根據回交后代基因型分離規律及ahFAD2AahFAD2B序列高度同源性的特點,用引物F0.7/R3在一個PCR反應內同時高效擴增F1和回交后代(BC1F1-BC4F1)的ahFAD2AahFAD2B片段,并利用R3作為測序引物進行反向測序,讀取測序峰圖判別基因型,在回交后代中篩選基因型AaBb的后代作為下代回交父本。自交后代(BC4F2-BC4F3)基因型鑒定采用KASP分型,獲得高油酸(基因型aabb)后代。對獲得的基因型為aabb的高油酸后代與其對應輪回親本進行重要農藝性狀、品質和重要抗病性的調查和SSR標記檢測。【結果】在3年時間內,4個組合分別獲得10、5、6、8株BC4F2高油酸純合隱性基因型(aabb)單株,通過一代自交獲得相應的BC4F3株系,對獲得的高油酸株系與輪回親本進行植物學、農藝性狀、品質和青枯病抗性的考察,最終,4個組合均獲得了與輪回親本綜合性狀最接近的株系,分別為ZJ019、ZJ109、ZJ160和ZJ805,其油酸含量為82.54%、79.85%、79.22%、和78.94%,可作為輪回親本對應的高油酸新品種。另外,本研究還對中花16回交組合中獲得的高油酸株系的遺傳背景進行了SSR分子檢測,發現ZJ019株系的回復率達94.8%,在該組合中回復率最高,這一結果與植物學、農藝性狀鑒定的結果一致。【結論】利用連續回交、南繁加代和分子標記輔助選擇等技術可在3年內快速實現現有推廣花生品種的高油酸化改良
    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    水稻根際和非根際土磷酸酶活性對碳、磷添加的響應
    劉玉槐,魏曉夢,魏亮,祝貞科,葛體達,張艷杰,魯順保,吳金水
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1653-1663.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.004
    摘要 ( 121 )   HTML ( 13 )   PDF (471KB) ( 504 )   收藏
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    【目的】研究外源養分添加對稻田土壤磷酸酶活性影響的特征,明確水稻根際和非根際土壤胞外磷酸酶活性對碳、磷添加的響應過程,為稻田土壤水肥管理,實現農業可持續利用提供理論指導。【方法】選取湖南長期種植水稻的典型缺磷水稻土,進行盆栽試驗。試驗設置4個處理,分別為不添加碳磷(CK)、添加碳(C)、添加磷(P)和添加碳磷(CP)。采用96微孔熒光法測定根際土與非根際土的酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)活性,同時基于生物可利用性的磷分級方法(BBP法)測量4種磷組分(CaCl2-P、Citrate-P、Enzyme-P和HCl-P),探討碳、磷添加對4種生物有效性的磷組分的影響和土壤磷酸酶活性的響應特征。【結果】與CK相比,C、P添加和CP配施處理水稻地上部分生物量分別增加29.76%、84.03%和87.94%(P<0.05),地下部分生物量分別減少20.13%、增加57.49%和56.53%(P<0.05);植物全磷(TP)含量與生物量變化規律一致,C、P和CP添加處理地上部分TP含量比CK分別增加57.23%、95.21%和95.91%(P<0.05),地下部分TP含量比CK分別減少26.12%、增加45.45%和38.01%(P<0.05)。根際土pH、NH4+-N和Olsen-P的含量低于非根際土,CP配施處理中根際土微生物量磷(MBP)含量高于非根際土;碳、磷添加對4種基于生物有效性磷組分具有顯著調控作用(P<0.05);Olsen-P和MBP與ALP呈極顯著負相關(P<0.05),與ACP無顯著相關性,表明微生物對速效養分利用明顯。冗余分析表明非根際土壤中的酶活性變化主要受Olsen-P、MBP、CaCl2-P和Citrate-P含量影響;而土壤中含水量、pH、NH4+-N、根系生物量、HCl-P和Enzyme-P含量主要影響水稻根際土壤中的酶活性。【結論】P和CP配施處理能提高缺磷水稻土微生物活性,顯著增加水稻生物量,提升根際微生物效應,改善土壤環境,有利于稻田生態系統的健康。
    麥玉復種體系下秸稈還田與施氮對作物水氮利用及產量的效應研究
    楊晨璐,劉蘭清,王維鈺,任廣鑫,馮永忠,楊改河
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1664-1680.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.005
    摘要 ( 108 )   HTML ( 3 )   PDF (4429KB) ( 498 )   收藏
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    【目的】探究陜西關中地區麥玉復種體系下作物生產過程對秸稈還田與氮肥合理配施的響應,為實現當地糧食作物增產及資源高效利用提供理論依據。【方法】本研究于2011年10月至2016年10月,在陜西楊凌地區設置連續5年的定位試驗。采用二因素裂區設計,主區為秸稈還田,設秸稈還田(S)和秸稈不還田(S0)2個水平;副區為施氮量,設常規施氮(F1)、減量施氮(F0.8)、不施氮(F0)3個水平,對冬小麥與夏玉米籽粒產量及水肥利用狀況進行測定分析。【結果】秸稈還田與施氮及二者交互作用對麥玉兩作物產量及其構成因素、水肥利用效率等方面有顯著或極顯著影響。秸稈還田較不還田處理顯著提高土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量,分別達6%—14%、8%—34%、3%—5%、3%—10%;同時顯著提高麥玉播種前及收獲后0—100 cm土層的儲水量,播種前及收獲后5季均值分別增加5%—11%、12%—15%(麥)和4%—9%、11%—17%(玉)。與不施氮處理相比,施氮顯著提高土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量;并顯著提高了秸稈還田水平下麥玉播前及收后土壤儲水量。在產量和水氮利用方面,秸稈還田較不還田處理分別顯著提高了2012—2016 4季冬小麥和5季夏玉米產量,其中,冬小麥每年依次提高4%—6%、5%—10%、7%—10%、8%—12%,夏玉米依次為1%—2%、3%—6%、4%—7%、5%—8%、3%—7%;秸稈還田顯著提高麥玉水分利用率WUE,5季均值分別增加4%—7%和8%—11%;并顯著提高2012—2016 4季麥玉氮肥偏生產力PEPN、2012—2016 4季冬小麥和5季夏玉米農學利用率AEN。施氮較不施氮處理顯著提高麥玉產量,且均以F1處理最高,冬小麥F1處理在兩秸稈還田水平下分別較F0處理顯著增產30%—38%(S)和29%—33%(S0),夏玉米為21%—25%(S)和19%—22%(S0);施氮顯著提高了兩作物WUE,S0水平下F1處理WUE均值最高,S水平下F0.8處理WUE均值最高;F0.8較F1處理在5季中均顯著提高作物PEPN和AEN,5季均值最高的SF0.8處理較最低的S0F1處理分別增加31%和30%(麥)、30%和31%(玉)。經濟效益方面,秸稈還田較不還田處理提高了麥玉凈收益均值,分別為808—1 258元和733—1 212元;施氮較不施氮處理提高兩作物凈收益,施氮處理中以F0.8處理獲得收益最大。麥玉5年凈收益均呈現出SF0.8>SF1>S0F0.8>S0F1>SF0>S0F0的趨勢,其中SF0.8處理下凈收益均值較CK分別增加3 052元和2 145元。【結論】長期秸稈還田配減量施氮在保證冬小麥及夏玉米維持較高產量的情況下,顯著改善作物水肥利用情況。綜合考慮作物產量、水肥利用效率及經濟效益,不同處理間以秸稈全量還田配施減量氮肥處理效果最優。
    耕地復種指數研究的關鍵科學問題
    吳文斌,余強毅,陸苗,項銘濤,謝安坤,楊鵬,唐華俊
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1681-1694.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.006
    摘要 ( 124 )   HTML ( 5 )   PDF (1083KB) ( 256 )   收藏
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    在當前耕地外延式擴展難以滿足、糧食單產提升難度加大的新形勢下,提升耕地復種指數、走耕地內涵式集約利用模式,是確保未來我國糧食增產和國家糧食安全的重要途徑。本文從農業土地系統科學視角出發,系統總結了耕地復種指數研究的總體研究框架和核心研究內容,全面梳理了國內外該領域的研究現狀、進展及存在的問題。研究認為,第一,格局與過程探測是耕地復種指數研究的重要基礎。不僅要關注耕地潛在或實際復種指數的數量、空間分布、區域差異及其時空變化過程,更要關注耕地復種指數的提升空間,科學描述可挖掘的復種潛力。第二,功能與效應分析是耕地復種指數研究的核心內容。現有研究多聚焦耕地復種指數提升對糧食產量增加的貢獻作用,復種指數變化的生態環境效應研究以微觀試驗性研究為主;迫切需要建立綜合效應分析框架,從不同的學科、視角和尺度揭示耕地復種指數對區域資源配置、社會經濟和生態環境等的影響和反饋機制。第三,優化調控是耕地復種指數研究的關鍵任務。科學提出可持續挖掘和提升耕地復種潛力的策略,重點強化可持續性評估、障礙性因子分析和系統性優化調控等方面的研究,追求糧食安全、資源安全和生態安全的權衡協調,以建立人地和諧、可持續的農業土地利用模式。耕地復種本質上反映了復雜的“人-地”耦合關系,多數據、多尺度、多模型和多方法的綜合研究將是未來耕地復種指數研究的重要發展方向,將會促進自然科學、工程科學和社會科學等多個學科門類的綜合、交叉和集成研究。
    植物保護
    利用酵母同源重組系統快速構建柑橘葉斑駁病毒的侵染性克隆
    崔甜甜,晏建紅,賓羽,李中安,周常勇,宋震
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1695-1705.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.007
    摘要 ( 102 )   HTML ( 3 )   PDF (2987KB) ( 329 )   收藏
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    【目的】構建柑橘葉斑駁病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)中國分離株的侵染性克隆,為從分子水平解析其致病機理打下基礎。【方法】以GeneArt® pYES1L Vector為模板,PYES2117F、PYES2117R為引物擴增含有酵母相關復制起始位點的片段pYES1L-2117,利用限制性內切酶Sac II單酶切雙元載體DK1317-2并回收其大片段,利用In-Fusion HD Cloning Kit重組連接雙元載體DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-農桿菌-大腸桿菌中復制的三元穿梭載體pCY。以馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)全長cDNA侵染性克隆為模板,pCY-PVX-F、pCY-PVX-R為引物擴增PVX全長,采用限制性內切酶Stu I、Sma I酶切質粒pCY,采用醋酸鋰轉化法將獲得的PVX基因組全長cDNA與線性化的pCY載體共轉化酵母菌YPH501,通過同源重組獲得PVX基因組全長cDNA克隆。通過農桿菌介導接種本生煙驗證所構建克隆的侵染性,從而建立基于酵母同源重組的病毒侵染性克隆快速構建體系。在此基礎上,以CLBV中國分離物(CLBV-HBYD)全長cDNA為模板,分段擴增其基因組,得到片段CLBV-1、CLBV-2;利用所建體系對CLBV-1、CLBV-2及pCY載體片段進行同源重組。得到重組質粒pCY-CLBV后,經農桿菌介導接種本生煙和錦橙幼苗,并利用RT-PCR和Northern blot檢測其侵染性。【結果】建立了酵母-大腸桿菌-農桿菌的三元穿梭載體PCY,該載體全長10 347 bp,含有酵母、農桿菌、大腸桿菌的復制位點,能在酵母-農桿菌-大腸桿菌穩定復制,可用于在酵母中通過同源重組快速構建病毒基因組全長cDNA克隆,也可用于通過農桿菌介導直接接種植物寄主。利用該體系獲得了CLBV中國分離株的基因組全長cDNA克隆16個。隨機選取1個克隆進行了序列測定(GenBank登錄號:MG572236),其基因組全長8 747 nt,包含3個開放閱讀框(open reading frame,ORF),ORF1為5 889 nt、ORF2為1 089 nt、ORF3為1 092 nt。全基因組序列比對顯示,CLBV-HBYD與已登錄的9個CLBV分離物的核酸序列一致性為79%—98%,其中與柑橘來源的EU857540一致性最高,為98%,與獼猴桃來源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均為79%。在利用MEGA6 軟件構建的系統發育樹上,CLBV-HBYD與柑橘來源的CLBV分離株聚為一簇,而獼猴桃來源的CLBV分離株聚為另一簇。將所獲16個CLBV全長cDNA克隆轉化農桿菌,以pCY空載體為陰性對照注射接種本生煙。接種20 d后,抽提RNA進行RT-PCR檢測,結果表明11個克隆的接種植株檢測出CLBV特異性條帶;隨機選取5個陽性克隆進一步進行了Northern blot雜交,結果顯示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接種的本生煙可以檢測到CLBV特異性條帶,而對照樣本未檢測到任何條帶,表明這些克隆均為侵染性克隆。【結論】構建了基于三元穿梭載體pCY的酵母重組克隆體系,利用該體系獲得了中國CLBV分離株的適于農桿菌介導接種的基因組全長cDNA侵染性克隆。
    蘋果褪綠葉斑病毒RT-LAMP檢測方法的建立
    張雙納,李正男,范旭東,張尊平,任芳,胡國君,董雅鳳
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1706-1716.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.008
    摘要 ( 111 )   HTML ( 6 )   PDF (3392KB) ( 162 )   收藏
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    【目的】建立一種利用反轉錄環介導等溫擴增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技術簡便、快速檢測蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)的方法。【方法】在ACLSV基因組序列的3個保守區域設計3組引物,每組引物包括一對外引物(F3/B3)和一對內引物(FIP/BIP),從3組引物中篩選出一組效果最好的引物。對RT-LAMP反應體系,即Mg2+、dNTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3濃度進行優化,Mg2+濃度梯度設置為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L-1dNTPs濃度為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1Betaine濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L-1FIP/BIP濃度為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 µmol·L-1F3/B3濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4 µmol·L-1;優化RT-LAMP反應條件,采用已優化的反應體系,設置65、63、61、59、57℃ 5個不同的反應溫度,反應時間設定為90 min。在引物篩選和反應體系反應條件優化過程中,使用熒光定量PCR儀,在反應體系中加入熒光染料,利用熒光信號積累實時監測整個反應過程,根據擴增曲線判斷反應結果。以攜帶蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、蘋果花葉病毒 (Apple mosaic virus , ApMV)的植株葉片中提取的總RNA為模板測試RT-LAMP檢測方法的特異性。將含ACLSV的葉片總RNA原液進行10倍梯度稀釋,以RNA原液和10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液作為模板,進行RT-LAMP反應,測試RT-LAMP檢測方法的靈敏性。隨機采集23株蘋果樹的葉片,同時進行RT-LAMP和RT-PCR檢測,加入SYBR GreenⅠ進行可視化檢測。【結果】建立了ACLSV RT-LAMP檢測方法,優化的檢測體系為:6.0 mmol·L-1 Mg2+1.2 mmol·L-1 dNTPs、0.2 mol·L-1 Betaine、1.6 µmol·L-1 FIP/BIP和0.2 µmol·L-1 F3/B3引物,最佳反應條件為59℃,60 min。特異性檢測中,僅ACLSV檢測結果為陽性,對照組均為陰性。靈敏性檢測中,RT-LAMP方法最低可檢測到10-3 RNA稀釋液,靈敏度是RT-PCR方法的100倍。隨機采取的23株蘋果葉片樣品RT-PCR陽性檢出率為52.2%,RT-LAMP陽性檢出率為65.2%,RT-LAMP的檢出率高于RT-PCR。【結論】建立的ACLSV RT-LAMP檢測方法具有簡便、快速、靈敏性高、成本低等特點,可滿足基層、科研部門在田間調查、種苗繁育和海關檢疫中快速檢測ACLSV。
    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    農田不同粒級土壤含水量光譜特征及定量預測
    盧艷麗,白由路,王磊,楊俐蘋
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1717-1724.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.009
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    【目的】土壤含水量是土壤屬性的關鍵參數。摸清不同機械組成條件下土壤水分的光譜變化并實現土壤含水量的定量預測,為農田水分的快速監測及土壤其他屬性的定量獲取提供依據。【方法】通過人為控制獲得不同粒級和不同含水量的土壤樣品,確定室內土壤光譜測定的幾何條件,采集不同土樣的光譜特征并進行比較,按粒徑等級利用最小二乘法(PLSR)建立農田土壤含水量的光譜定量預測模型。【結果】土壤光譜反射率總體趨勢是隨含水量增加而降低,其差異隨著波長的增加和含水量的降低而增加,在1 400 nm和1 900 nm的水分敏感波段隨含水量增加光譜吸收深度也增加。但當含水量大于40%時,通過孔徑為0.15 mm 篩子的土壤樣品(處理D-1),在350—1 240 nm光譜反射率隨含水量增加而升高,而1 240 nm以后隨含水量增加而降低。相對于將所有樣本數據混合建立模型,分粒級建立的模型在細顆粒土壤中預測效果得到了明顯改善,并且樣品越細模型在預測效果和穩定性也越好:最優模型均方根誤差RMSE=4.13%,決定系數R2=0.90。同時,數據歸一化處理后所建立的模型在一定程度上降低了噪聲的影響,從而在預測效果和穩定性上也有所改善。【結論】土壤光譜隨含水量的變化而變化,但并不都表現隨含水量增加光譜反射率降低的特點,當含水量大于40%時,細顆粒土壤樣本表現為在350—1 240 nm波段光譜反射率隨含水量增加而升高;土壤含水量預測模型的精度和穩定性隨著土壤粒徑變小、樣本量增大以及光譜數據歸一化預處理而得到改善。
    氮肥與雙氰胺配施對溫室番茄生產及活性氮排放的影響
    尹興,張麗娟,李博文,劉文菊,郭艷杰,李玉濤
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1725-1734.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.010
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    【目的】研究田間條件下氮肥與硝化抑制劑雙氰胺(dicyandiamide,DCD)配施對溫室番茄產量、品質及活性氮損失的影響,明確DCD在棚室蔬菜生產體系中的作用及其硝化抑制效果,為氮肥減施增效提供依據。【方法】試驗在河北省永清縣番茄主產區北岔口村進行,供試作物為番茄。試驗設5個處理,分別為不施氮對照(N0)、傳統施氮(Con)、傳統施氮+雙氰胺(Con+DCD)、減量施氮(Opt)和減量施氮+雙氰胺(Opt+DCD),定期對溫室番茄追肥期間土壤無機氮、N2O排放量和NH3揮發損失量等指標進行測定。利用流動分析儀測定土壤無機氮含量,氣相色譜儀測定N2O排放量,硼酸吸收-標準稀酸滴定法測定NH3揮發量。應用SAS軟件對不同處理的產量、品質和各個指標進行方差分析。【結果】氮肥與DCD配施可以提高番茄產量,Con+DCD較Con、Opt+DCD較Opt處理分別提高了20.2%和2.4%,其中Con+DCD產量顯著高于Con;同時,Con+DCD和Opt+DCD的氮肥農學效率(NAE)和氮肥偏生產力(PFP)均顯著高于Con和Opt,其中Con+DCD較Con、Opt+DCD較Opt處理的NAE分別提高了176.7%和22.3%;此外,配施DCD顯著降低了棚室番茄果實的硝酸鹽含量,Con+DCD較Con、Opt+DCD較Opt處理分別降低了28.6%和19.3%,其他品質指標處理間差異不顯著。氮肥與DCD配施顯著降低了NO3--N在0—100 cm土層的累積,Con+DCD和Opt+DCD的NO3--N累積量分別為607.1和441.8 kg·hm-2,較Con(708.4 kg·hm-2)和Opt(524.2 kg·hm-2)降低了14.3%和15.7%。各處理N2O排放通量和NH3揮發速率的峰值分別出現在施肥后第3天和第2天,總體來看,DCD能有效降低N2O排放和NH3揮發損失,Con+DCD較Con、Opt+DCD較Opt處理的N2O累積排放量和NH3揮發累積量分別降低了51.2%、75.4%和17.2%、21.9%。【結論】在本試驗條件下,氮肥與DCD配施提高了溫室番茄的產量、氮肥農學效率和氮肥偏生產力,減少了土壤NO3--N在0—100 cm土層的累積,降低了N2O排放量和NH3揮發損失量,且以減氮50%并配施DCD(Opt+DCD)的效果最好。因此,在溫室番茄生產中,適當減氮并配施DCD是一種科學有效的施肥管理方式。
    香草酸對花生種子萌發、幼苗生長及根際微生物區系的影響
    黃玉茜,楊勁峰,梁春浩,陳堔平一,劉欣宇,耿坷睿,姚玉晨,張宇,韓曉日
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1735-1745.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.011
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    【目的】探討酚酸類自毒物質香草酸的自毒作用,研究其對花生種子萌發和幼苗生長的影響,揭示根際土壤微生物在花生生育期內對自毒物質的響應規律。【方法】以花生品種阜花12號150GY為試材,培養皿培養試驗設6個處理:0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mmol·L-1香草酸溶液;營養缽種植試驗設5個處理:0、0.01、0.03、0.05、0.07 mmol·L-1香草酸溶液;盆栽試驗設5個處理:香草酸用量分別為0、0.01、0.03、0.05、0.07 mg·kg-1干土。分別研究外源添加香草酸對花生種子萌發、幼苗生長及根際微生物區系的影響。【結果】(1)經不同濃度香草酸溶液處理后,花生種子的發芽率、發芽勢和發芽指數均低于CK,與對照存在顯著性差異。當香草酸溶液濃度為0.09 mmol·L-1時,發芽率、發芽勢和發芽指數與對CK相比分別降低39%、66.3%和55.9%,自毒效應響應指數達到最大值。(2)經不同濃度香草酸溶液處理后,花生幼苗的主根長、單株干重、葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導度均低于CK,與對照存在顯著性差異,當香草酸溶液濃度為0.07 mmol·L-1時,各指標與對CK相比分別降低37.3%、40.0%、19.0%、53.9%和49.1%,自毒效應響應指數達到最大值。胞間CO2濃度變化趨勢與以上指標相反,隨香草酸濃度的增大而呈現上升趨勢,當香草酸溶液濃度為0.07 mmol·L-1時,胞間CO2濃度比對照提高46.1%。(3)香草酸濃度≥0.03 mmol·L-1時,花生根系總吸收面積、活躍吸收面積和根系活力(活躍吸收面積/總吸收面積)低于CK,葉片的MDA含量高于對照,均與對照存在顯著性差異,當香草酸溶液濃度為0.07 mmol·L-1時,各指標與對照相比分別降低22.4%,54.2%和40.6%,MDA含量提高43.3%。(4)根際放線菌數量在花生生育前期隨著香草酸濃度的增大而顯著降低,進入結莢期后各處理間差異不顯著。根際細菌數量在花生生育前期時各處理間差異不顯著,而進入結莢期后隨著香草酸濃度的增大而顯著降低。高濃度的香草酸(0.07 mg·kg-1干土)對根際真菌生長具有抑制作用,而低濃度的香草酸(0.01 mg·kg-1干土)對根際真菌生長具有促進作用。【結論】香草酸對花生種子萌發和幼苗生長存在一定的抑制作用,香草酸亦會抑制花生幼苗的光合作用,降低根系活力,促進幼苗葉片產生丙二醛。此外,不同濃度的香草酸溶液均會使花生根際細菌和放線菌的數量降低,抑制根際土壤中細菌和放線菌的生長繁殖,而對土壤真菌的影響呈現低促高抑的現象,即低濃度的香草酸溶液促進花生根際土壤中真菌的生長;而高濃度則對真菌生長具有一定的抑制作用。
    園藝
    芥藍BC3代Ogura CMS育性恢復材料的創制及Rfo基因傳遞和背景分析
    于海龍,李志遠,楊麗梅,劉玉梅,莊木,呂紅豪,李占省,方智遠,張揚勇
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1746-1757.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.012
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    【目的】創制Ogura細胞質不育(Ogura CMS)的恢復系是利用Ogura CMS種質資源的有效途徑。本研究基于已獲得的BC2代育性恢復單株15Q23,繼續用芥藍進行回交,通過分析育性恢復基因Rfo的傳遞效率,及BC3Rfo陽性株的遺傳背景、育性表現、結實性和倍性,從而加速甘藍類蔬菜Ogura CMS恢復材料的創制,獲得甘藍類蔬菜Ogura CMS恢復系。【方法】以BC2代育性較好的單株15Q23為父本,Ogura CMS芥藍15Y102為母本進一步回交,利用Rfo特異分子標記對所有回交后代進行篩選,計算BC3Rfo傳遞效率,并調查BC3Rfo陽性單株的形態特征、育性恢復情況、結實性、倍性;選取遺傳背景近于芥藍、結實較好的重點單株繼續回交獲得BC4代,分析BC4Rfo傳遞效率和陽性單株倍性。【結果】在開花的不同時期,單株15Q23花粉活力差異明顯,以不同時期的花粉進行回交的結實性也存在極顯著差異(P<0.01),平均結實率為0.07粒/授粉花蕾(7%)。利用Rfo特異標記對獲得的BC3代單株進行苗期篩選,結果表明,Rfo可穩定傳遞,遺傳背景分析結果表明,BC3代單株與芥藍15Y102遺傳相似系數在0.81—0.92,遺傳背景比BC2代單株15Q23(0.73)更近于芥藍,形態標記聚類結果與遺傳背景標記聚類結果一致。形態觀察發現,BC3單株形態特征都近于芥藍,但生長勢較親本芥藍更強;倍性鑒定結果表明,多數BC3后代接近于四倍體。開花后觀察34個BC3后代單株的育性,有Rfo標記的單株育性均得到恢復。但不同單株間花粉活力存在差異,單株16Q1-4、16Q1-7、16Q1-10在整個花期花粉活力一直在75%以上。利用親本芥藍對花粉活力較好的Rfo陽性單株(花粉活力>50%)進行回交,以單株16Q1-4和單株16Q1-10當父本時結實性最好,結實率分別為15%和9%,顯著高于BC2代陽性單株15Q23(7%,P<0.05)。BC4代單株中Rfo可以穩定傳遞,Rfo傳遞效率接近33%;對以16Q1-4為父本回交獲得的24株陽性株進行倍性檢測,不同單株間倍性差異較大,其中3株的熒光峰值和親本芥藍相近,倍性近于芥藍。【結論】利用芥藍對種間雜交六倍體Rfo陽性株進行第3、第4代回交,Rfo可穩定傳遞,成功獲得了遺傳背景、形態特征近于親本芥藍,結實性較BC2代單株15Q23顯著提升的BC3代Ogura CMS育性恢復材料16Q1-4和16Q1-10。
    不同氮、鉀肥施用量對甜瓜養分吸收、分配及產量的影響
    康利允,常高正,高寧寧,李曉慧,李海倫,梁慎,徐小利,趙衛星
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1758-1770.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.013
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    【目的】通過研究中等肥力土壤條件下不同氮、鉀肥施用量對大棚甜瓜養分吸收、分配及產量的影響,為連棟棚加地膜覆蓋高產栽培條件下合理施用氮、鉀肥提供理論依據。【方法】采用連棟棚加地膜覆蓋栽培,試驗設重氮重鉀(N2K2)、重氮輕鉀(N2K1)、輕氮重鉀(N1K2)、輕氮輕鉀(N1K1)、中氮中鉀(NK)5個處理。以早熟厚皮甜瓜品種‘RX8’(TC620-8-56×TA11-1)為試驗材料,在孕穗期、坐果期及成熟期測定不同器官干物質積累量及氮、磷、鉀養分累積吸收量,并結合成熟期產量,分析不同氮、鉀肥施用量對甜瓜養分吸收、分配及產量的影響。【結果】不同氮、鉀肥施用量對甜瓜干物質積累量及氮、磷、鉀養分累積吸收量的變化趨勢相似,均表現為隨生育期的推進而呈上升趨勢,不同氮、鉀肥施用量只改變不同生育時期干物質積累量及氮、磷、鉀累積吸收量,并不改變其累積趨勢。從干物質積累及分配特性看,伸蔓期,甜瓜以營養生長為主,NK處理根、莖、葉干物質積累量一直呈較高水平,且莖、葉干物質積累量顯著高于其他處理(P<0.05),平均分別增加17.8%、16.0%。隨著果實發育,干物質積累逐漸轉向果實,不同氮鉀處理下果實干物質積累分配系數增加,至成熟期果實干物質積累分配系數高達0.62—0.66,NK處理果實干物質積累量及分配系數均顯著高于其他處理(P<0.05),平均分別增加31.9%、4.27%。從養分積累及分配特性看,甜瓜對鉀需求量最大,氮次之,磷最少,成熟期甜瓜氮、磷、鉀累積吸收量分別高達4 160.4、1 394.8、7 874.2 mg/株。NK處理氮、磷、鉀累積吸收量在伸蔓期、坐果期、成熟期一直呈較高水平,與其他處理相比,NK處理氮、磷、鉀累積吸收量均顯著增加(P<0.05)。NK處理坐果期、成熟期果實氮、磷、鉀分配系數也一直呈較高水平,且成熟期果實氮、鉀分配系數顯著高于其他處理(P<0.05),分別平均增加9.10%、9.81%。從產量及產量構成因素看,同一供氮水平下,高鉀、低鉀處理間甜瓜縱徑、橫徑、果形指數、單瓜重及產量差異均未達5%顯著水平;同一供鉀水平下,高氮處理甜瓜縱徑、橫徑、單瓜重及產量均高于低氮處理,平均分別增加4.81%、6.04%、19.8%及20.5%,且除縱徑外,上述指標差異均達5%顯著水平;從整體看,NK處理甜瓜縱徑、橫徑、單瓜重、產量均最高,且單瓜重和產量顯著高于其他處理(P<0.05),平均分別增加21.6%和22.1%。【結論】土壤中等肥力水平及連棟棚加地膜覆蓋高產栽培條件下,氮、鉀施肥量分別以200 kg·hm-2300 kg·hm-2較為適宜,有利于甜瓜最大限度的提高養分的吸收利用能力,促進養分吸收及營養物質向果實的分配轉移,從而得到高產。
    菊花AINTEGUMENTA克隆與功能分析
    溫立柱,孫霞,樊紅梅,郭蕓琿,于媛媛,任紅,王文莉,鄭成淑
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1771-1782.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.014
    摘要 ( 145 )   HTML ( 3 )   PDF (1908KB) ( 239 )   收藏
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    【目的】從菊花中分離克隆AINTEGUMENTA,分析其序列特征和在菊花中的時空表達特性,通過基因沉默研究其對菊花花序發育的影響,分析可能的調控方式和潛在機理,為菊花花序大小的調控奠定理論基礎。【方法】使用RACE方法從菊花中克隆AINTEGUMENTA全長,通過DNAMAN等軟件對其序列進行分析。采用熒光定量的方式檢測其在菊花不同器官和發育時期的表達。構建35S::CmANT-GFP融合蛋白載體進行亞細胞定位,構建TRV2-CmANT沉默表達載體侵染菊花。使用SPSS軟件統計分析CmANT沉默系菊花表型變化,通過光學顯微鏡觀察舌狀花花瓣表皮細胞變化,使用熒光定量方式檢測CmANT相關基因在沉默系中的表達。【結果】從菊花中克隆了CmANT全長,其編碼的氨基酸序列長度為540,理論等電點為7.39,蛋白質的理論分子量為60.4 kD,含有兩個AP2保守功能區域和VYL修飾位點。在與其他物種的ANT蛋白構建的系統進化樹中,CmANT與AtANT聚在一起。熒光定量結果表明:(1)CmANT在花蕾中的表達量最高,其次是根>莖>葉。(2)在花序不同部位的比較中,舌狀花中的表達量最高,其次是筒狀花,在花萼中的表達量最低。(3)CmANT在舌狀花中的表達隨著發育時期的延續而降低。(4)CmANT在2,4-D誘導下的3—6 h內表達量持續上升。WoLF PSORT軟件預測和35S::CmANT-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞中的定位結果顯示,CmANT蛋白定位在植物細胞核中。TRV-CmANT-1和TRV-CmANT-2沉默系的平均花徑相比對照分別減小18.93%和27.47%,舌狀花的數目分別減少11.39%和14.66%,其中TRV-CmANT-2與對照差異顯著(P<0.05),筒狀花數目分別減少14.55%和36.56%。頂端花序的舌狀花平均長度分別減少34.17%和54.68%,舌狀花的寬度分別比對照減小24.05%和10.13%。葉片平均鮮重分別比對照組減小13.19%和21.98%,葉片鮮重與筒狀花數目顯著相關(P<0.05)。舌狀花花瓣表皮細胞顯微觀察發現,沉默系舌狀花花瓣表皮細胞長度和寬度與對照差異不明顯。CmLAX3在兩沉默系中的表達明顯上升,在小花原基分化期時分別是對照中的1.8和1.78倍,同期CmCYCD3的表達分別下降了32.28%和38.19%,CmXTH4和CmEXPA1的表達量在多個時期也明顯降低。【結論】根據沉默系表型與相關基因的表達,推測CmANT的沉默可能解除了對CmLAX3抑制,促進了生長素的轉運和過量積累,間接抑制了CmCYCD3的活性,限制了細胞的分裂增殖,引發細胞數目變少,導致沉默系器官變小。
    食品科學與工程
    綠豆萌發過程中蛋白組分及亞基變化
    趙天瑤,張亞宏,金濤,康玉凡
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1783-1794.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.015
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    【目的】探索不同萌發時期綠豆分離蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量的動態變化規律,以及蛋白質組分(分離蛋白、球蛋白和清蛋白)的亞基組成及含量變化,為綠豆蛋白的加工利用提供科學依據。【方法】采用等電點沉淀法提取綠豆分離蛋白,并根據Osborne分類法制備綠豆清蛋白、谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白,比較分析萌發前后綠豆分離蛋白及各蛋白組分含量的變化,同時通過SDS-PAGE電泳進一步分析萌發前后蛋白亞基組成及數量的變化。【結果】隨著萌發時間的延長,綠豆分離蛋白的含量呈現先增高后下降的趨勢,萌發36 h時與未萌發的綠豆相比提高了9.4%。綠豆清蛋白含量隨著萌發時間的延長呈逐漸下降的趨勢,萌發84 h時含量最小,為20.47 mg·g-1。球蛋白隨著萌發時間的延長呈現先升高后下降的趨勢,萌發48 h時其含量最大,且比未萌發時提高了3.47倍。萌發對綠豆醇溶蛋白的含量變化影響不大。綠豆谷蛋白含量在萌發12—36 h和48—72 h變化無明顯差異,但相對于未萌發的綠豆仍有一定程度的提高。綠豆蛋白酶活性在萌發36 h后不斷上升,變化相對較大,72 h時開始下降。SDS-PAGE電泳圖及光密度掃描分析結果發現,綠豆分離蛋白主要由7條條帶組成(Ⅰ—Ⅶ),萌發過程中各條帶相對含量不斷減少,隨著萌發時間的延長,分子量在25—66 kD的條帶含量逐漸降低,分子量在18—25 kD的亞基條帶含量在萌發的前72 h有所增加,萌發至96 h時幾乎只剩下Ⅳ條帶。綠豆清蛋白主要由4條條帶組成(Ⅰ—Ⅳ),分子量分別為61.56、48.99、29.88和20.42 kD,萌發過程中條帶Ⅰ相對含量從0 h的18.4%降至60 h的16.4%,萌發72 h后條帶Ⅰ消失;條帶Ⅱ在萌發過程中始終存在,但是含量不斷減少;條帶Ⅲ和條帶Ⅳ也在萌發過程中不斷減少,萌發72 h后消失。同時,分子量為18—25 kD的亞基條帶相對含量在24—60 h增加,萌發至72 h逐漸消失,幾乎只剩下條帶Ⅱ。綠豆球蛋白主要由5條條帶組成(Ⅰ—Ⅴ),分子量分別為66、61、50、32和26 kD。萌發過程中亞基條帶Ⅰ和Ⅱ都在萌發96 h時消失;而條帶Ⅲ在萌發過程前期(0—60 h)相對含量逐漸增大,為34.4%—41.8%,萌發72 h后條帶Ⅲ含量迅速下降,萌發至96 h時僅為10.8%;亞基條帶Ⅳ和Ⅴ萌發至84 h后消失。分子量在18—25 kD的亞基條帶在萌發24—60 h時有所增加,隨著萌發時間的延長,出現降解甚至消失。【結論】適當萌發能提高蛋白的含量,促進大分子亞基發生水解,同時有利于小分子亞基或多肽生成,但萌發時間過長并不完全利于蛋白的利用。
    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    藍塘豬和長白豬骨骼肌差異表達cis-NATs基因鑒定
    許月園,齊曉龍,侯曄,趙云霞,欒宇,周煥煥,趙書紅,李新云
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1795-1805.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.016
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    【目的】通過分析藍塘豬和長白豬生長發育過程中品種間骨骼肌組織差異表達基因及順式天然反義轉錄本(cis-natural antisense transcripts, cis-NATs),并以此為基礎進行整合分析,探索cis-NATs調控豬骨骼肌生長發育的分子機理。【方法】使用差異表達分析鑒定藍塘豬和長白豬胚胎期35 d至出生后180 d共10個時間點品種間差異表達基因及cis-NATs(|log2FC|≥1且 FDR<0.01);然后通過功能富集分析注釋出差異表達基因及cis-NATs對應的正義基因主要參與的GO生物學過程(P<0.01)及KEGG通路(P<0.05);再根據與cis-NATs相關表達的基因數目篩選出cis-NATs主要參與的GO生物學過程和KEGG通路,并根據通路間的相同基因數目對所有KEGG通路進行整合;最后基于通路內cis-NATs及其正義基因在品種間的差異表達倍數進行通路可視化分析。【結果】在藍塘和長白豬骨骼肌發育的10個時間點共鑒定出5 350個品種間差異表達基因和738個差異表達cis-NATs;GO分析結果顯示品種間骨骼肌組織差異表達cis-NATs主要與肌肉發育及能量代謝等GO生物學過程中的基因相關表達;KEGG通路整合分析發現能量代謝通路之間關聯性最強;其中線粒體三羧酸循環通路中基因及其相關表達的cis-NATs在仔豬出生后早期表達量較高;通路可視化分析發現在肌纖維生長的兩個關鍵時間點即胚胎期49 d和77 d,藍塘豬能量代謝相關通路中基因及其相關表達的cis-NATs顯著高表達于長白豬,而出生后品種間表達模式的變化則主要集中在出生后2—90 d的出生后早期階段。【結論】在藍塘豬和長白豬骨骼肌發育的10個時間點,共鑒定出738個品種間差異表達的cis-NATs,功能注釋結果表明這些cis-NATs主要通過與能量代謝通路中的基因相關表達從而參與影響藍塘豬和長白豬品種間骨骼肌纖維發育差異。
    超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中的二氫吡啶
    肖志明,王峻,索德成,魏書林,賈錚,劉成新,樊霞
    中國農業科學. 2018, 51(9):  1806-1814.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.017
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    【目的】二氫吡啶是一種新型的飼料添加劑,具有促進動物生長、提高飼料利用率、改善肉質等功效,目前已在畜牧生產中得到廣泛應用。然而,二氫吡啶并不是允許使用的藥物飼料添加劑,其在飼料中高水平添加所帶來的畜產品中二氫吡啶殘留可引起敏感人群嚴重的低血壓反應。央視3.15晚會曝光了部分飼料企業違規使用二氫吡啶、硫酸黏桿菌素、喹乙醇等獸藥,引起社會的廣泛關注和政府的高度重視,因而亟需建立飼料中二氫吡啶的檢測方法,為飼料企業合理用藥和政府監管提供必要的技術支撐。【方法】采用UPLC上常用的BEH C18色譜柱,分別使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動相,優化了不同組成和比例流動相對色譜分離和質譜電離的影響。在正離子模式下進行母離子掃描,確定準分子離子,優化儀器毛細管電壓、錐孔電壓、霧化氣流速等參數;然后進行子離子掃描,優化碰撞能量、駐留時間等參數,以確定豐度較高的兩個子離子作為定性離子,并選擇其中豐度最高的作為定量離子。比較甲醇、乙腈等不同溶劑對提取效率的影響,以及C18、HLB、MCX和堿性氧化鋁等固相萃取柱(SPE)對凈化效果的影響,確定較優的樣品前處理方法。【結果】優化確定了較佳的前處理方法:采用乙腈超聲提取,提取液在60℃下氮氣吹干,殘余物用乙腈﹕水(1﹕9,v/v)復溶,過HLB固相萃取柱凈化,用乙腈﹕水(9﹕1,v/v)洗脫,洗脫液過0.22 μm有機濾膜后上超高效液相色譜-串聯質譜儀(UPLC-MS/MS)測定。采用電噴霧離子源,在多反應監測(MRM)模式下,二氫吡啶的[M+H]+m/z 254,失去乙氧基(CH3-CH2-O+,46 Da)后產生主要的碎片離子m/z 208,m/z 208脫掉羰基(C=O,28 Da)產生碎片離子m/z 180,m/z 180進一步脫去乙酯基(CO-O-CH2-CH3,73 Da)后得到碎片離子m/z 108,因此本研究以離子對m/z 254>208為定量離子,m/z 254>180為定性離子。以0.1%的甲酸水-乙腈為流動相進行梯度洗脫,在10 min內完成了二氫吡啶的分離,且峰形尖銳,靈敏度高。二氫吡啶在0—500 μg·L-1濃度范圍內呈現良好的線性關系(R2 ≥ 0.9992),根據20個空白樣品的基線噪音,取其平均值,以信噪比(S/N)=3為檢出限(LOD),S/N=10為定量限(LOQ),二氫吡啶的LOD、LOQ分別為10和50μg·kg -1。在10、50和100 μg·kg -1三個添加水平下,二氫吡啶的平均回收率為82.6%—101.0%,日內變異系數為0.8%—6.7%,日間變異系數為4.7%—9.2%。【結論】該方法操作簡便、快速、穩定,適用于飼料中二氫吡啶的日常監測。
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