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當期目錄

    2019年 第52卷 第2期 刊出日期:2019-01-16
      
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    脂肪酸環氧化酶SlEPX轉基因大豆的表型分析
    郝青婷,張飛,吉夏潔,薛金愛,李潤植
    中國農業科學. 2019, 52(2):  191-200.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.001
    摘要 ( 268 )   HTML ( 69 )   PDF (1237KB) ( 152 )   收藏
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    【目的】 植物源環氧化脂肪酸(epoxy fatty acids,EFAs)是生產高值化工產品的優異可再生原材料。EFAs僅在一些野生植物種子中高水平合成和積累,難以規模化利用。通過在普通油料作物大豆(Glycine max (L.) Merr.)發育種子中組裝環氧化脂肪酸合成途徑,以期實現這類珍稀脂肪酸(unusual fatty acids,UFAs)的商業化綠色生產。【方法】 通過構建琉璃菊(Stokesia laevis)脂肪酸環氧化酶(epoxygenase,SlEPX)基因種子特異表達載體,基于體細胞胚發生的粒子轟擊法對大豆(cv. Jack)進行遺傳轉化,經連續選擇和鑒定,獲得表型穩定的高代轉基因大豆株系。分別運用PCR和實時熒光定量PCR檢測外源基因SlEPX的整合及在大豆發育種子中的表達譜。統計分析SlEPX轉基因大豆籽粒形態和大小、百粒重以及種子萌發率等表型,應用氣相色譜和凱氏定氮法測試種子油脂和蛋白等相關生理生化特性。【結果】 外源基因SlEPX穩定整合于大豆基因組,且能在高代轉基因大豆發育種子中正確有效表達。SlEPX轉基因大豆種子新合成積累了2.9%的EFAs,相應的亞油酸(18﹕2Δ9,12)含量減低8%。與對照相比,SlEPX轉基因大豆種子變長,表皮多皺褶。種子大小測量顯示,轉基因大豆小粒種子(粒徑<4 mm)占比明顯增加。轉基因與對照大豆的種子發芽率無明顯差異,然而轉基因植株生長緩慢。轉基因大豆種子油脂含量、蛋白質含量和百粒重分別減少5%、6%和8.28%。進一步生化分析發現,轉基因大豆新合成的EFAs,絕大部分結合于卵磷脂(phosphatidylcholine,PC,占12.6%)分子,僅少量結合于甘油三酯(triacylglycerol,TAG,占2.3%)。這些數據表明在轉基因大豆種子中,外源SlEPX酶能正確催化亞油酸(18﹕2Δ9,12)生成環氧化脂肪酸即斑鳩菊酸(vernolic acid,Va)(12-epoxy-18﹕1Δ9)。但是,絕大多數斑鳩菊酸積累于構成細胞膜的主要成分PC分子中,而沒有轉移整合進入貯藏的TAG分子。大量新合成的斑鳩菊酸結合于PC分子可能損傷宿主細胞膜穩態和生理反應,導致轉基因大豆產生不利表型。【結論】 在大豆發育種子中單獨表達外源脂肪酸環氧化酶,能催化合成少量EFAs,但同時產生一些不利表型。在SlEPX轉基因大豆種子中共表達DGATPDAT,既可實現環氧化脂肪酸在TAG中富集,同時還能消除環氧化脂肪酸在細胞膜中的積累及其所導致的負效應。

    紫花苜蓿MsGAI的克隆、表達及遺傳轉化
    張涵,王學敏,劉希強,馬琳,溫紅雨,王贊
    中國農業科學. 2019, 52(2):  201-214.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.002
    摘要 ( 200 )   HTML ( 26 )   PDF (8066KB) ( 138 )   收藏
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    【目的】 DELLA蛋白屬于GRAS家族,是赤霉素信號轉導途徑中重要的轉錄因子,負向調節GA轉導途徑。克隆獲得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息學特征并預測蛋白結構域。明確紫花苜蓿GAI組織表達特征及不同處理下的表達模式,構建該基因超表達載體并轉入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信號轉導途徑及脅迫條件下的作用機理。【方法】 利用同源克隆的方法,從紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息學方法分析該基因的序列特征,使用MEGA7.0對MsGAI蛋白序列及同源序列進行多序列比對,構建同源物種間的系統發育樹。利用實時熒光定量PCR檢測紫花苜蓿各組織GAI表達量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗處理下,GAI的表達變化。同時對轉基因GAI株系表達水平進行分析,選擇表達量高、中、低株系(L5、L8、L11)分別進行PEG和NaCl處理,分析GAI的表達變化。以pBI121為基礎載體,采用雙酶切-連接的方法構建植物超表達載體35S:MsGAI-gus。將重組載體轉入農桿菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿葉片為外植體,采用農桿菌介導的愈傷組織轉化法轉化紫花苜蓿,經PCR檢測和GUS組織化學染色,得到轉基因陽性苗。【結果】 該基因序列包含有一個1 818 bp的開放閱讀框,編碼605個氨基酸。生物信息學分析結果顯示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型結構域和保守區,其中包含N端保守結構域DELLA和TVHYNP,C端保守結構域SAW。多序列比對及系統進化樹分析表明,該序列與其他物種的DELLA蛋白序列相似度均高達80%以上,將其命名為MsGAI。該基因與蒺藜苜蓿GAI親緣關系最近,其次與鷹嘴豆、紅三葉等雙子葉豆科植物親緣關系較近,與大麥等單子葉植物較遠。實時熒光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各組織中均有表達,根中的表達量最高。經PEG、NaCl、GA以及ABA處理后,均有明顯響應;黑暗處理顯著抑制MsGAI的表達。轉基因株系經PEG、NaCl處理后,GAI表達量均上調。對構建完善的35S:MsGAI-gus植物超表達載體進行雙酶切檢測,瓊脂糖凝膠電泳顯示,條帶大小與預期一致。對轉基因植株進行GUS組織染色驗證,結果表明,陽性植株呈現藍色,對照組為白色。對超表達載體攜帶的MsGAIGUS序列進行PCR檢測均呈陽性。【結論】 紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表達載體構建成功,MsGAI對逆境脅迫有響應。

    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    南方稻區優良食味與高產協同的單季晚粳稻品種特點研究
    胡蕾,朱盈,徐棟,陳志峰,胡兵強,韓超,裘實,吳培,張洪程,魏海燕
    中國農業科學. 2019, 52(2):  215-227.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.003
    摘要 ( 171 )   HTML ( 21 )   PDF (421KB) ( 185 )   收藏
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    【目的】 旨在探究南方稻區不同食味值水平和產量類型單季晚粳稻產量與品質的差異,闡明南方稻區優良食味與高產協同的單季晚粳品種所具有的特征特性。【方法】 本文以南方稻區48個單季晚粳為材料,根據產量和食味值將其分為味優高產、味優中產、味中高產和味中中產4種類型,以實際生產需求為依據,選用味優高產、味優中產和味中高產3種類型進行產量和品質的比較研究。【結果】 味優高產類型的食味值比味中高產類型高26.69%,且味優類型食味值中的外觀、黏度和平衡度分別比味中類型高出38.81%、36.30%和37.40%。與味中高產類型相比,味優高產類型的糙米率、整精米率與堊白粒率、堊白度分別高0.34%、7.13%、40.39%和47.56%;膠稠度長度長19.92%;直鏈淀粉、蛋白質含量低37.67%和33.08%。與味優中產類型相比,味優高產類型的每穗粒數、結實率、千粒重、灌漿結實期的日照時數、成穗率以及抽穗至成熟階段生物積累量占總生物量的比例分別高4.47%、3.29%、5.72%、16.25%、11.09%、21.49%;葉面積衰減率低13.51%。抽穗至成熟階段,味優高產的群體生長率、凈同化率和光合勢比味優中產分別高出24.46%、14.62%和19.01%。【結論】 南方優良食味與高產協同的單季晚粳品種的特征為加工品質達國標1級;透明度等級在3級;堊白粒率和堊白度分別在50%—85%與20%—35%;直鏈淀粉含量、蛋白質含量與膠稠度長度分別在10.0%、8.0%與90.0 mm左右;RVA譜特征值中消減值在-500cP以下,回復值在550 cP—650 cP。產量構成中,味優高產類型品種的結實率在90.0%左右;千粒重在25.0 g以上;且在抽穗前期保持適宜的干物質積累,在抽穗期以后保證葉面積指數、干物質積累量及其所占全生育期的積累比例有較高的水平。

    青稞抗倒伏性狀的基因型差異
    白羿雄,姚曉華,姚有華,吳昆侖
    中國農業科學. 2019, 52(2):  228-238.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.004
    摘要 ( 120 )   HTML ( 16 )   PDF (370KB) ( 123 )   收藏
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    【目的】 倒伏是影響青稞生產和產量的主要原因之一。篩選與青稞抗倒伏性密切相關的性狀并構建抗倒伏評價體系,是開展青稞抗倒伏品種選育的重要理論依據。【方法】 通過對35份青稞種質資源根系、莖稈和穗部23個農藝性狀進行方差分析,明確不同基因型間各性狀的差異性。采用相關分析篩選出與青稞抗倒伏性密切相關的指標,并通過主成分分析和線性回歸分析構建完成青稞抗倒伏評價體系。【結果】 不同基因型青稞材料在同一性狀間表現出較大差異,且農藝性狀在基因型間的差異均極顯著,農藝性狀中倒伏率的遺傳變異最豐富;同一參試材料的農藝性狀在兩個生態區間差異較大,海北高寒生態區試點各基因型的遺傳變異較豐富;各性狀的基因型與環境因素間存在顯著互作效應(P<0.05)。相關分析結果表明莖稈強度同青稞抗倒伏性關系最為密切,并通過抗倒伏指標構建青稞抗倒伏評價體系。青稞分蘗數過多、第三和第四莖節過長易引起植株倒伏。根干重大、莖稈重、莖稈壁厚、莖稈強度大是植株固持能力強、抗倒伏伏性優異的原因。【結論】 分蘗數、穗重、莖長、莖重、莖稈強度適合作為青稞抗倒伏性評價指標,驗證結果表明抗倒伏評價體系較可靠,可用于青稞種質的抗倒伏性評價。

    植物保護
    侵染我國主要蔬菜作物的病毒種類、分布與發生趨勢
    劉勇,李凡,李月月,張松柏,高希武,謝艷,燕飛,張安盛,戴良英,程兆榜,丁銘,牛顏冰,王升吉,車海彥,江彤,史曉斌,何自福,吳云鋒,張德詠,青玲,嚴婉榮,楊學輝,湯亞飛,鄭紅英,唐前君,章松柏,章東方,蔡麗,陶小榮
    中國農業科學. 2019, 52(2):  239-261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.005
    摘要 ( 354 )   HTML ( 35 )   PDF (651KB) ( 337 )   收藏
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    【目的】 對我國茄科、葫蘆科、豆科和十字花科蔬菜主要病毒病開展調查、診斷,明確當前我國主要蔬菜作物病毒病的病原物、優勢病毒及其分布,并對其中一些重要病毒引起的病毒病在我國的發生危害趨勢進行分析。【方法】 2013—2017年,對我國大陸31個省(市、自治區)開展茄科、葫蘆科、豆科和十字花科等蔬菜作物主要病毒病發生情況的普查,利用血清學和分子生物學相結合的方法對主要蔬菜病毒病的病原進行鑒定。【結果】 我國大陸31個省(市、自治區)共采集茄科、葫蘆科、豆科和十字花科蔬菜作物疑似病毒病樣品41 653份,共檢出病毒63種,其中茄科蔬菜檢出病毒達40種,葫蘆科蔬菜檢出病毒26種,豆科蔬菜檢出病毒19種,十字花科蔬菜檢出病毒14種。茄科的辣椒檢出病毒33種,番茄檢出病毒25種;葫蘆科的南瓜檢出病毒22種,黃瓜檢出病毒19種;豆科的豇豆檢出病毒14種,菜豆檢出病毒12種;十字花科的蘿卜檢出12種病毒,大白菜檢出7種病毒。蔬菜作物中普遍存在多種病毒復合侵染現象,已發現2—6種病毒復合侵染,以2種病毒復合侵染類型居多,其中辣椒、番茄和茄子上存在6種病毒復合侵染。本研究首次在國內發現番茄斑駁花葉病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)、西葫蘆虎紋花葉病毒(Zucchini tigre mosaic virus,ZTMV)、辣椒脈黃化病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)、辣椒隱潛病毒1號(Pepper cryptic virus 1,PCV-1)和辣椒隱潛病毒2號(Pepper cryptic virus 2,PCV-2)的侵染;首次發現ToMMV、甜瓜蚜傳黃化病毒(Melon aphid-borne yellows virus,MABYV)、南瓜蚜傳黃化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)對辣椒的侵染,首次發現ZTMV對黃瓜、煙草輕綠花葉病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)對南瓜的侵染,首次發現番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)可以侵染芹菜、曼陀羅、豇豆、豌豆、黨參、大麗花、旱金蓮、刺天茄等,首次發現紅辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)可以侵染紅茄,另外還首次發現辣椒和番茄為煙草叢頂病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的新自然寄主。【結論】 黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)和蠶豆萎蔫病毒2號(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)為當前危害我國蔬菜作物的優勢病毒,在全國范圍內廣泛分布且發生嚴重,特別是CMV發生最為普遍,在31個省(市、自治區)均有分布,且均為這些地區的優勢病毒。茄科蔬菜的優勢病毒為CMV和TMV,葫蘆科蔬菜的優勢病毒依次為CMV、小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和TMV,豆科蔬菜的優勢病毒為CMV和BBWV2,十字花科蔬菜的優勢病毒依次為TuMV、CMV和TMV。番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)、TSWV、CGMMV和ToMMV等病毒在部分省區發生嚴重,擴展蔓延速度極快,具有在全國范圍內流行的風險。

    黃淮海夏玉米主產區莖腐病主要病原菌及優勢種分析
    劉樹森,馬紅霞,郭寧,石潔,張海劍,孫華,金戈
    中國農業科學. 2019, 52(2):  262-272.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.006
    摘要 ( 137 )   HTML ( 8 )   PDF (406KB) ( 166 )   收藏
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    【目的】 明確黃淮海夏玉米主產區玉米莖腐病的主要病原菌組成及優勢種,為病原菌致病機制、抗性育種及莖腐病防治提供依據。【方法】 于2014—2017年采集黃淮海夏玉米主產區3個省(河北、河南、山東)的玉米莖腐病樣本850份。通過形態學、通用引物和特異引物對病組織分離物進行鑒定,并采用上述引物直接檢測病組織。整合分析分離物鑒定法和組織分子檢測法的結果以確定玉米莖腐病的主要病原菌及優勢種;分析主要病原菌在各省間以及同一省份不同年度的檢出率,揭示主要病原菌的種群動態變化;分析單個樣本中病原菌的檢出率,探討多種病原菌的共存模式。【結果】 有667份樣本檢測出真菌或卵菌,占總樣本的78.47%;年度間樣本檢出率存在差異,2014年的檢出率不足50%,而2015—2017年的檢出率相近,均高于90%。在所有樣本中共檢出20屬46種真菌或卵菌,其中鐮孢菌(Fusarium spp.)的檢出率最高,為89.96%,包括禾谷鐮孢復合種(F. graminearum species complex)、層出鐮孢(F. proliferatum)、擬輪枝鐮孢(F. verticillioides)、厚垣鐮孢(F. chlamydosporum)、亞粘團鐮孢(F. subglutinans)、尖鐮孢(F. oxysporum)、黃色鐮孢(F. culmorum)、藤倉鐮孢(F. fujikuroi)、變紅鐮孢(F. incarnatum木賊鐮孢(F. equiseti)和茄鐮孢(F. solani)11個種;腐霉菌(Pythium spp.)的檢出率為34.18%,包括芒孢腐霉(P. aristosporum)、禾生腐霉(P. graminicola)、棘腐霉(P. acanthicum)、孤雌腐霉(P. amasculinum)和寡雄腐霉(P. oligandrum)5個種。擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢復合種、芒孢腐霉和層出鐮孢為4種主要病原菌,檢出率依次為62.07%、46.93%、29.09%和28.04%,其中擬輪枝鐮孢為優勢種。各省之間,上述4種主要病原菌的檢出率存在一定差異。擬輪枝鐮孢在河北省的檢出率為73.98%,明顯高于該菌在河南省和山東省的檢出率;禾谷鐮孢復合種在3個省的檢出率相近;層出鐮孢和芒孢腐霉在山東省的檢出率分別為35.78%和34.31%,均高于在其他兩省的檢出率。同一省份不同年度上述4種主要病原菌的檢出率呈動態變化,其中任何一種病原菌均有可能上升為優勢種。進一步分析表明,單個樣本中可以檢測出一種或多種病原菌,檢測出1種菌的樣本占38.38%,檢出2種和3種病原菌的樣本分別占29.24%和19.04%;2種及以上病原菌共存以鐮孢菌和腐霉菌、鐮孢菌和鐮孢菌模式為主。【結論】 黃淮海夏玉米主產區莖腐病主要病原菌為擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢復合種、芒孢腐霉和層出鐮孢,其中擬輪枝鐮孢為優勢種;擬輪枝鐮孢在河北省的檢出率最高,層出鐮孢和芒孢腐霉在山東省的檢出率最高,禾谷鐮孢復合種在3個省的檢出率相近;單個樣本中存在多種病原菌共存的模式。

    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    基于GWR模型的渭北黃土旱塬糧食單產空間分異 及其影響因子分析——以陜西彬縣為例
    邱孟龍,曹小曙,周建,馮小龍,高興川
    中國農業科學. 2019, 52(2):  273-284.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.007
    摘要 ( 111 )   HTML ( 7 )   PDF (2184KB) ( 86 )   收藏
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    【目的】 通過探究渭北黃土旱塬區糧食單產在縣域尺度上的空間分異特征及其影響因子,為小尺度糧食單產及其影響因子的空間分異研究、區域糧食單產提高提供科學依據。【方法】 應用空間自相關、最小二乘法和地理加權回歸模型(GWR),研究渭北黃土旱塬區典型糧食主產縣陜西彬縣糧食單產的空間分布特征及其影響因子的空間分異。【結果】 彬縣糧食單產的Moran’s I指數為0.328,顯著性檢驗的Z值為5.51,呈北高南低的局部空間集聚特征。坡度、耕層厚度、土壤有機質、道路密度和施肥成本對彬縣糧食單產具有正向影響,土壤類型、侵蝕程度和地下水埋深對彬縣糧食單產具有負向影響,各解釋變量回歸系數的相對極差范圍為0.55—14.11。空間上,耕層厚度、土壤類型、侵蝕程度、土壤有機質和道路密度對彬縣南部、東南部梁峁丘陵溝壑區糧食單產的影響強于北部黃土旱塬區,而坡度、地下水埋深和施肥成本則表現出相反的空間非平穩性特征。OLS模型回歸系數的顯著性與GWR模型回歸系數的相對極差呈負相關關系。GWR模型的R 2比OLS模型提高了0.04,AIC值減少了11.04。 【結論】 彬縣糧食單產之間存在顯著的空間正相關關系;土壤有機質、施肥成本和地下水埋深是渭北黃土旱塬區縣域糧食單產的最主要影響因子;同一影響因子在縣域內的不同空間位置對糧食單產的影響程度存在較大差異,且各影響因子對糧食單產影響程度的空間非平穩性是導致OLS模型回歸系數顯著性水平較低的主要原因。GWR模型在空間非平穩性數據建模方面的解釋能力與估計精度都優于OLS模型,且能夠實現模型估計參數的空間可視化。

    不同用量風化煤腐殖酸對玉米根系的影響
    周麗平,袁亮,趙秉強,李燕婷,林治安
    中國農業科學. 2019, 52(2):  285-292.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.008
    摘要 ( 134 )   HTML ( 18 )   PDF (487KB) ( 139 )   收藏
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    【目的】 我國風化煤腐殖酸儲量豐富,腐殖酸含有多種活性官能團,其對植物生長發育具有重要意義。當腐殖酸施于土壤時,根系對腐殖酸的響應是促進植物生長的最初動力。因此,研究腐殖酸對玉米根系生長發育的影響機制,可為風化煤腐殖酸資源的高效利用和作物的增產提質提供理論依據。【方法】 采用霍格蘭營養液溶液培養試驗,供試玉米品種為鄭單958,待玉米幼苗長至兩葉一心時移到營養液培養盆缽中緩苗1 d,外源添加不同添加量(0、5、10、15和20 mg C·L -1)腐殖酸,研究其對玉米生物量、根冠比、根系形態以及根部養分狀況的影響。 【結果】 (1)腐殖酸可顯著增加玉米根系和地上部干物質量、根冠比、根系活力和根系TTC還原總量,較對照分別平均提高42.31%、19.33%、18.18%、46.54%和81.01%。(2)腐殖酸可改善玉米根系的形態,其處理玉米總根長、總根數量、根體積、根表面積和平均直徑分別比對照平均提高13.51%、16.74%、69.62%、14.68%和49.28%。(3)添加腐殖酸可增加玉米根系的軸根數、軸根長度和側根數,腐殖酸處理分別比對照提高16.28%、21.65%和16.80%。(4)隨腐殖酸添加量的增加,對玉米根系生長的促進作用呈現先升高后降低的變化,以中等濃度(10 mg C·L -1)腐殖酸對玉米根系的作用效果最明顯,其根干物質量和根系活力分別比對照提高了69.36%和69.07%。(5)腐殖酸處理(尤其是10 mg C·L -1)可有效增加玉米根系糖類、碳水化合物、脂類物質、蛋白質、多肽和氨基酸類物質等的含量。 【結論】 添加腐殖酸可明顯增加玉米干物質量和根系活力,增加根冠比,改善根系形態,有效增加玉米根系主要化學組分的含量。本試驗條件下,中等濃度(10 mg C·L -1)的腐殖酸對玉米根系的促進作用最好。

    磷石膏農用的環境安全風險
    王小彬,閆湘,李秀英,冀宏杰
    中國農業科學. 2019, 52(2):  293-311.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.009
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    磷石膏是濕法磷酸生產過程中產生的工業廢渣,是化學工業中排放量最大的固體廢物之一。中國從20世紀50年代末開始發展磷復肥產業,但生產中排放的磷石膏廢渣堆積量不斷增加。為解決大量磷石膏堆存造成的環境問題,目前,磷石膏被再次利用作建筑材料,如用于生產水泥緩凝劑和制作石膏建材,以及用于充填礦坑和筑路等。自20世紀90年代也有研究嘗試利用磷石膏替代天然石膏改良鹽堿化土壤。然而,磷礦石中多種有害元素在濕法磷酸生產過程中殘留或富集在磷石膏中,導致磷石膏中重金屬、氟化物(F)及放射性元素鐳( 226Ra)等污染元素含量較高,且存在不同程度超出國家土壤環境質量標準和地下水質量標準。如磷石膏中重金屬Cr、As、Cd和Hg超過《土壤環境質量-農用地土壤污染風險管控標準》(GB 15618—2018)的農用地土壤污染風險篩選值的比率為20%—67%;且檢出Hg、Cd、Pb、Ni、Cr和Be浸出濃度超過《地下水質量標準》(GB/T 14848—2017)中IV—V類水質標準。磷石膏中氟含量已超出中國地氟病發生區土壤全氟和水溶氟臨界值的比率分別為89%和100%;且檢出其浸出濃度遠超出地下水V類水質標準,部分已超過《危險廢物鑒別標準-浸出毒性鑒別》(GB 5085.3—2007)浸出限量。按照農用地土壤污染風險篩選值(GB 15618—2018),估算了磷石膏在不同施用量條件下帶入土壤的污染物元素累積量超出農用地土壤污染風險篩選值所需要的年限,表明短期內即可能導致土壤中污染元素累積量超標,如在年投入量為22.5 t·hm -2條件下(如污染元素淋溶量忽略不計),對污染元素Cd、Hg、F和 226Ra而言,無污染土壤變為污染土壤的年限分別約為1、5、4和25年。已有田間試驗顯示,磷石膏農用可導致部分農產品中有害元素(如F、As、Cd、Hg、Pb和Zn等)超標。2017年國家出臺的《固體廢物鑒別標準 通則》(GB 34330—2017)明確規定,生產過程中產生的副產物,包括在無機化工生產過程中產生的磷石膏等屬于固體廢物;且以土壤改良、地塊改造、地塊修復和其他土地利用方式直接施用于土地的固體廢物,仍然作為固體廢物管理。為保證土壤健康、食品安全和環境安全,建議未經無害化處理、有害元素超標的、存在環境安全風險的工業固廢磷石膏不得以土地處置方式為由直接施用于農田土壤,以免污染物進入食物鏈而危害人類健康。

    園藝
    Adβgal-1Adβgal-2克隆及其在獼猴桃果實軟化中的作用
    馮新,賴瑞聯,高敏霞,陳文光,吳如健,陳義挺
    中國農業科學. 2019, 52(2):  312-326.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.010
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    【目的】 β-半乳糖苷酶是一類參與細胞壁降解的糖苷酶,在植物的生長發育和果實成熟軟化過程中發揮重要作用。通過對獼猴桃2個β-半乳糖苷酶基因的鑒定及其表達模式研究,明確它們在獼猴桃果實軟化中的作用,豐富獼猴桃的后熟軟化機理研究。【方法】 以‘米良1號’獼猴桃為試材,采用RT-PCR法擴增果實的β-半乳糖苷酶基因,利用在線數據庫分析其編碼蛋白的特性、功能結構域、系統進化關系、基因結構和調控miRNA,應用qPCR研究其在不同組織部位、果實的不同軟化時期、不同貯藏溫度和ABA處理后的表達特征,并結合酶活性變化,闡釋這2個β-半乳糖苷酶基因在獼猴桃果實軟化中的作用。【結果】 克隆得到2個獼猴桃β-半乳糖苷酶基因(Adβgal-1Adβgal-2),登錄號分別為MH319788和MH319789。Adβgal-1的開放閱讀框為2 280 bp,編碼759個氨基酸;Adβgal-2的開放閱讀框為2 025 bp,編碼674個氨基酸。結構域分析顯示,Adβgal-1和Adβgal-2均含有植物糖苷水解酶家族35的功能結構域(Glyco_hydro_35)。基因結構分析表明,Adβgal-1由18個外顯子和17個內含子組成,而Adβgal-2由17個外顯子和16個內含子組成。進化樹分析顯示它們位于兩個不同的進化分支中,且序列差異較大,可能源自不同的基因祖先。qPCR分析結果表明,Adβgal-1Adβgal-2在獼猴桃的各組織部位(根、莖、葉、花、幼果、成熟果)均有表達,但表達水平不同;它們均在果實軟化初期上調表達,隨著果實硬度的下降,表達量持續增加;在25℃貯藏過程中,它們均在3 d時上調表達,隨著時間的推移,表達量增加;而在4℃貯藏過程中,Adβgal-1的表達受到抑制,Adβgal-2的表達呈波浪式;ABA處理誘導Adβgal-1Adβgal-2的表達。酶活性測定結果顯示,β-半乳糖苷酶活性在果實軟化初期略有降低,隨著果實硬度的下降逐漸升高。【結論】 Adβgal-1Adβgal-2均參與獼猴桃果實的軟化進程。不同貯藏溫度和ABA處理對獼猴桃果實軟化的影響可能是通過改變β-半乳糖苷酶基因的表達而實現的。

    基于掩模及亮度校正算法的臍橙表面缺陷分割
    張明,李鵬,鄧烈,何紹蘭,易時來,鄭永強,謝讓金,馬巖巖,呂強
    中國農業科學. 2019, 52(2):  327-338.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.011
    摘要 ( 103 )   HTML ( 16 )   PDF (3450KB) ( 71 )   收藏
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    【目的】 本研究旨在有效解決果皮有缺陷的水果圖像在去除背景時部分缺陷被誤分割為背景,以及水果表面缺陷難以有效分割提取的問題。【方法】 以I分量圖來構建掩模模板,根據其灰度直方圖信息,通過雙峰法選擇單一閾值(T=75)分以紐荷爾臍橙為研究對象,提出基于HSI顏色空間模型法去除背景割背景并填充孔洞得到掩模模板Imask,然后掩模模板ImaskI分量圖通過點乘運算得到去除背景的I分量圖;提出基于多尺度高斯函數圖像亮度校正算法對去除背景后的I分量圖像進行亮度校正,通過構建多尺度高斯函數濾波器,將去除背景后的I分量圖與構建的多尺度高斯函數進行卷積運算即得到去除背景后的I分量圖像表面光照分量圖,最后將去除背景后的I分量圖與得到的光照分量圖進行點除運算即得到去除背景后的I分量圖像亮度校正圖;然后采用單一全局閾值法對臍橙表面缺陷進行提取。【結果】 基于HSI顏色空間模型法去除背景,可在有效去除背景的同時完好保留臍橙的表面信息,有利于后續操作;基于多尺度高斯函數的圖像亮度校正算法分別對6種常見臍橙缺陷進行圖像亮度校正后采用單閾值法提取缺陷,使不同灰度等級的臍橙表面缺陷一次性分割成功,其中分割率最高為100%,最低為88.5%,整體達92.7%。通過試驗分析后發現造成部分誤分割或漏分割的原因主要在于部分缺陷果缺陷處顏色較輕,與正常區域灰度差較小,從而造成漏分割;還有部分缺陷果由于缺陷面積小,在圖像形態學處理過程被誤認為是噪聲而被去除;同時發現正常果的誤判率也達到了10.8%,經分析發現誤判的正常果表皮組織區域的褶皺位于圖像的邊緣區域,從而被誤認為是邊緣區域的缺陷,導致誤判。【結論】 基于HSI顏色空間模型法去除背景及基于多尺度高斯函數的圖像亮度不均校正算法對紐荷爾臍橙圖像背景分割和去除背景后的I分量圖像表面亮度校正均取得了較好的效果,能有效識別臍橙缺陷區域,為臍橙精確分級提供了技術支持,也為其他果品表面缺陷快速檢測提供了一種新思路。

    食品科學與工程
    擠壓協同酶法制備高粱蛋白ACE抑制肽及其穩定性
    周劍敏,尹方平,于晨,湯曉智
    中國農業科學. 2019, 52(2):  339-349.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.012
    摘要 ( 103 )   HTML ( 4 )   PDF (507KB) ( 42 )   收藏
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    【目的】 利用擠壓協同酶法制備高粱蛋白ACE抑制肽,為提高高粱蛋白資源的利用效率提供參考。【方法】 以高粱粉為原料,先經擠壓處理,再經淀粉酶酶解,最后通過堿性蛋白酶酶解,獲得高粱蛋白ACE抑制肽。研究物料水分、擠壓溫度和淀粉酶活力對高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制活性的影響,并探討高粱蛋白ACE抑制肽的穩定性。【結果】 隨著物料水分含量和擠壓溫度的增加,擠壓過程中單位機械能耗(SME)逐漸降低。在擠壓環境下,高粱中淀粉和蛋白質的相互結合變得松散,淀粉-蛋白質包埋體系被破壞;同時高粱中球形蛋白質體被打破,提高所獲得高粱蛋白的酶敏感性,在堿性蛋白酶的作用下生成更多具有抑制活性的短肽。擠壓過程中物料水分含量和擠壓溫度以及α-淀粉酶活力對高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率有顯著影響。隨著物料水分的增加,蛋白質分子的聚合程度下降,使得高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率隨之增加,當物料水分增加至19%后,擠壓過程對蛋白質周圍的淀粉分子的破壞作用降低,水解度和ACE抑制率的上升趨勢趨于平緩;當擠壓溫度從120℃增加至180℃時,高粱內部的蛋白質-淀粉包埋體系破壞加劇,同時蛋白質的空間結構在高溫作用下的變性程度加大,高粱蛋白酶解液的水解度由7.42%增加至11.06%,同時高粱蛋白ACE抑制肽的抑制率也由46.57%增加至53.41%;擠壓后高粱粉經α-淀粉酶處理,進一步去除包裹在蛋白質周圍的淀粉,發現隨著α-淀粉酶活力的增加,高粱內部的蛋白質-淀粉包埋體系破壞程度加劇,為制備高粱蛋白ACE抑制肽提供更多原料,導致高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率隨之增加,當α-淀粉酶活力增加至2.0 U·g -1時,淀粉酶與淀粉結合達到飽和狀態,水解度和ACE抑制率趨于穩定。高粱蛋白ACE抑制肽經溫度和酸堿處理后,ACE抑制活性在68.1%—71.31%,保持了良好的抑制活性;高粱蛋白ACE抑制肽在體外經胃腸道酶系消化酶解后,ACE抑制活性均高于73%,依然保持了較強的ACE抑制活性,說明擠壓協同酶法制備的高粱蛋白ACE抑制肽具有長期保存有效性,同時能夠在胃腸道消化后保持生物活性。 【結論】 采用擠壓協同酶法可以顯著提高高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制肽的活性,同時制備的高粱蛋白ACE抑制肽具有良好的穩定性,為拓寬高粱的利用和制備功能性食品配料提供了一條新途徑。

    畜牧·獸醫·資源昆蟲
    組學技術在奶牛乳房炎上應用的相關研究進展
    李廣棟,呂東穎,田秀芝,姬鵬云,郭江鵬,路永強,劉國世
    中國農業科學. 2019, 52(2):  350-358.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.013
    摘要 ( 148 )   HTML ( 21 )   PDF (392KB) ( 149 )   收藏
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    奶牛乳房炎發病率較高、病因復雜,是影響世界奶牛業發展的主要常見疾病之一。由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌等病原體引起的臨床和隱形乳房炎對動物性食品安全及畜牧業的正常發展構成巨大安全隱患,全球每年因奶牛乳房炎導致的經濟損失多達數十億美元。近年來隨著測序技術的不斷突破和測序成本的不斷降低,生命科學的研究進入了多組學時代,其在畜牧業中的應用也越來越廣泛。對奶牛乳房炎來說,傳統的組織病理學篩查、體細胞計數、牛乳pH檢測、牛乳電導率檢測、酶活檢驗、紅外熱顯影等診斷技術由于其自身的局限性難以充分全面地闡明其發病機理,已不能滿足科研人員的需求。組學技術即Omics,主要包括基因組學技術、蛋白質組學技術和代謝組學技術等。通過基因組學研究不僅能從轉錄層面上揭示奶牛乳房炎復雜性狀的表型變異及遺傳基礎,還能從轉錄后調控(miRNAs、LncRNAs等)和表觀遺傳學修飾(DNA甲基化、組蛋白修飾等)層面挖掘出相關的DNA和RNA變化及多分子間的相互作用規律,能夠幫助我們更好地了解奶牛乳腺組織對病原體的免疫應答機制,篩選鑒定出乳房炎抗性的信號通路及關鍵候選基因,從而提高基因組預測或選擇的準確性。利用蛋白質組學技術能夠對不同環境不同狀態的牛乳及乳腺組織的蛋白質種類、表達豐度、蛋白互作、翻譯后修飾等進行比較分析,對差異表達的蛋白質經過COG功能注釋、數據庫比對、GO和Pathway富集分析,可以從蛋白水平揭示乳房炎發生及防御過程中的復雜調控機制,同時還能發現乳房炎診斷的標記分子,進而為乳房炎治療藥物的研發提供潛在的精準靶點。代謝組學是系統生物學的重要組成部分。通過代謝組學研究,能夠同時對機體在內、外環境等復雜因素作用下及特定生理時期內所有低分子量代謝產物(如氨基酸、脂類、碳水化合物等)進行精準、高效的定性和定量分析,從而闡明相關的代謝途徑;其作為基因表達的最下游,能使基因和蛋白質表達的微小變化在代謝物水平上得到放大,進而可以更充分地反映細胞功能。將代謝組學技術應用到奶牛乳房炎研究中,能夠分析出差異代謝物、鑒定出相關的生物標志物,進而揭示奶牛乳腺的生理及病理變化過程。總之,將各組學技術及多組學整合關聯分析應用到奶牛乳房炎研究中可以更深入地揭示其病原防御機制,進而為乳房炎的預測、診斷和治療提供有價值的參考和借鑒。本文就最近幾年組學技術在奶牛乳房炎領域的研究進展進行綜述,以期為我國奶牛健康及奶業安全發展提供指導。

    奶牛用頭孢洛寧乳房注入劑(干乳期)的安全性評價
    華偉毅,劉義明,徐飛,路永強,孔梅,王海挺,黃慧麗,王宏磊,吳連勇,李秀波
    中國農業科學. 2019, 52(2):  359-366.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.014
    摘要 ( 85 )   HTML ( 6 )   PDF (362KB) ( 35 )   收藏
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    【目的】 確定自主研發新獸藥——頭孢洛寧乳房注入劑(干乳期)對靶動物的安全性。【方法】 選擇經產和初產健康泌乳期奶牛各6頭,入選前30日內未接受過全身性或乳房內抗生素給藥,產奶量在15-35 kg。給藥前1日、給藥當日(0日),記錄各試驗奶牛的日產奶量、直腸溫度,并采集奶樣進行體細胞檢測。采樣時先用清水沖洗乳房,用75%乙醇對乳頭及周圍進行消毒,待酒精揮發后,手工擠奶,棄去前三把奶后,采集奶樣于滅菌試管中,貼好標簽,低溫(4℃)保存并于6 h內送實驗室檢測。給藥當天,待奶牛擠完奶后,先用消毒毛巾清潔各乳區,再用消毒藥液浸泡乳頭約30 s,然后進行乳頭內灌注給藥。灌注時輕輕推壓活塞,將藥物緩緩注入乳池內,使藥物均勻分布。按照推薦劑量,每頭奶牛的4個乳區分別單次注入頭孢洛寧乳房注入劑(干乳期)一支(含頭孢洛寧250 mg)。給藥后1日、3日、5日、7日和10日對4個乳區各采集奶樣。記錄奶牛標識、觀察時間、試驗日期和時間、每頭奶牛日產奶量及體溫等參數。檢測乳樣中體細胞數(SCC),對給藥當日(0日)和給藥后第10日各采集的乳樣進行細菌學檢查。將各奶樣接種至選擇性培養基分離各種病原菌。分離菌株經純化培養后,依據菌落形態、染色特征、生化特點鑒定其種類。主要分離金黃色葡萄球菌、鏈球菌(無乳鏈球菌、乳房鏈球菌)、大腸桿菌。【結果】 在整個試驗期間,給藥乳區未出現乳房紅、腫、熱、痛等臨床癥狀。給藥前1日、0日和給藥后的1、3、5、7和10日,體細胞數大多在25-40萬個/mL,平均體細胞數分別為33.26、32.74、32.70、31.63、31.24、30.62、30.04 萬個/mL,給藥后各時間點奶樣體細胞數與給藥前體細胞檢測結果相比,體細胞數有所降低,但經重復測量方差分析顯示無顯著性差異(P>0.05);日產奶量在23-33 kg,平均日產奶量分別為27.30、27.35、27.25、27.40、27.64、27.83、28.00 kg,經重復測量方差分析顯示無顯著性差異(P>0.05);所有試驗奶牛在給藥前和給藥后不同時間點的直腸溫度均在奶牛的正常溫度范圍內(38.4-39.2℃),直腸平均溫度分別為38.79、38.82、38.83、38.77、38.71、38.71、38.69℃,經重復測量方差分析顯示無顯著性差異(P>0.05);故按推薦劑量單次給藥對奶牛的體細胞數、日產奶量、體溫無顯著影響。病原菌鑒定結果表明:在給藥當日(0日)采集的乳樣中,分離到鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌分別為2、3和4株;給藥后第10日,僅檢測到葡萄球菌和鏈球菌各1株,給藥前后目標菌數量有顯著降低。【結論】 頭孢洛寧乳房注入劑(干乳期)對奶牛體溫、產奶量和奶中體細胞數等無不良影響,該制劑用于奶牛安全。

    頭孢洛寧乳房注入劑(干乳期)在牛奶中的殘留消除
    閆超群,李帥鵬,張申,謝順,魏開赟,黃顯會
    中國農業科學. 2019, 52(2):  367-375.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.015
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    【目的】 頭孢洛寧為第一代半合成頭孢菌素類抗生素,對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有良好的抗菌活性,臨床以每個乳區250mg用于治療亞臨床感染引起的乳房炎。頭孢洛寧通過與敏感菌的青霉素結合蛋白相結合,從而阻斷細菌細胞壁的合成,達到抑制細菌生長的目的。筆者開展頭孢洛寧乳房注入劑(干乳期)在牛奶中的殘留消除規律研究,以期為該藥的合理使用和乳品安全生產提供指導。【方法】 選取20頭進入干乳期的健康奶牛,每個乳區分別注入一支頭孢洛寧乳房注入劑。平均干乳期為50 d,奶牛產犢開始泌乳后的6、12、24、36、48、60、72、96和120 h,將每頭奶牛每次采集的4個乳區的奶混合。采用Phenomenex Luna C18(150mm×2.1mm,3.5μm)。以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相,梯度洗脫程序洗脫,流速0.25 mL/min,柱溫為35℃,進樣量為5.0 μL。頭孢洛寧采用電噴霧離子源(ESI)離子化,正離子模式掃描,多反應監測模式(MRM),電噴霧電壓(IS)為4kV,霧化氣壓力(GS1)為55psi,氣簾氣(CUR)為15 psi,輔助氣流速(GS2)為35psi,離子源溫度(TEM)為600 ℃;定量離子對為m/z→459.4/337.3。樣品自然解凍,取5 g牛奶,置于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈,渦旋混勻2min,在10℃條件下10 000 r/min離心10 min。將上清液用15 mL75%乙腈水溶液重復提取一次,合并兩次的提取液,并加入10 mL乙腈飽和的正己烷,震蕩1 min,棄掉正己烷,把提取液移至100 mL雞心瓶中,在40℃用旋轉濃縮儀旋轉蒸發除去乙腈。向已除去乙腈的樣品溶液中加入20 mL磷酸二氫鈉緩沖溶液,然后用氫氧化鈉溶液調節至pH8.5。將樣品提取液以3 mL/min的流速通過HLB固相萃取柱,先用5 mL磷酸二氫鈉緩沖溶液洗滌雞心瓶并過柱,再用2 mL水洗柱。用2 mL乙腈洗脫,收集洗脫液于刻度樣品管中,在40℃下用氮氣濃縮儀吹干,用2 mL水溶解殘渣,搖勻后,過0.22 μm濾膜,取樣供LC-MS/MS檢測。【結果】 頭孢洛寧在2—200 μg·kg -1的范圍內呈良好的線性關系,相關系數在0.991—0.997之間。該方法檢測限為0.5 μg·kg -1,定量限為2 μg·kg -1。頭孢洛寧在2、20、40和200 μg·kg -1四個添加水平上的平均回收率為73.60%—103.52%,批內變異系數為1.85%—10.41%,批間變異系數為3.41%—8.97%。結果表明,該方法的回收率和變異系數滿足殘留檢測定量分析要求。使用頭孢洛寧干乳期乳房注入劑的初產奶牛,在產犢后96 h低于定量限。經產奶牛在產犢36 h低于定量限,24h均低于MRL。 【結論】 頭孢洛寧乳房注入劑(干奶期)按推薦劑量4個乳區(250 mg/乳區)給藥后,其產犢泌乳后牛奶中的棄奶期為24 h。

    家蠶熱休克蛋白HSP60相互作用蛋白篩選與鑒定
    董戰旗,蔣亞明,潘敏慧
    中國農業科學. 2019, 52(2):  376-384.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.016
    摘要 ( 139 )   HTML ( 14 )   PDF (1322KB) ( 72 )   收藏
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    【目的】 HSP60是熱休克蛋白中重要的一員,在昆蟲先天性免疫過程中起重要作用,同時也是昆蟲生長發育的必要因子。前期研究證明家蠶BmHSP60參與家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵細胞過程,本研究通過鑒定BmHSP60相互作用蛋白,為其在家蠶先天性免疫中作用機制研究打下基礎。【方法】 利用免疫共沉淀和銀聯-質譜分析技術(LC-MS/MS),首先構建BmHSP60過表達載體并融合Flag標簽,轉染到家蠶細胞中48 h后,收集蛋白,進行免疫共沉淀,用Flag抗體孵育磁珠調取相互作用蛋白,銀染處理后,能夠檢測到明顯的差異條帶,把差異條帶切膠保存在-80℃,然后質譜分析差異條帶的多肽;根據質譜結果和差異條帶的大小與NCBI數據庫進行比對,篩選到候選相互作用蛋白。最后,構建候選相互作用蛋白的克隆載體并融合HA標簽,分別和BmHSP60表達載體共轉到家蠶細胞,免疫共沉淀和熒光共定位驗證BmHSP60和候選蛋白之間的相互作用。并通過Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候選相互作用蛋白與線粒體的共定位。【結果】 免疫共沉淀銀染結果顯示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5條明顯的差異條帶,將這5條條帶混成蛋白池進行質譜分析,通過銀聯-質譜分析結果和家蠶基因組數據庫以及NCBI數據庫進行比對分析共鑒定到32個差異蛋白,根據多肽數量和蛋白分子量的大小共篩選到5個相互作用候選蛋白與銀染結果差異條帶一致,分別為ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。構建BmHSP60候選相互作用蛋白克隆表達載體并融合HA標簽,與BmHSP60共同轉染到家蠶細胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗體孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗體孵育,均能夠檢測到BmHSP60表達。而IB用α-HA抗體孵育顯示只有BmANT和BmHSP90能夠檢測到相應的條帶,而Alpha-tubulin和EF1α與BmHSP60沒有檢測到相應的條帶,說明只有BmANT和BmHSP90與BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α與BmHSP60沒有相互作用。通過熒光共定位進一步分析表明BmANT和BmHSP90能夠與BmHSP60共定位在細胞質中。線粒體標記物Mito-Tracker-Green共定位結果顯示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能夠與線粒體共定位到一起。【結論】 鑒定到家蠶熱休克蛋白BmHSP60能夠與BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于線粒體,可用于研究BmHSP60在家蠶抗病毒免疫中的作用機制。

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