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當期目錄

    2019年 第52卷 第23期 刊出日期:2019-12-01
      
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    中國農業科學. 2019, 52(23):  0. 
    摘要 ( 58 )   PDF (335KB) ( 53 )   收藏
    相關文章 | 多維度評價
    作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學
    小麥種質資源耐熱性評價
    王小波,關攀鋒,辛明明,汪永法,陳希勇,趙愛菊,劉曼雙,李紅霞,張明義,逯臘虎,魏亦勤,劉旺清,張金波,倪中福,姚穎垠,胡兆榮,彭惠茹,孫其信
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4191-4200.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.001
    摘要 ( 297 )   HTML ( 62 )   PDF (435KB) ( 280 )   收藏
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    【目的】利用熱感指數作為耐熱性鑒定指標,分別對冬、春小麥種質資源進行高通量耐熱性鑒定,篩選耐熱種質資源,為小麥耐熱性育種提供材料基礎。【方法】冬小麥材料采用延期播種、春小麥材料種植在溫度有顯著差異的地理環境下,人為致使小麥灌漿期遭遇高溫脅迫。根據不同環境處理的千粒重值計算冬、春小麥各個材料的熱感指數。依據熱感指數,對來自中國不同小麥生態區和國外不同地區和組織的1 325份小麥種質資源,包括688份冬小麥和637份春小麥,分別進行耐熱性評價。熱感指數小于0.5為極耐熱材料、大于等于0.5小于1為中等耐熱材料、大于等于1小于1.5為中等熱敏感材料、大于等于1.5為極敏感材料。【結果】冬小麥和春小麥熱脅迫處理組灌漿期平均最高溫度分別高于對照組1.91℃和7.09℃,且熱脅迫處理組千粒重與對照組相比均有顯著降低。根據熱感指數分級評價結果,極耐熱冬、春小麥材料31和48份,占供試材料的4.51%和7.54%;極敏感冬、春小麥材料19和58份,占供試材料的2.76%和9.11%;其余大多數材料為中間類型(中等耐熱材料和中等熱敏感材料)。從中國小麥生態區域的地理分布來看,來自南部麥區(西南冬麥區、青藏春冬麥區、長江中下游冬麥區)的冬小麥材料耐熱性整體高于來自北部麥區(北部冬麥區、黃淮冬麥區)的冬小麥材料。對于春小麥,來自新疆春冬麥區的材料耐熱性最強,平均熱感指數為0.70,且其中88.00%的材料屬于耐熱材料(極耐熱材料或中等耐熱材料);此外,來自國際干旱地區農業研究中心的春小麥平均熱感指數為0.88,也表現出較強的耐熱性。來自CIMMYT的人工合成六倍體材料耐熱性最弱,平均HSI為1.18,其中69.58%的材料為熱敏感材料(中等熱敏感材料和極敏感材料)。【結論】采用延期播種或在高溫的地理環境下種植能使小麥在灌漿期遭遇高溫脅迫。以千粒重熱感指數作為評價指標,對1 325份小麥種質資源進行高通量耐熱性鑒定,綜合考慮正常條件下的產量潛力和高溫條件下的耐熱性,篩選出優異耐熱資源103份,可用于相應生態區小麥的耐熱性遺傳改良。

    青稞種質資源表型性狀的遺傳多樣性分析及綜合評價
    白羿雄, 鄭雪晴, 姚有華, 姚曉華, 吳昆侖
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4201-4214.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.002
    摘要 ( 142 )   HTML ( 41 )   PDF (1139KB) ( 125 )   收藏
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    【目的】解析青稞種質資源表型形狀的遺傳多樣性關系及篩選綜合性狀優異的青稞種質,可為青稞育種及重要性狀深入研究提供理論依據。【方法】通過對205份青稞15個表型性狀采用Shannon-Wiener’s多樣性指數進行遺傳多樣性分析。分析參試青稞種質15個表型性狀在西寧試驗點和海北試驗點的頻次分布規律。對各性狀利用相關性分析以明確性狀間聯系;對參試種質進行聚類分析以明確其分類情況。利用主成分分析構建青稞種質綜合評價體系,并通過線性回歸分析對該體系進行驗證。依據綜合評價及豐產穩產性分析結果以篩選優異青稞種質。【結果】倒伏率遺傳變異程度最豐富而重心位置遺傳變異最匱乏,海北點遺傳變異程度高于西寧點。穗重遺傳多樣性最豐富,倒伏率遺傳單一性最高。除倒伏率外各性狀指標均呈正態或偏態分布,分布頻次呈中間高兩邊低的分布趨勢;穗長、穗重在各基因型中呈正態分布。各表型性狀受環境、基因型、年份影響極顯著,且各表型性狀的基因型與環境(G×E)、基因型與年份(G×Y)、基因型×環境×年份(G×E×Y)的互作效應均呈極顯著。青稞根系、莖稈和穗部組織內各指標間存在顯著相關性,且各組織間的農藝性狀也存在顯著相關性。根系發達、莖部抗折力高的青稞種質其機械固持能力強,倒伏率低;嚴重倒伏會限制青稞種質穗部生長發育,使穗長變短、穗粒數減少、籽粒變小、穗重變輕、進而使產量銳減。聚類結果表明參試種質可分為三類,第一類是高重心、易倒伏、其余性狀居中的種質;第二類是矮稈、低重心且其余性狀表現良好的優異種質;第三類是株高較高、根系欠發達、莖部易折、穗部性狀表現差的種質。結合F值和豐產穩產性分析結果篩選出綜合性狀表現優異且有較高豐產穩產性的青稞種質5份。【結論】參試青稞種質資源的遺傳多樣性豐富;穗長、穗重在各基因型中呈正態分布,除倒伏率外,其余12個性狀在基因型中呈偏態分布;根干重、重心位置、莖稈壁厚、莖粗、莖稈強度、穗長、穗粒數、產量8個指標可作為核心種質評價的綜合指標。

    磷脅迫下羊草的響應及磷響應相關基因表達分析
    萬東莉,侯向陽,丁勇,任衛波,王凱,李西良,萬永青
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4215-4227.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.003
    摘要 ( 122 )   HTML ( 24 )   PDF (1880KB) ( 120 )   收藏
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    【目的】磷是植物生長發育所必需的大量營養元素,研究無機磷酸鹽(inorganic phosphate,Pi)脅迫下羊草的響應,篩選不同濃度Pi脅迫下的內參基因,并分析Pi響應相關基因的表達,為羊草Pi脅迫響應的分子機制研究提供基礎數據。【方法】以羊草幼苗為材料,進行不同濃度Pi處理培養,對羊草的株高和根長進行檢測,利用釩鉬黃比色法檢測羊草植株中Pi的含量。根據羊草轉錄組數據選取7個候選內參基因,從NCBI核酸序列數據庫選取1個候選內參基因,對羊草不同處理材料進行總RNA提取和cDNA合成,利用qRT-PCR對候選內參基因的表達進行檢測,并通過geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件對其穩定性進行評估。根據篩選獲得的較穩定內參基因,對Pi響應基因的qRT-PCR檢測數據進行相對定量分析。【結果】表型觀測結果顯示,無論是低Pi還是高Pi脅迫都使得羊草的生長減緩;株高對低Pi或缺Pi脅迫較為敏感,根長對高Pi脅迫較為敏感;并隨著處理濃度的增加羊草中Pi的含量也增加。qRT-PCR溶解曲線分析顯示8個候選內參基因均具有單一的溶解峰,基因表達譜分析表明8個候選內參基因的CT值范圍是17.16—26.61,其中,LcGAPDH的表達豐度最高為17.16—20.22,Lc18SrRNA的表達豐度最低為23.28—26.61,CT值變異系數最小的為LcARPT(2.09%),最大的為LcTUA(6.8%)。綜合geNorm、NormFinder和Bestkeeper穩定性排名,通過計算幾何平均數,獲得8個候選內參基因綜合穩定性排名,其中排名靠前的3個基因分別為Lc18SrRNALcCAPLcEF1α,排名最后的2個基因為LcTUALcTUB。分別以Lc18SrRNALcCAPLcEF1α作為內參基因,qRT-PCR相對定量表達分析結果顯示,與對照相比,LcPHO1-2的表達受低Pi或者缺Pi誘導;LcPAP2的表達受高Pi誘導;而LcPAP27的表達同時受低Pi和高Pi下調。【結論】低Pi和高Pi脅迫均使羊草生長受阻,羊草地上組織與地下組織對Pi脅迫響應的模式不同。篩選出3個表達較為穩定的內參基因Lc18SrRNALcCAPLcEF1αLcPHO1-2LcPAP2分別參與了羊草對低Pi和高Pi的應答響應,LcPAP27同時參與了羊草對低Pi和高Pi的響應進程。

    耕作栽培·生理生化·農業信息技術
    側深施氮對機插水稻產量形成及氮素利用的影響
    朱從樺, 張玉屏, 向鏡, 張義凱, 武輝, 王亞梁, 朱德峰, 陳惠哲
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4228-4239.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.004
    摘要 ( 130 )   HTML ( 30 )   PDF (671KB) ( 164 )   收藏
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    【目的】水稻機插同步側深施肥是一項新興的技術,正在迅速發展。深入探究不同類型氮肥機械側深施用對機插水稻產量及氮素利用效率的影響,有利于提高水稻機械化種植水平,為機插水稻節本增效提供理論依據。【方法】2017年和2018年開展大田試驗,采用完全隨機區組試驗設計,設置5種施氮處理,即不施氮肥(N0)、尿素撒施(CUB)、尿素機械側深施(CUM)、控釋尿素撒施(CRUB)和控釋尿素機械側深施(CRUM),測定水稻物質生產特性、氮素積累分配、氮素利用效率、產量及產量構成因素。【結果】2年各施氮處理對水稻產量形成、氮素利用的影響基本一致。與尿素相比,控釋尿素可以顯著提高水稻干物質積累量、氮素積累量、氮肥利用率以及稻谷產量;2017年成熟期干物質積累量和氮素積累量、氮肥吸收利用率(NRE)、氮肥農學效率(NAE)和稻谷產量分別增加3.22%、17.50%、46.00%、17.79%和3.72%,2018年相應增幅分別為8.77%、13.27%、32.07%、12.74%和3.32%。與人工撒施相比,機械側深施可以顯著提高氮肥利用率,2017年NRE和NAE分別增加17.91%—43.14%和19.61%—37.39%;2018年NRE和NAE分別增加53.80%—54.10%和21.11%—35.11%。與人工撒施相比,機械側深施肥處理的產量分別增加4.46%—6.95%(2017年)、5.55%—8.11%(2018年);增產的主要原因是其具有更多有效穗數和穎花總量。齊穗至成熟期,CRUM處理莖葉鞘氮素積累量和莖葉氮素表觀轉移量(TNT)均顯著高于其他施氮處理。此外,在穗分化期和齊穗期,相比其他施氮處理,CRUM處理的氮素積累量、SPAD值、干物質積累量均顯著增加。【結論】控釋尿素機械側深施(CRUM)是一種能提高機插水稻產量和氮素利用的有效施肥方法。

    超級早稻缽形毯狀秧苗機插效果及產量形成
    陳惠哲,徐一成,張玉屏,向鏡,張義凱,朱德峰
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4240-4250.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.005
    摘要 ( 69 )   HTML ( 7 )   PDF (1403KB) ( 77 )   收藏
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    【目的】通過缽形毯狀秧苗機插技術在雙季超級早稻上機插應用,探究機插效果及對產量形成的影響,以期為我國水稻機械化種植技術發展提供參考。【方法】以常規超級早秈稻中早39、中嘉早17為試驗材料,采用水稻缽形毯狀秧盤(BT)和傳統平盤(CK)培育秧苗,考察種子出苗、秧苗素質、根系形態及分布、機插效果、產量并比較差異。【結果】水稻缽形毯狀秧盤與平盤育秧種子出苗率差異不顯著;缽形毯狀秧苗根系獨立成缽狀,56.03%的根系在底層缽碗內,上部根系比例43.97%,且白根多,根數比對照略少,但根長度、根表面積、根直徑和根體積有所增加,而對照秧苗的下部根系比例37.86%,上部根系比例高達62.14%;從機插效果看,中早39和中嘉早17缽形毯狀秧苗的機插斷根率比平盤毯狀秧苗分別降低了25.06%和14.24%,相同播種量下,2年重復試驗中早39缽形毯狀秧苗機插的漏秧率比對照分別下降了3.89%和1.67%,中嘉早17下降了2.22%和1.66%,另外翻秧、漂秧、傷秧比例較對照也有所減少;缽形毯狀秧苗機插14 d后的秧苗葉重、莖鞘重、根重、地上部總重量和葉綠素含量均比對照明顯增加,表明有利于促進秧苗早發生長;產量比較,中早39缽形毯狀秧苗機插比對照增產6.35%—7.66%,中嘉早17增產8.99%—10.87%,其中主要通過有效穗數增加實現增產,中早39和中嘉早17的缽形毯狀秧苗機插處理有效穗數分別增加了2.14%—6.01%和4.76%—6.98%。【結論】水稻缽形毯狀秧苗機插技術通過培育形成上毯下缽的缽形毯狀秧苗,按缽取秧機插,有利于提高機插質量,減少機插漏秧率及傷根,促進秧苗早發,提高有效穗數,實現機插水稻高產。

    小麥籽粒灌漿與脫水特性
    朱冬梅,王慧,劉大同,高德榮,呂國鋒,王君嬋,高致富,陸成彬
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4251-4261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.006
    摘要 ( 105 )   HTML ( 20 )   PDF (434KB) ( 155 )   收藏
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    【目的】研究小麥品種籽粒灌漿與脫水特性,為培育灌漿快、脫水快的少(免)晾曬小麥品種提供選擇方法和理論依據。【方法】2015—2016年以長江中下游地區7個主推小麥品種為試驗材料,采用Logistic方程擬合、多重比較及相關分析等方法,測定灌漿與脫水指標,生理成熟期及收獲期籽粒含水率等。【結果】籽粒灌漿呈“S”型“慢-快-慢”的增長趨勢,但不同品種最大灌漿速率、平均灌漿速率及灌漿持續時間差異顯著,揚麥11、揚麥158、揚麥16最大灌漿速率及平均灌漿速率較大,花后30 d籽粒干重均達35 g以上,灌漿持續期較短;揚麥15灌漿速率僅次于上述3個品種,但灌漿持續期最長;寧麥13、揚麥20、揚麥22灌漿速率較小。最大灌漿速率、平均灌漿速率以及漸增期、快增期和緩增期的灌漿速率均與千粒重極顯著正相關,3個灌漿時期灌漿速率R2>R1>R3,花后30 d灌漿基本完成。籽粒灌漿完成后進入脫水階段,生理成熟期和收獲期籽粒含水率、生理成熟后籽粒脫水速率品種間差異顯著,揚麥11、揚麥158、揚麥16生理成熟后籽粒脫水速率較高,揚麥15最低。收獲期籽粒含水率與生理成熟期籽粒含水率、籽粒平均脫水速率、生理成熟后2 d籽粒脫水速率顯著或極顯著相關。【結論】揚麥11、揚麥158、揚麥16灌漿速率大,灌漿完成早,籽粒脫水快。花后30 d粒重>35 g可作為育種材料灌漿快慢的選擇指標,生理成熟期后籽粒平均脫水速率可作為衡量小麥品種脫水快慢的選擇指標。

    植物保護
    黑龍江省稻瘟病菌無毒基因AVR-PibAVR-PikAvrPiz-t的檢測與分析
    孟峰,張亞玲,靳學慧,張曉玉,姜軍
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4262-4273.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.007
    摘要 ( 64 )   HTML ( 8 )   PDF (2746KB) ( 31 )   收藏
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    【目的】檢測黑龍江省稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)無毒基因AVR-Pib、AVR-PikAvrPiz-t在不同地區、年份間流行菌株的分布情況與變異機制,了解其等位基因的致病表型,為黑龍江省抗瘟品種布局提供參考依據。【方法】利用NCBI中公布的無毒基因序列對3個無毒基因AVR-Pib、AVR-PikAvrPiz-t的基因全長和編碼序列(coding sequence,CDS)分別設計特異性引物,將2016年和2017年采自黑龍江省不同地區335個稻瘟病菌單孢分離菌株的DNA進行PCR擴增,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測分析,并挑選不同帶型和不同地區代表菌株的PCR產物進行測序。測序結果與相應無毒基因序列進行堿基與氨基酸序列的比較分析,并利用水稻抗性單基因系,對不同變異類型的稻瘟病菌菌株進行致病型測定。【結果】在PCR電泳檢測中AVR-Pib、AVR-PikAvrPiz-t均出現特異性條帶,說明這3個無毒基因在黑龍江省均有分布,并以不同分布頻率與突變類型出現。3個無毒基因平均擴增頻率分別為75.52%、87.16%和85.67%。其中AVR-Pib通過電泳檢測與PCR產物測序檢測出4種帶型(無帶、高帶、中高帶與低帶)和5種變異類型AVR-Pib(1-1、1-2、2、3、3-1),基因型AVR-Pib-1-1、AVR-Pib-1-2、AVR-Pib-2和AVR-Pib-3-1為新發現的變異類型,其中基因型AVR-Pib-1-1和AVR-Pib-1-2均為轉座子Pot2的插入,但插入位點不同;基因型AVR-Pib-2在閱讀框上游存在小片段的插入;基因型AVR-Pib-3-1堿基序列與原序列比對有4處差異,即32(C/G)35(T/A)36(T/A)38(T/A),導致氨基酸翻譯提前終止。對檢測到的5種等位基因型進行致病型測定,分析發現除正常基因型AVR-Pib-3外,其他變異基因型無毒功能均已喪失。而AVR-Pik經PCR產物測序檢測出7種等位基因型,AVR-Pik(D、A、B、C、E、F、F2),堿基序列的變化均導致氨基酸錯義突變,7種等位基因型均已見報道。無毒基因AvrPiz-t通過電泳檢測和PCR產物測序分析,發現2種帶型(高帶和正常帶型)與4種基因型AvrPiz-t(A、B、C、D),其中AvrPiz-t-A為正常基因型;基因型AvrPiz-t-B在191位處有堿基A的插入,導致氨基酸翻譯提前終止;基因型AvrPiz-t-C為新發現的等位基因型,其特點在于與A類型存在17(T/C)和19位處堿基C的插入,發生移碼突變翻譯提前終止;高帶型對應的無毒基因型AvrPiz-t-D經測序驗證為Pot3轉座子的插入。4種基因型菌株分別接種水稻單基因系發現,AvrPiz-t-A可以被Piz-t識別表現無毒,AvrPiz-t(B、C、D)均不能被Piz-t所識別而表現為有毒性。【結論】黑龍江省稻瘟病菌無毒基因AVR-Pib、AVR-PikAvrPiz-t分布較為廣泛,且變異類型豐富,研究結果可為選育和推廣攜帶相應抗病基因的水稻品種提供參考。

    利用TRV-HIGS技術鑒定核盤菌致病相關的分泌蛋白基因
    遠俊虎,丁一娟,楊文靜,閆寶琴,柴亞茹,梅家琴,錢偉
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4274-4284.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.008
    摘要 ( 84 )   HTML ( 15 )   PDF (1652KB) ( 52 )   收藏
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    【目的】由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病是我國油菜種植上的主要問題,嚴重威脅著菜籽產量及品質。分泌性蛋白在病原菌致病過程中起著重要作用,核盤菌基因組中包含大量編碼分泌性蛋白的基因,本研究旨在鑒定并篩選與致病性相關的分泌蛋白基因,揭示核盤菌的致病機理,為菌核病防控提供重要靶標。【方法】采用SMART軟件對核盤菌在侵染抗病、感病甘藍過程中差異表達明顯的8個具有信號肽的候選基因進行蛋白質結構域的分析,隨后將SMART分析得到的結構域分別于SCOP、Pfam、PDB數據庫進行功能注釋。利用基因特異性引物進行目的基因特異片段的PCR擴增,構建pTRV2-Gene和pTRV2-GFP載體。隨后等量混合含有pTRV1及pTRV2-Gene,pTRV1及pTRV2-GFP載體的重懸菌液。室溫靜置3 h后,利用針筒浸潤法將pTRV2-Gene載體及對照(TRV-GFP)侵染5—6周齡的本氏煙(Nicotiana benthamiana)。侵染植株于黑暗環境中培養48 h后,再置于正常光照條件的環境中生長7 d。將直徑6 mm的核盤菌PDA菌絲塊接種于侵染9 d后的煙草葉片葉腹的中央,其中帶菌面緊貼葉片,隨后將接種植株培養48 h后統計病斑面積。提取接種48 h后的病斑及病斑周圍組織葉片(距腐爛組織邊緣1 cm左右)的RNA,利用特異引物進行目的基因的qRT-PCR,計算目的基因在攜帶TRV-HIGS載體的煙草植株中的相對表達量。【結果】SMART及結構域注釋預測這8個候選基因可能參與了蛋白、核酸或多糖的水解,影響植物的免疫反應,參與核盤菌對藥物耐受性的調節及生物素合成。核盤菌接種攜帶這8個基因的TRV-HIGS載體及對照載體的煙草,48 h后對照植株的病斑面積平均為3.44 cm 2,除SS1G_07655外,其余7個候選基因的TRV-HIGS植株上的病斑面積相比對照植株均顯著減小(P≤0.05),其病斑面積介于1.63—2.61 cm 2。qRT-PCR結果顯示,這7個致病相關的候選基因在核盤菌侵染煙草過程中的基因表達水平均顯著低于對照(P≤0.05)。【結論】利用TRV介導的HIGS技術成功地對核盤菌中8個未知功能的分泌蛋白基因進行了功能鑒定,篩選到7個可能與核盤菌致病性相關的基因,其中對核盤菌致病性影響最大的SS1G_03146預測可能參與核盤菌生物素合成,同時SS1G_04343SS1G_11912預測可能參與影響植物的免疫反應。

    土壤肥料·節水灌溉·農業生態環境
    石灰用量對水稻油菜輪作區土壤酸度、土壤養分及作物生長的影響
    閆志浩,胡志華,王士超,槐圣昌,武紅亮,王瑾瑜,邢婷婷,余喜初,李大明,盧昌艾
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4285-4295.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.009
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    【目的】我國南方稻油輪作區土壤酸化趨勢日趨嚴重,降低了作物產量。研究酸性土壤施用石灰對土壤養分及作物生長的影響,明確土壤速效養分、產量與作物養分吸收量對土壤pH的響應關系,為水田兩熟區酸化土壤改良提供理論依據。【方法】2015—2018年在江西進賢縣選擇pH 4.5的水稻土,以熟石灰作為酸性土壤改良劑,開展田間定位試驗。通過實驗室模擬,計算出獲得不同土壤pH情況下的熟石灰用量,試驗設6個土壤pH梯度,分別為4.5、5.0、5.6、6.3、6.8、7.3,2015年勻地一年,為保證各處理土壤pH與勻地一年后實測pH基本一致,以一年為周期用熟石灰進行定量調整。【結果】(1)隨著石灰用量和土壤pH的增加,土壤速效氮含量呈先增加后降低的趨勢、交換性鈣、交換性鎂含量顯著增加,土壤速效鉀、有效磷含量顯著降低;(2)隨著石灰用量和土壤pH的增加,作物產量呈先增加后降低的趨勢。土壤pH 6.4時(相當于6 145 kg·hm -2熟石灰用量)油菜產量達到最高,較土壤pH 4.5處理增加了202.2%;土壤pH 6.8時(相當于7 474 kg·hm -2熟石灰用量),水稻產量達到最高,較土壤pH 4.5處理增加了61.2%。油菜、水稻產量降低50%時的酸害閾值分別為4.7、4.2;(3)土壤pH顯著影響作物養分吸收量。隨著熟石灰用量的增加,油菜氮磷鉀吸收量呈先增加后降低的趨勢。2016—2018年油菜氮磷鉀吸收量與不施石灰處理相比,施石灰處理平均增幅分別為59.5%—181.4%、36.2%—188.8%、65.7%—198.9%;水稻氮磷鉀吸收量呈先增加后降低的趨勢,在pH 6.8左右水稻氮磷鉀吸收量最大。2016—2018年水稻氮磷鉀吸收量與不施石灰處理相比,施石灰處理平均增幅分別為11.1%—88.6%、13.5%—68.5%、9.7%—66.1%。【結論】施用熟石灰的情況下,隨著土壤pH升高,土壤速效氮、交換性鈣鎂等含量增加,提高了產量,促進了作物對氮磷鉀養分的吸收。在本試驗條件下,稻油輪作區酸性土壤(pH 4.5)施用熟石灰的最佳用量為6 500 kg·hm -2左右,改良土壤的目標為pH 6.5左右,可獲得我國南方稻油輪作區的作物穩定高產。

    基于SPEI和MI分析陜西省干旱特征及趨勢變化
    丁怡博,徐家屯,李亮,蔡煥杰,孫亞楠
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4296-4308.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.010
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    【目的】目前干旱研究多為基于歷史干旱事件分析成因與變化趨勢,而結合過去與未來長時間序列數據更能揭示干旱變化特點。尋找在基于CMIP5模型輸出未來氣象數據時模擬干旱指數方法并探究陜西省過去與未來干旱變化特點,為陜西省未來農業水資源管理提供依據。【方法】根據陜西省18個氣象站歷史數據以及CMIP5模式輸出未來氣象數據,比較了3種模型模擬參考作物蒸發蒸騰量(ET0),并基于參考作物蒸發蒸騰量(ET0)和降水數據計算標準降水蒸發指數(SPEI)和相對濕潤指數(MI)反映干旱程度,比較過去(1958—2018年)與未來(2019—2100年)干旱的時空變化特點。【結果】多元線性回歸模型(Multiple Linear Regression, MLR)能較準確的模擬參考作物蒸發蒸騰量(ET0)(RMSE=0.457 mm·d -1);在RCP2.6和RCP8.5情景下未來干旱指數呈現上升趨勢,在RCP8.5情景下,21世紀40年代存在干旱指數的突變年份;陜西省未來干旱程度降低,年內干旱分布更加不均勻;未來時期夏玉米生長季干旱程度減小,冬小麥生長季干旱程度增加。【結論】在不同RCP情景下,未來干旱變化特征存在差異,相同RCP情景下,SPEI和MI反映的干旱特征變化基本一致,但部分時段存在變化差異。為有效應對氣候變化對旱作作物產量造成的負面影響,應當增強土壤蓄水保墑能力,尤其加強冬小麥生長季的抗旱工作。

    湖北省農業碳排放的時空特征及經濟關聯性
    李波,杜建國,劉雪琪
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4309-4319.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.011
    摘要 ( 59 )   HTML ( 2 )   PDF (804KB) ( 38 )   收藏
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    【目的】湖北省是農業大省,農業生產的碳排放在總碳排放中占據較大的比重,碳排放所帶來的溫室效應和農業生產導致的面源污染等環境問題不容忽視。基于此,通過分析農業經濟增長和農業碳排放之間的協整關系,并對其進行誤差修正,為湖北省未來的碳減排工作的開展提供重要的理論依據和參考。【方法】基于6個主要方面碳源,測算了1993–2017年湖北省農業生產活動所導致的碳排放量,并分析農業碳排放的時空特征。進一步通過Kernel密度估計發現,湖北省各地市州農業碳排放的地區差距。最后,綜合運用協整理論及誤差修正模型,實證湖北省農業經濟增長與碳排放之間的關系。【結果】湖北省農業碳排放總量和強度均呈現先升后降的趨勢,年均增長率分別為2.32%、2.21%,從總體來看環比增速呈現下降的趨勢。農藥、農膜、化肥、農用柴油、翻耕和農業灌溉等所產生碳排放年均遞增率分別為2.23%、2.44%、2.40%、3.32%、0.44%和2.32%;通過Kernel密度估計發現,在此樣本考察期間內湖北省各地市州農業碳排放的地區差距有明顯的擴大。湖北省農業碳排放與農業經濟增長存在協整關系的有:農業碳排放總強度,農藥、農膜、農用柴油和灌溉等4類碳源導致的碳排放強度,且當湖北省人均農業總產值每增加1%時,農藥、農膜、農用柴油和農業灌溉等4類碳源的碳排放強度分別增加了0.58%、0.59%、0.25%和0.15%,農業碳排放總強度便增加0.19%。【結論】湖北省農業經濟發展、生產條件和地區發展戰略不同,而導致地區間的農業碳排放差距越來越明顯。農業經濟增長與農業碳排放存在長期穩定關系,這表明湖北省還處于傳統耕作模式向綠色低碳耕作模式轉型的關鍵期,并且這種發展模式已存在較長時間。

    專題:蘋果分子生物學
    加強分子生物學研究,促進蘋果產業持續發展
    叢佩華,張彩霞,韓曉蕾,張利義
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4320-4321.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.012
    摘要 ( 56 )   HTML ( 31 )   PDF (217KB) ( 77 )   收藏
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    蘋果LIM基因家族生物信息學及表達分析
    袁高鵬, 韓曉蕾, 卞書迅, 張利義, 田義, 張彩霞, 叢佩華
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4322-4332.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.013
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    【目的】在蘋果全基因組中鑒定LIM,通過分析啟動子作用元件、保守結構域、基因聚類、基因結構、染色體定位以及組織表達模式,為研究和利用蘋果LIM奠定基礎。【方法】利用蘋果基因組數據庫GDR和PLAZA,獲得蘋果LIM家族成員并進行編號。蘋果LIM蛋白氨基酸序列的基本信息通過ExPASy Proteomics Server進行預測,利用Cell-PLoc進行亞細胞定位預測,利用CD-Search Tool進行LIM結構域分析,采用MEGA 7軟件構建進化樹,采用GSDS繪制基因結構,并利用TBtools軟件對鑒定得到的MdLIM進行染色體定位,通過實時熒光定量RT-PCR對MdLIM的組織表達進行分析,并利用SPSS 18.0軟件分析差異顯著性。【結果】共鑒定得到11個蘋果LIM家族成員,這些MdLIM蛋白包含96—222個不等的氨基酸殘基,等電點分布在6.14—9.01。亞細胞定位結果顯示,MdLIM蛋白在細胞核中均有分布。啟動子作用元件分析表明,11個MdLIM啟動子上分布有響應激素、環境適應性和逆境誘導的元件。蛋白保守結構域分析表明,11個MdLIM蛋白中除MdLIM8具有單LIM結構域外,其余10個均具有雙LIM結構域。根據聚類分析結果可將MdLIM分為4組。染色體定位結果顯示,MdLIM分布在蘋果17條染色體中的7條,且MdLIM在7條染色體上的分布不均勻。花、葉、果皮和莖中的實時熒光定量RT-PCR結果顯示,4個組織中均能檢測到MdLIM的表達,且表達量具有一定差異。【結論】蘋果LIM基因家族包括11個成員,進化上可分為4組,11個基因分布于7條染色體上,在不同組織中的表達具有多樣性和特異性。

    蘋果NLP(Nin-Like Protein)轉錄因子基因家族全基因組鑒定及表達模式分析
    王尋, 陳西霞, 李宏亮, 張富軍, 趙先炎, 韓月彭, 王小非, 郝玉金
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4333-4349.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.014
    摘要 ( 105 )   HTML ( 15 )   PDF (5665KB) ( 128 )   收藏
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    【目的】探究蘋果NLP轉錄因子全基因組特征與表達模式,以便更深入地了解其結構特點與作用機制。【方法】基于本地BLAST數據庫和Pfam數據庫兩大數據庫,運用blastp和hmmsearch兩種查詢策略,對蘋果全基因組范圍內的NLP轉錄因子家族成員進行鑒定。經過嚴格篩選與確認后,對搜索結果進一步展開分析,主要分為3部分,包括NLP蛋白分析、NLP分析與蘋果NLP表達分析,其中ProtParam、Clustal Omega、MEGA7、MEME 5.0.2、SOPMA、Phyre 2、WoLF PSORT、STRING等程序或軟件用于蛋白質分析,基因分析使用MG2C、GSDS 2.0、PlantCARE、psRNATarget等在線工具,對于蘋果NLP表達情況利用qRT-PCR進行定量檢測。【結果】從蘋果全部蛋白數據庫中共篩選出6個NLP成員,系統進化分析可將它們分為I、II、III三類;蛋白二級結構以無規則卷曲為主,其次是α-螺旋,占比最小的是β-轉角;亞細胞定位預測均定位于細胞核中,符合轉錄因子的特征;染色體定位顯示5個基因(MDP0000584547除外)定位于4條染色體上;啟動子分析發現大量與激素和逆境響應相關的順式作用元件,暗示它們可能參與到激素和逆境信號的調控過程中,此外還識別到一個響應氮的GCN4作用元件,進一步說明該類轉錄因子與氮素有密不可分的關系;通過定量檢測揭示蘋果NLP家族在莖、葉等組織高表達的特征模式,并且表達分析結果也證實蘋果NLP響應氮饑餓、干旱脅迫等。【結論】通過對蘋果全基因組的分析,共識別6個NLP轉錄因子,對6個基因的結構與蛋白保守域分析,發現它們之間具有極高的相似性、保守性,同時又存在差異。類比擬南芥NLP蛋白的關聯網絡,推測與擬南芥NLP7同源性最高的MDP0000132856可能也具有復雜的功能。

    柱狀蘋果Co基因的篩選與候選基因分析
    白團輝,李莉,鄭先波,王苗苗,宋尚偉,焦健,宋春暉
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4350-4363.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.015
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    【目的】柱狀蘋果是一種特殊的矮生突變類型,其節間短、短枝多、側生分枝少、主干粗壯直立,是蘋果實行矮化密植栽培的重要資源。本研究在前期Co精細定位的基礎上,對定位區間的基因進行篩選,為闡明柱狀蘋果形成的分子機制和選育柱狀蘋果新品種奠定基礎。【方法】以柱狀蘋果‘舞佳’和‘潤太一號’,普通型蘋果‘富士’和‘華碩’的芽、莖尖和葉片為試材,根據最新的蘋果基因組以及與柱狀相關的轉錄組信息,對Co精細定位區間27.66—29.05 Mb的基因進行注釋分類,選擇目標基因,查找其CDS序列,使用RT-PCR技術檢測引物特異性,利用實時熒光定量PCR分析預測基因在不同組織器官中的表達特征,篩選出差異基因并將其作為候選基因。【結果】在蘋果第10號染色體27.66—29.05 Mb區域內包含67個基因,其中12個為非編碼RNA(ncRNA),其余為編碼蛋白質的基因。根據RNA-seq分析,柱狀和普通型蘋果基因相對表達差異倍數在1倍以上的有25個基因,其中13個基因在柱狀蘋果中上調表達,12個基因在柱狀蘋果中下調表達。在預測的14個基因中,發現4個基因MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500在柱狀和普通型蘋果的主枝莖尖或側枝莖尖中相對表達存在顯著差異。其中,MD10G1184100和MD10G1185600在兩個柱狀蘋果主枝莖尖中的相對表達量均顯著高于兩個普通型蘋果。MD10G1185400和MD10G1190500在兩個柱狀蘋果側枝莖尖的表達量顯著高于兩個普通型蘋果,而MD10G1184100在兩個柱狀蘋果中的表達量顯著低于普通型蘋果。進一步對這4個候選基因進行不同組織或器官的基因表達特征進行分析,發現基因MD10G1184100在柱狀蘋果根部的表達顯著高于其他部位,MD10G1185400和MD10G1185600在柱狀蘋果的側枝莖尖中顯著高表達,而MD10G1190500在柱狀蘋果的頂芽中顯著高表達。【結論】在柱狀和普通型蘋果莖尖中篩選到4個表達顯著差異的基因,可作為Co候選基因,為該基因的克隆和功能驗證及蘋果樹樹型定向遺傳改良奠定了基礎。

    蘋果U6啟動子的克隆及功能分析
    卞書迅,韓曉蕾,袁高鵬,張利義,田義,張彩霞,叢佩華
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4364-4373.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.016
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    【目的】U6啟動子是CRISPR/Cas9基因組編輯載體系統中驅動sgRNA轉錄的重要元件,其可能存在物種特異性因子,且長度不同轉錄活性存在差異。迄今在蘋果(Malus×domestica)上對U6啟動子尚缺乏研究。因此,篩選出轉錄活性高且片段大小合適的蘋果U6啟動子,可以優化蘋果CRISPR/Cas9基因編輯體系。【方法】利用軟件DNAMAN以及啟動子元件在線分析網站PLACE和plant CARE對蘋果U6啟動子進行比對分析;克隆并構建U6啟動子驅動螢火蟲熒光素酶基因(Firefly luciferase,LUC)的融合表達載體,利用農桿菌介導的瞬時轉化法分別轉染蘋果愈傷組織和本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉片;通過檢測熒光素酶活性對各U6啟動子進行轉錄活性比較。【結果】蘋果基因組中共檢索到6條U6 snRNA(E-value<3e -40),分別位于第6、7、9、10、15和17號染色體上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作為候選U6啟動子。序列比對結果顯示,蘋果U6啟動子與擬南芥相同,均具有兩個保守的元件,包括上游序列元件(Upstream sequence element,USE)和TATA-Like box。瞬時轉化后熒光素酶活性檢測結果顯示,10號染色體上的U6啟動子轉錄活性最高,10號染色體上5′端截短的U6啟動子(長度分別為1 500、959、275和116 bp)中275 bp的啟動子活性最強。另外,在蘋果愈傷組織中,蘋果U6啟動子的轉錄活性要顯著高于擬南芥U6啟動子。【結論】從蘋果基因組克隆6條U6啟動子,并篩選出一條轉錄活性高且片段長度較短的U6啟動子。

    蘋果乙烯響應因子MdERF72對非生物脅迫的響應
    王佳慧,顧凱迪,王楚堃,由春香,胡大剛,郝玉金
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4374-4385.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.017
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    【目的】乙烯響應因子(ethylene response factor,ERF)是植物特有的一類轉錄因子,參與植物根系形成、下胚軸伸長、果實成熟、器官衰老等生長發育過程,在調節植物生物和非生物脅迫反應及果實品質過程中發揮著至關重要的作用。克隆蘋果乙烯響應因子MdERF72,通過表達分析和轉基因功能分析,研究其在抵御非生物脅迫過程中的功能,為探索MdERF72在植物生長發育過程中的功能提供理論依據。【方法】以‘王林’蘋果(Malus×domestica Borkh.)愈傷組織為試材,利用RT-PCR技術克隆MdERF72,利用生物信息學方法分析其編碼氨基酸序列組成、蛋白質理化性質、親緣關系、空間結構等,并利用MEGA5.0構建系統進化樹,與擬南芥ERF-B2亞家族進行蛋白序列同源性分析;利用實時熒光定量PCR技術探明其在蘋果組織中的表達和果實發育時期的時空表達特征;同時利用實時熒光定量PCR技術檢測‘嘎拉’蘋果組培苗中MdERF72對ACC、NaCl以及低溫的響應;構建基因的過表達載體,通過農桿菌介導的遺傳轉化獲得穩定遺傳的過表達蘋果愈傷組織;檢測NaCl以及低溫處理后,野生型和轉基因蘋果愈傷組織的鮮重、丙二醛含量、電導率、過氧化氫含量以及超氧陰離子含量的差異。【結果】MdERF72位于蘋果第13號染色體上,該基因存在1個ERF家族特有的AP2/ERF結構域。進化樹分析結果顯示,MdERF72與擬南芥AtERF72序列同源性較高,都屬于ERFs家族的B2亞家族。氨基酸理化性質分析表明,MdERF72編碼253個氨基酸,預測其蛋白質分子量為27.61 kD,等電點(pI)為5.10。另外,親疏水預測結果顯示MdERF72疏水部分大于親水部分,表明其屬于疏水性蛋白。磷酸化位點分析顯示,MdERF72只有蘇氨酸磷酸化位點,表明該蛋白可能受到磷酸化作用的調控。MdERF72啟動子序列中含有與茉莉酸(JA)、生長素及干旱信號相關的順式作用元件。MdERF72是乙烯正調控轉錄因子,在蘋果的各組織中均有表達,在果實和莖中表達量相對較高;并且在果實中隨著果實的成熟,表達量逐漸升高。蘋果組培苗中MdERF72的表達明顯受到高鹽和低溫的誘導。過量表達MdERF72的蘋果愈傷組織在高鹽和低溫脅迫處理下,生長勢明顯比野生型對照強,電導率,丙二醛、過氧化氫、超氧陰離子的含量都低于野生型,表明MdERF72提高了對鹽和低溫脅迫的抗性。【結論】MdERF72在響應高鹽、低溫脅迫過程中發揮著重要的正調控作用,過表達MdERF72可以提高蘋果愈傷組織對高鹽和低溫脅迫的抗性。

    專題:水禽疫病防控
    加快推進我國水禽疫病防控技術的研究
    劉月煥
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4386-4389.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.018
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    UL56基因下游3513bp對鴨腸炎病毒生物特性的影響
    毛婭卿,張兵,王團結,侯力丹,黃小潔,劉丹,趙俊杰,李啟紅,王樂元,李俊平,楊承槐
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4390-4397.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.019
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    【目的】鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)屬于皰疹病毒,能感染鴨、鵝等雁形目禽類,可引起產蛋下降及高死亡率,已報道了多株DEV的全基因組序列,DEV基因組大,長度約158—162 kb。與疫苗株相比,DEV疫苗檢驗用參考強毒株基因組UL區5′端連續插入3 513 bp(2 716—6 228位核苷酸)導致UL56基因移框突變。目前關于DEV基因功能、致病機理等報道較少。本研究通過構建了重組病毒,以研究連續3 513 bp插入對DEV生物特性的影響;【方法】以提取的DEV基因組DNA為模板,分別擴增UL56基因上下游兩端同源臂UL56-u、UL56-d。將兩同源臂片段克隆到pMD18T-Simple載體,獲得重組質粒pT-UL56ud。將重組質粒pT-UL56ud用MluI酶切,電泳回收去磷酸化后,將紅色熒光蛋白(RFP)表達盒插入到pT-UL56ud中,獲得重組質粒pT-UL56-RFP。DEV接種鴨胚成纖維細胞(DEF)(MOI=0.1),吸附1—2 h后,按Lipofectamine 2000說明書轉染高純質粒pT-UL56-RFP,通過同源重組的方法,以紅色熒光蛋白(RFP)基因為報告基因,構建了缺失DEV UL56下游3 513 bp的重組病毒DEV△3513及其回復株DEVΔ3513(R)。將重組病毒及其親本病毒分別接種25 cm 2的細胞瓶中(MOI=0.01),測量其病毒含量,繪制一步生長曲線;將重組病毒及其親本病毒分別作適當稀釋,接種已長成單層DEF,加入M199營養瓊脂糖覆蓋,培養5—7 d,隨機選取20個蝕斑,測量蝕斑面積;將重組病毒、回復株及其親本病毒分別以10 5.0TCID50肌肉注射6周齡易感麻鴨進行致病性試驗,觀察10 d,每天記錄發病死亡情況。試驗結束后剖檢所有存活鴨。對全部動物取肝臟組織,固定于4%多聚甲醛溶液,按常規程序制備病理切片并進行H.E染色;將重組病毒及鴨瘟商品化活疫苗株(CVCC AV1222)分別以10 3.0TCID50肌肉注射6周齡易感麻鴨進行免疫原性試驗,在免疫后14 d,腿部肌肉注射接種DEV強毒(CVCC AV1221),每只10 3.0MLD。觀察10 d,每天記錄發病死亡情況。【結果】通過同源重組的方法,獲得攜帶RFP的重組病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3 513 bp的重組病毒DEV△3513及其回復株DEVΔ3513(R)。重組病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其親本毒均在接種DEF后72 h,病毒含量達到峰值(10 6.2-6.5TCID50/0.1 mL),病毒含量無明顯差異;均能在DEF細胞中形成清晰蝕斑,大小無明顯差異;DEVΔ3513對6周齡易感麻鴨毒力明顯減弱,未出現任何臨床癥狀和死亡;DEVΔ3513以10 3.0TCID50/只免疫麻鴨,能抵抗DEV強毒株的攻擊;【結論】成功構建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重組病毒,首次證實UL56基因下游3 513 bp對DEV在細胞中的復制是非必需的;缺失UL56基因下游3 513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性;UL56基因下游3 513 bp是DEV的一個毒力決定因子。

    表達H9亞型禽流感病毒HA基因重組鴨腸炎病毒的構建
    孫瑩,張兵,李嶺,黃小潔,侯力丹,劉丹,李啟紅,李俊平,王樂元,李慧姣,楊承槐
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4398-4405.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.020
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    【背景】H9亞型禽流感病毒(AIV)存在宿主范圍擴大、毒力增強的趨勢,并為其他亞型AIV重排提供基因,給養禽業和公共衛生造成極大威脅。水禽不僅是流感病毒的宿主,更是其天然儲存庫,在禽流感病毒的傳播和變異中發揮著重要作用。因此有效控制水禽感染對養禽業健康發展、公共衛生安全具有重要意義。鴨腸炎病毒(DEV)屬于皰疹病毒,能感染鴨、鵝等雁形目禽類,可引起產蛋下降及高死亡率。DEV基因組大,免疫原性好,具有開發成活疫苗載體的潛力。【目的】構建缺失gE基因、表達H9亞型AIV HA基因的重組病毒rDEV-△gE-HA,探討重組病毒rDEV-△gE-HA作為防治DEV-AIV的二聯重組活載體疫苗的可行性。【方法】以H9N2亞型禽流感病毒HA基因作為靶基因,構建含有HA基因表達盒的轉移載體pT-gE-HA,將其與攜帶綠色熒光蛋白標記的重組rDEV-△gE-GFP共轉染CEF細胞后,進行蝕斑篩選、純化表達HA基因的重組病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因測序鑒定重組病毒;在CEF中連續傳代重組病毒20次,測定外源基因傳代穩定性。以10 3 TCID50免疫易感鴨,分析重組病毒rDEV-ΔgE-HA對致死性DEV強毒攻毒保護效果;將不同劑量(10 3-10 6TCID50)rDEV-△gE-HA免疫鴨,免疫后14、21、28 d分別采集血清,測定H9血凝抑制(HI)抗體,并在免疫后28 d,以10 8EID50的劑量靜脈注射H9N2 AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,進行病毒分離試驗。【結果】將構建的轉移質粒載體pT-gE-HA與rDEV-△gE-GFP共轉染CEF細胞,經過3輪蝕斑篩選,獲得純化的重組病毒rDEV-△gE-HA。PCR鑒定及基因測序結果顯示,HA基因成功地插入到DEV基因組中,替換了綠色熒光蛋白。重組病毒在CEF中至少能穩定傳代20代。重組病毒rDEV-ΔgE-HA以10 3 TCID50免疫易感鴨,能抵抗致死性DEV強毒攻擊。重組病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鴨后14 d,各劑量免疫組均能檢測到H9 HI抗體效價;免疫后21日,各組抗體效價水平略有上升,10 3TCID50劑量免疫組HI抗體效價達到1:2 4,而10 4-10 6TCID50劑量免疫組HI抗體效價在1:2 2.4-1:2 3。免疫鴨后28 d,用H9N2 AIV進行攻毒,10 3、10 4、10 6TCID50免疫組均未從喉拭子分離到病毒H9N2,說明能完全保護,阻止喉頭排毒,而10 5TCID50免疫組保護率為80%(4/5),1/5病毒分離陽性。【結論】成功構建了穩定表達H9亞型AIV HA基因的重組DEV,該重組病毒保留了親本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV強毒的攻擊;免疫鴨后能誘導產生AIV HI抗體,盡管HI抗體滴度不高,但至少80%免疫鴨能阻止排毒。該研究為研制DEV-H9亞型AIV二聯重組活載體疫苗奠定了基礎。

    4株鴨坦布蘇病毒的毒力、E基因序列和抗原差異性
    楊志遠,段會娟,王小蕾,劉立新,趙際成,潘潔,劉月煥,林健
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4406-4414.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.021
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    【目的】比較鴨坦布蘇病毒(duck tembusu virus, DTMUV)分離株的毒力、分析E蛋白基因序列、研究抗原差異性,為鴨坦布蘇病防控提供依據。【方法】將DTMUV-HB(2011)、DTMUV-AH(2014)、DTMUV-GX1(2012)、DTMUV-GX2(2015) 4株病毒接種10日齡易感鴨胚進行增殖,并利用6日齡SPF雞胚測定ELD50。根據測定的病毒含量,將分離毒株稀釋為100ELD50/0.5mL,人工感染40只180日齡健康北京鴨,進行臨床癥狀觀察、病毒分離、大體剖檢,分析分離毒株的毒力有無差異。提取8株DTMUV分離病毒株的RNA,通過RT-PCR擴增E基因,分析比較不同地區的DTMUV的E基因核苷酸和氨基酸序列相似性,構建進化樹。利用實驗室建立的鴨坦布蘇病毒血凝抑制試驗分別測定4株病毒陽性血清對4株病毒的HI效價。同時采用固定病毒稀釋血清法,利用C6/36細胞測定4株病毒陽性血清對4株DTMUV的血清中和效價。通過交叉血凝抑制試驗和血清交叉中和試驗比較4株病毒的抗原差異性(R值)。【結果】 (1)各毒株的病毒含量范圍在10 4.7—10 5.3 ELD50/0.1mL。人工感染鴨試驗,攻毒后3 d鴨采食量和產蛋量均顯著下降,各組病毒分離陽性率均在85%以上,剖檢病變主要表現為卵泡變形、出血。(2)分離株序列分析結果表明,核苷酸序列相似性為95.7%—100%,推導氨基酸序列相似性在98.2%以上。遺傳進化分析表明共同構成了一個進化分支。(3)4株病毒及其陽性血清進行血凝抑制交叉試驗,計算的抗原性差異R值在0.79—1.12之間;進行細胞中和交叉試驗,計算的R值在0.79—1.20之間。【結論】分離的4株DTMUV在毒力、E蛋白基因和抗原性上未見顯著差異。

    鴨坦布蘇病毒的血凝性
    王小蕾, 劉月煥, 段會娟, 劉立新, 楊志遠, 趙際成, 潘潔, 劉瑞華, 趙文奇, 田方杰, 呂金寶, 林健
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4415-4422.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.022
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    【目的】研究鴨坦布蘇病毒是否具有血凝性,確定其凝集的紅細胞種類和血凝反應條件。【方法】鴨坦布蘇病毒以不同稀釋度經腦內途徑接種1—3日齡的BALB/c乳鼠,觀察乳鼠發病情況;收集發病乳鼠鼠腦,參照文獻記載的方法用蔗糖-丙酮提純病毒液;以適當滅活劑滅活病毒,觀察滅活后的病毒液性狀,并以6日齡SPF雞胚進行滅活檢驗;參照文獻記載的方法初步測定病毒液與雞、鴨、鵝、鴿、豬紅細胞懸液的反應性;比較并確定鴨坦布蘇病毒進行血凝反應的適宜紅細胞懸液濃度;比較pH6.0—7.0的反應體系對病毒血凝效價的影響;比較4℃、室溫和37℃對病毒血凝反應結果的影響。【結果】乳鼠接種鴨坦布蘇病毒后6日,1﹕10稀釋接種組的乳鼠出現嚴重的臨床癥狀,表現為四肢抽搐,癱瘓等。大部分乳鼠處于瀕死狀態,1﹕50和1﹕100稀釋接種組的乳鼠癥狀稍輕于1﹕10稀釋接種組乳鼠的癥狀;提純后鴨坦布蘇病毒液呈淡紅色澄明液體,用甲醛滅活后病毒液性狀無明顯改變,但用β-丙內酯后產生大量絮狀沉淀,性狀發生明顯改變;病毒液可以凝集雞、鴨、鵝、鴿、豬紅細胞懸液;不同濃度紅細胞懸液的比較結果顯示,病毒液與0.33%的紅細胞懸液作用時凝集圖形清晰穩定;通過不同pH反應體系的比較,發現病毒液在pH 6.0—6.8時均可發生血凝反應,當pH為6.0—6.2時凝集效價最高;通過不同反應溫度的比較,證實病毒液在4℃、室溫和37℃時均具有血凝性,但4℃時的血凝反應時間明顯延長。【結論】乳鼠增殖的鴨坦布蘇病毒提純后具有廣譜的血凝性,可以凝集雞、鴨、鵝、鴿和豬的紅細胞,血凝性穩定,在4℃、室溫和37℃下均可以與鵝紅細胞凝集,以0.33%濃度的紅細胞懸液血凝為宜,反應最適pH為6.0—6.2。

    鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗血清學試驗與免疫攻毒保護試驗的相關性
    王小蕾,林健,楊志遠,劉立新,段會娟,程慧敏,趙際成,潘潔,劉月煥
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4423-4428.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.023
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    【目的】評價鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗2種效力評價方法平行關系,為采用血清學檢驗技術替代鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗本動物攻毒效力檢驗奠定基礎。【方法】3批疫苗實驗室制品分別以0.15、0.3、0.5、1.0 mL經肌肉注射途徑免疫51日齡青年鴨和260日齡產蛋鴨,首次免疫后14 d,按相同的劑量和途徑進行二次免疫。二免后28日采血,分離血清并測定血清的HI抗體效價,根據抗體效價對試驗鴨分組,并分別經肌肉注射途徑接種0.5 mL(100 DID50)的鴨坦布蘇病毒。攻毒后2 d采血,分離病毒,產蛋鴨攻毒后8 d剖檢,觀察卵巢病變。比較和分析HI抗體效價和攻毒保護結果的相關性。【結果】免疫青年鴨HI抗體效價≤1﹕5、1﹕10、1﹕20、1﹕40、1﹕80、1﹕160、1﹕320、1﹕640組保護率分別為50%(20/40)、43.8%(7/16)、74.3%(26/35)、86.7%(26/30)、96.6%(57/59)、92.7%(51/55)、95%(38/40)和100%(11/11),HI抗體效價低于1﹕20時攻毒保護率為48.2%,效價1﹕20時攻毒保護率為74.3%,效價1﹕40及以上時攻毒保護率達93.8%。免疫產蛋鴨HI抗體效價≤1﹕5、1﹕20、1﹕40和1﹕80組保護率分別為66.7%(12/18)、83.3%(10/12)、95.2%(20/21)和100%(15/15);HI抗體效價1﹕10、1﹕160、1﹕320和1﹕640組保護比例分別為2/3、7/7、1/1和2/2;HI抗體效價為1﹕10及以下時攻毒保護率為66.7%,效價1﹕20時攻毒保護率為83.3%,效價1﹕40及以上時攻毒保護率達97.8%。青年鴨和產蛋鴨的HI抗體效價與攻毒保護率之間均有極顯著的正相關性,Spearman相關系數分別為0.905(P<0.01)和0.932(P<0.01)。【結論】鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗(HB株)免疫后HI抗體與攻毒保護率存在正相關,可替代免疫攻毒法用于鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗的效力評價,初步將HI抗體效價1﹕20定為鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗免疫后產生抗體保護的標準。

    鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白原核表達及多克隆抗體制備
    畢可然,李銀,韓凱凱,趙冬敏,劉青濤,劉宇卓,黃欣梅,楊婧
    中國農業科學. 2019, 52(23):  4429-4436.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.024
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    【目的】已有研究獲得鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全長,并且證明其可以抑制鴨坦布蘇病毒復制。因此在通過原核表達和多克隆抗體制備技術獲得帶有GST標簽的鴨寡腺苷酸合成酶樣融合蛋白和該融合蛋白的特異性抗體,為進一步明確鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白抑制病毒復制分子機制提供物質基礎。【方法】根據前期研究已經獲得的鴨OASL基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)序列設計全長擴增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用動物組織總RNA提取試劑盒提取健康櫻桃谷鴨幼鴨脾臟總RNA;通過RT-PCR,利用隨機引物和M-MLV反轉錄酶擴增獲得鴨脾臟cDNA,以cDNA為模板,利用設計合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物進行PCR擴增,擴增后的產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測后將片段大小與目的條帶大小相同的PCR產物切膠純化,純化后的產物克隆到pEASY-T1載體,挑取單克隆菌落送基因公司測序,測序驗證正確的PCR純化產物通過限制性內切酶BamH I和Xho I酶切連接至帶GST標簽的原核表達載體pGEX-4t-1。重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(PLYSS) TM,經終濃度為0.5 mmol·L -1的IPTG誘導表達4 h后檢測該融合蛋白的表達情況。離心收集誘導表達的大腸桿菌菌液,進行超聲波破碎處理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表達。利用GST柱親和純化上清中的可溶性融合蛋白,經20 mmol·L -1Tris-HCL和0.10 mol·L -1NaCL溶液透析后獲取純化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析純化的融合蛋白。采用皮下多點注射方法免疫新西蘭白兔,經3次免疫后制備多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和間接免疫熒光檢測抗體的純度和效價。【結果】克隆測序結果表明,設計合成的鴨OASL基因全長擴增引物pGEX-OAS-F 和 pGEX-OAS-R能夠從櫻桃谷鴨脾臟中獲得鴨OASL基因ORF序列,并且序列組成與前期研究結果一致。被擴增的序列經酶切后,鴨OASL基因能夠與pGEX-4t-1載體成功連接,IPTG誘導后可以在大腸桿菌BL21(PLYSS) TM中表達,表達產物經SDS-PAGE和Western-blotting分析顯示,融合蛋白大小約為84 kD,主要以可溶性蛋白形式表達,在包涵體中也有少量表達。經GST親和層析純化上清中的可溶性鴨OASL融合蛋白,得到0.5 mmol·L -1純度抗原蛋白。經3輪免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,純化后ELISA結果顯示鴨OASL蛋白抗體具有較好的靈敏度,最高效價為1:512 000,SDS-PAGE結果顯示抗體大小為55 kD,與ORF理論值相同,且抗體純度為90%以上。【結論】設計合成的引物能夠成功地獲得鴨脾臟OASL基因ORF序列,該ORF能夠在原核細胞中成功表達,表達的融合蛋白通過免疫新西蘭兔能夠獲得高純度和高效價的鴨OASL多克隆抗體,研究成果為后續深入研究鴨OASL蛋白抑制病毒復制分子機制奠定堅實的物質基礎。

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